Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.
Die Molecular Devices "FlexStation 3 ist ein Tischgerät Multi-Mode Mikroplatten-Reader mit einer automatisierten Fluoreszenz-Messung in Multi-Well-Platten. Es ist ideal für mittel-bis High-Throughput-Screens in einem akademischen Umfeld. Es verfügt über einen integrierten Fluid-Transfer-Modul mit einer Multi-Channel-Pipette und die Maschine liest eine Spalte in einer Zeit, zur Fluoreszenz Veränderungen einer Vielzahl von fluoreszierenden Reagenzien-Monitor ausgestattet. Zum Beispiel hat FlexStation 3 wurde verwendet, um die Funktion der Ca 2 +-permeable Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch die Messung der Veränderungen der intrazellulären freien Ca 2 +-Spiegel zu studieren. Transient receptor potential (TRP)-Kanäle sind eine große Familie von nicht selektiven Kationen-Kanäle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Funktionen. Die meisten der TRP-Kanäle sind Kalzium durchlässig und induzieren Calcium-Einstrom bei Aktivierung. In diesem Video zeigen wir die Anwendung der FlexStation 3, um die pharmakologische Profil der TRPA1 Kanal, einen molekularen Sensor für zahlreiche schädliche Reize zu studieren. HEK293-Zellen transient oder stabil exprimieren menschliches TRPA1 Kanäle, in 96-well-Platten kultiviert, sind mit einem Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4, und Echtzeit-Fluoreszenz-Veränderungen in diesen Zellen geladen werden, vor und während der Anwendung gemessen ein TRPA1 Agonist mit dem FLEX-Modus des FlexStation 3. Die Wirkung eines mutmaßlichen TRPA1 Antagonisten wurde ebenfalls untersucht. Die Daten stammen aus der SoftMax Pro-Software übertragen, um Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen von TRPA1 Aktivatoren und Inhibitoren konstruieren.
Intrazelluläre Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, wie die Freisetzung von Neurotransmittern (3), kardiale Aktionspotential (4), Muskelzelle Kontraktion (5), Zell-Signaltransduktion (6-7), und excitotoxic Zelltod ( 8). Die Messung der intrazellulären Ca 2 +-Spiegel hilft, funktionelle Veränderungen der Ca 2 +-permeable Kanäle in der Plasmamembran oder intrazellulären Organellen und der Beitrag der Aufklärung
Ca 2 +…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris und Olga Tschumakowa für ihre Unterstützung. Die FlexStation 3-System ist Teil des UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Wir danken auch Drs. Ardem Patapoutian und Michael Bandell vom Scripps Research Institute und Genomics Institute der Novartis Research Foundation (GNF) für die Bereitstellung der HEK293-hTRPA1 stabile Zelllinie. Die Forschung wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (GM081658 zu MXZ) und Texas Medical Center Digestive Diseases Center (HH) und Mission Connect / TIRR Foundation (HH) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
96-Well Plates | Greiner Bio-one | 655090 | |
96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
Poly-L-ornithine | Sigma | P36551 | |
probenecid | Sigma | P8761 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 |