Summary
Bu video FlexStation 3 kullanarak insan TRPA1 kanalları farmakolojik profili çalışmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Protokol hücre hazırlama, boya yükleme ve mikroplaka okuyucu, FlexStation 3 operasyon detayları kapsar.
Abstract
Moleküler Aygıtlar FlexStation 3, çok iyi plakaları otomatik floresan ölçüm yeteneğine bir masa üstü multi-mode mikroplaka okuyucu. Akademik ayarları orta-yüksek verimli ekranlar için idealdir. Bu bir multi-kanal pipetter ve makinenin bir defada bir çok floresan reaktiflerin floresan değişiklikleri izlemek için bir sütun okur ile donatılmış entegre bir sıvı aktarım modülü vardır. Örneğin, FlexStation 3 Ca 2 + geçirgen iyon kanalları ve G-protein reseptörler hücre içi serbest Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri ölçerek işlevini incelemek için kullanılmıştır. Geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynamaktadır seçici olmayan katyon kanalları büyük bir aileyiz. TRP kanalları çoğu kalsiyum geçirgen ve etkinleştirme sırasında kalsiyum akını neden. Bu video, TRPA1 kanal, çok sayıda Ağrılı uyaranlara için bir moleküler sensör farmakolojik profil çalışma FlexStation 3 uygulama göstermektedir. Geçici ya da stabil bir şekilde 96-kuyucuğu yetişen insan TRPA1 kanal, ifade HEK293 hücreleri floresan boya + duyarlı Ca 2, Fluo-4, ve bu hücrelerin gerçek zamanlı floresan değişiklikler ile yüklenen uygulama öncesi ve sırasında ölçülen FlexStation 3 FLEX modunu kullanarak bir TRPA1 agonist. Varsayılan TRPA1 antagonisti etkisi de incelenmiştir. Veri SoftMax Pro yazılımı TRPA1 aktivatörleri ve inhibitörleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri oluşturmak için transfer edilir.
Protocol
1. 96-kuyucuğu Hücre hazırlıkları
CDNA insan TRPA1 geçici trasfected HEK293 hücreleri için
- HEK293 hücrelerin% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (Invitrogen, 16.000-044) ile desteklenmiş 4.5 mg / ml glikoz (Thermo Scientific, SH3002201) içeren Dulbecco'nun Minimal Essential Orta 1-2 gün (DMEM), 50 adet için yetiştirilen / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin (Invitrogen, 15.140-163). Transfeksiyon gününde, hücre yoğunluğu% 70-90 ulaştırılması gerekmektedir.
- Iyi 50 ul poli-L-ornitin (Sigma P3655, steril distile su içinde 20 mg / ml) ve 37 kuluçka ° C, en az 15 dakika boyunca pipetleme Coat 96-kuyucuğu. Dulbecco'nun Fosfat her biri de bir kez durulayın Mg 2 olmadan Tamponlu Salin (DPBS) + ve Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Plaka, birkaç saat için hücre kültürü kaputu sol olabilir.
- 96 plaka her kuyu için, 1.5 ml Eppendorf tüp 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31.985-070) 0.2 mg cDNA seyreltin. Aynı cDNA transfekte kuyu sayısına göre orantılı olarak büyütmek. Ayrıca 25 ul OPTI-MEM transfekte olmak için her sıra ayrı bir 1.5 ml Eppendorf tüp 0.4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668-019) sulandırmak. Transfekte için kuyu toplam sayısına göre bu kadar Ölçeği.
- Kısaca vorteks seyreltilmiş cDNA ve Lipofectamine 2000 ve bunları yaklaşık 5 dakika oda sıcaklığında bekletin.
- Eşit hacimde sulandırılmış Lipofectamine 2000 seyreltilmiş cDNA, girdap içeren tüp transferi ve karışımı 15 dakika ila 2 saat oda sıcaklığında bekletin. Bu süre zarfında, 49 ul / poli-L-ornitin kaplı plaka Lipofectamine / cDNA 2000 karışımı aktarın.
- HEK293 hücreleri (Adım 1.1) Trypsinize, bir hemasitometre veya Kontes otomatik hücre sayıcı (Invitrogen, C10227) kullanarak hücre yoğunluğu sayımı, ve 15 ml steril bir hücre istenilen miktarda transfer (genellikle yaklaşık ~ 125,000-150,000 hücre / kuyu) alt konik santrifüj tüpüne. 5 dakika için 1000 x RPM santrifüjleyin. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye DMEM kültür ortamı ~ 1,250,00-1,500,000 hücre / ml, ancak antibiyotik olmadan yeniden süspanse hücre.
- Bir çok kanallı pipetter veya MicroFill Mikroplaka Dispenseri (Bio-Tek) kullanarak 2000 cDNA-Lipofectamine karışımı içeren her bir kuyunun 98 ul hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. Için 37 ° C,% 5 CO 2 ile 20-44 saat inkübe edin .
Stably TRPA1 ifade HEK293 hücreleri için
- Adım 1.2 kat 96-kuyucuğu izleyin.
- Cömertçe indüklenebilir HEK293-hTRPA1 hücre hattı (Invitrogen, Dr. A. Patapoutian (Scripps Araştırma Enstitüsü) tarafından sağlanan ve yabani tip HEK293 hücreleri (Adım 1.1) olarak aynı ortamda muhafaza ancak 5 mg / ml blasticidin ile desteklenmiş A1113902) ve 50 mg / ml hygromycin B (Invitrogen, 10.687.010). Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90 ulaştığında, hücreler trypsinize hücre yoğunluğu saymak ve 5 dakika boyunca 1000 x RPM hücreler istenilen miktarda santrifüj. ~ 1.000.000 hücre / ml yoğunlukta doksisiklin (Fisher, BP26535, 0.25 mg / ml) ile takviye aynı kültür ortamında süspanse edin hücreleri.
- Ul / iyi, çok kanallı pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak 100 poli-L-ornitin kaplı plakalar hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 - 16 24 saat.
2. Çözümler
- Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS), ekstrasellüler çözüm olarak kullanılır. (MM) içerir: 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44
KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 pH 1N NaOH ile 7.4 'e ayarlanır MgCl 2, 10 glikoz, 10 Hepes,). - Fluo-4 tahlil tampon HBSS içinde probenesid 2 mM içerir. 0,5 N NaOH 250 mM stok probenesid (Sigma, P8761) olun. HBSS için 1:125 bir oranında seyreltilir. 1 N HCl ile pH 7.4 yeniden ayarlayınız.
3. Hücre yükleme Fluo-4 AM
- 1 mM stok solüsyonu 912 ul susuz DMSO 1 mg Fluo 04:00 (Invitrogen, F14202) eritin. Fluo-4 en az bir ay için stok çözelti -20 ° C'de saklanabilir AM.
- 10 ul 1 mM karıştırın Fluo-4 10 ul Pluronic sonra F-127 (Invitrogen, P3000MP, DMSO içinde% 20 (w / v) solüsyonu) ve 5 ml Fluo-4 tahlil tamponu (Adım 2.2) tüm içeriği transfer ile AM (Sigma, A9418),% 0,1 Bovine serum albümin ile desteklenmiştir.
- Mikroplak yıkayıcı (Bio-Tek gelen ELx405TM gibi) kullanarak 80 ul / 2 kez HBSS (Adım 1.7 veya 1.10) 96-kuyucuğu yetiştirilen hücreler yıkayın.
- Fluo-4 Ul / çok kanallı bir pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak ve 37 plaka inkübe 50 (Adım 3.2) çözümü yükleme PM ° C 1 saat.
- ELx405TM mikroplak yıkayıcı kullanarak Fluo-4 tahlil tampon (Adım 2.2.) Hücreleri 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyunun Fluo-4 tahlil tampon 80 ul bırakın.
4. Bileşik plaka hazırlanması
- 1 saat hücre yükleme dönemde, 3x Fluo-4 tahlil tampon istenilen son konsantrasyonlarının agonistleri (veya antagonistleri) 3x dilüsyonları bir dizi hazırlamak.
- 96-iyi bir bileşik plaka seyreltilmiş bileşik çözümler Pipet 250-300 ul. FlexStation 3, bir defada tek bir sütun okur çünkü mümkün olduğunda bileşik plaka aynı sütun ve ilgili pozitif ve negatif kontroller bir bileşik seri dilüsyonları ettirmelisiniz.
5. Plaka okuma FlexStation 3
- (FlexStation 3, bilgisayar ve SoftMax Pro 5.2 yazılım) sistemi açın
- Deney yeni bir dosya adı ile kaydedin. Set-up, ESNEK modunu seçin ve aşağıdaki değerleri girin:
Protokol # 1, agonist etkisi 
Protokol # 2, antagonist etkisi 
- Yeni bir uç kutusu, bileşik plakası ve plaka okuma, 3 FlexStation uygun tepsilere yerleştirin ve "oku" butonuna tıklayın. FlexStation 3 Bir kerede bir sütun okumak ve önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikler okuma kesmeden katacak. Bir sütun ve makine adım 5.2 'de kullanıcı tarafından programlanan tüm sütunlar okunur kadar yapılan bileşik eklemelerle sonraki sütun okumak için devam edecektir okuma bitirmek için yaklaşık 3 dakika (Protokol # 2 için 5 dakika) sürer.
6. Veri analizi
- Deneysel veriler SoftMax Pro 5.2 yazılımını kullanarak doğrudan veya kopyalanan ve Microsoft Excel gibi herhangi bir elektronik tablo programı içine yapıştırılan işlenebilir. TRPA1 agonist flufenamic asidi (FFA) konsantrasyon-yanıt eğrisi aşağıdaki en küçük kareler uydurma rutin kullanarak inşa edilmiştir.
Y gözlenen tepki olduğu, Y max normalize edilmiş maksimum tepki, C, ilgili ilaç konsantrasyonu, EC 50, yarı-maksimum bir tepki uyarılmış konsantrasyon ve n H görünürdeki Hill katsayısı. Varsayılan TRPA1 antagonisti bileşik Konsantrasyon-inhibisyon eğrisi FFA (100 mcM) sabit bir konsantrasyonu ve kademeli olarak aşağıdaki uyan en küçük kareler ile hesaplanan bileşik bileşik IC 50 değeri A. konsantrasyonu arttırarak elde edilir denklemi. 
, Burada gözlenen yanıt Y ve Y maksimum pik yanıt normalize [Ant] karşılık gelen bileşik A toplama, IC 50 FFA-uyarılmış yanıt yarı-maksimum inhibisyonu üreten antagonist konsantrasyonu ve n H görünürdeki Tepesi katsayısı.
Y gözlenen tepki olduğu, Y max normalize edilmiş maksimum tepki, C, ilgili ilaç konsantrasyonu, EC 50, yarı-maksimum bir tepki uyarılmış konsantrasyon ve n H görünürdeki Hill katsayısı. Varsayılan TRPA1 antagonisti bileşik Konsantrasyon-inhibisyon eğrisi FFA (100 mcM) sabit bir konsantrasyonu ve kademeli olarak aşağıdaki uyan en küçük kareler ile hesaplanan bileşik bileşik IC 50 değeri A. konsantrasyonu arttırarak elde edilir denklemi. 
, Burada gözlenen yanıt Y ve Y maksimum pik yanıt normalize [Ant] karşılık gelen bileşik A toplama, IC 50 FFA-uyarılmış yanıt yarı-maksimum inhibisyonu üreten antagonist konsantrasyonu ve n H görünürdeki Tepesi katsayısı. 7. Temsilcisi Sonuçlar:
TRPA1 + duyarlı boya Ca 2, Fluo-4 (1-2) ile tespit edilebilir kalsiyum akınına yol açar aktivasyonu Ca 2 +-geçirgen katyon kanal,. HEK293-hTRPA1 istikrarlı bir hücre hattı TRPA1 agonistleri ve antagonistleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri incelemek için kullanılmıştır. Hücreler, Fluo-04:00 yüklenen 80 ul tahlil tampon yerleştirilir ve FlexStation 3 kullanılarak okunabilir. 30 s için temel floresan kaydettikten sonra, bir seri seyreltme TRPA1 agonist, FFA 40 ul, her istenilen nihai konsantrasyonu 3x akışkansal modülünün bir parçası olarak dahil bir multi-kanal pipetter aracılığıyla hücrelere ilave edildi FlexStation 3. Floresan değişiklikler ek bir 180 s. monitörize edildi Sırasıyla F ve F 0 faiz ve okuma başında zaman floresan değerlerdir - (F 0 F), her bir kuyu için göreceli Fluo-4 floresan değişiklikleri mesafe kadar taşınmış = ifade edildi. FFA konsantrasyonlarının bir dizi yanıt floresan değişikliklere zamanlı kurslar Temsilcisi izleri Şekil. 1. Maksimal yanıt düzeyleri benzer olmasına rağmen, alt FFA konsantrasyonlarda daha yüksek aktivasyon kinetiği açıkça daha hızlıdır, son dört FFA konsantrasyonları için dikkat edin. Bu nedenle, bu farklılıkları ayırt etmek için, konsantrasyon-yanıt ilişkisi üzerine ilk floresan artış oranları (eğim) FFA değişik konsantrasyonlarda (Şekil 2) ek ölçüm tarafından inşa edilmiştir. Yarım maksimal etkisiFFA ive konsantrasyonu (EC 50) 55.4 mcM (n = 3) olarak tespit edilmiştir. Varsayılan TRPA1 antagonisti test etmek için, bir bileşik, protokol # 2 (Adım 2) kullanarak benzer bir deney gerçekleştirdi. Bu durumda, bir dizi antagonisti dilüsyonlarının 30 s (3x istenilen son konsantrasyonlarının 40 ul) ilave edildi ve FFA (100 mcM son bir konsantrasyon için 300 mcM 60 ul) sonra 180 ler eklendi. Bileşik bir doz-yanıt bağımlı 4.3 mcM yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC 50) (n = 3) (Şekil 2) ile FFA TRPA1 hücreleri azalır.
FFA insan TRPA1 Şekil 1. Konsantrasyon bağımlı aktivasyonu. İzler zamanla floresan FFA-uyarılmış artış (sadece ilk 60 s tepkiler FFA-uyarılmış yanıtlar hızlı kinetiği daha iyi göstermek için gösterilmiştir). Yüksek konsantrasyonlarda FFA ile floresan artış uyarılmış olduğunu lütfen unutmayınız çok düşük konsantrasyonlarda daha hızlı kinetik, zirve floresan seviyeleri benzer olmasına rağmen.
Şekil 2 Konsantrasyon - FFA indüklenen floresan değişim ve bileşik stably HEK293 hücrelerinde ifade insan TRPA1 FFA yanıtı indüklediği inhibisyonu için tepki ilişkileri. Δ, konsantrasyon - FFA yanıt ilişkisi üzerine ilk normalize floresan artış oranları (eğim) FFA konsantrasyonları değişen ek ölçerek tespit edildi. O, varsayılan TRPA1 antagonisti FFA-uyarılmış kalsiyum yanıt inhibisyonu Konsantrasyon-yanıt ilişkisi, bileşik A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre içi Ca 2 +, nörotransmitter sürüm (3), kardiyak aksiyon potansiyeli (4), kas hücresi kasılma (5), hücre sinyal iletimi (6-7) ve eksitotoksik hücre ölümü (gibi pek çok fizyolojik ve patolojik koşullar, önemli bir rol oynar 8). Hücre içi Ca 2 + seviyeleri ölçümü fonksiyonel değişiklikler ve Ca 2 + geçirgen kanallar plazma zarı ya da hücre içi organelleri katkısı aydınlatmak için yardımcı olur
Ca 2 + yukarıdaki süreçleri (9-13). Tahlil de, birçoğu, G-protein reseptörler işlevini araştırmak Etkinleştirme üzerine, Ca 2 + + depolar, hücre içi Ca 2 serbest ya da diğer Ca 2 aktive hücre içi serbest Ca 2 + konsantrasyonlarının artmasına neden olabilir + geçirgen iyon kanalları (14-16). FlexStation 3 hücre içi Ca 2 + konsantrasyonunun artması ile, Ca 2 +, artan floresan veya oranlı metrik değişiklikleri doğuran hassas boyalar, yapar . Bu video makale, Ca 2 + geçirgen TRPA1 kanal heterologously HEK293 hücreleri ifade çalışmada FlexStation 3 uygulama göstermektedir . Dağıtım pipetters anahtarlama (- veya 16-kanal 8) veya 384-plaka biçiminde gösteri için 96-iyi plakalar kullanılır olmasına rağmen, kullanıcıların 96 den kolayca seçebilirsiniz. Bu testte, agonistleri ve / veya antagonistleri yüksek kapasiteli tarama yeteneği hızlı bir ortam sağlar ve diğer birçok Ca 2 +-geçirgen iyon kanalları için geçerli . Ancak, hücre içi kalsiyum testi iyon kanalı faaliyetlerinin dolaylı bir ölçüm olduğunu belirtmek gerekir. Ayrıntılı takip yama kelepçe kayıtları kullanarak doğrudan hücre zarından akan iyonik akımı ölçmek için çalışmalar hala uygun sonuçlar çıkarmaya ihtiyaç vardır.
Güvenilir bir veri kalitesi elde etmek için, aşağıdaki önlemler alınmalıdır:
- HEK293 hücreleri, kaplama gibi gevşek yapışık hücreler plakaları esastır. Ancak, Çin Hamsteri Yumurtalık (CHO) hücreleri veya Hela hücreleri gibi güçlü yapışık hücreler, kaplama gerekli değildir.
- Hücrelerin eşit miktarda confluency testinin zamanda% 90-100 arasında olmalıdır çok iyi plaka ve her kuyuda hücre yoğunluğu her kuyuda numaralı seribaşı olduğu önemlidir.
- Hücreler yavaşça sıvı dağıtmak ve hücreleri yükleme ve yıkarken hücreler rahatsız etmemek.
- Probenesid, boya sızıntısını önlemek için eklenir. Tahlil tampon probenesid şunlardır deneylerde elde edilen verilerin yorumlanması, probenesid ayrıca bazı iyon kanalları etkisi beri Ancak, dikkatli alınması gerekmektedir.
- Bileşik konsantrasyonları bileşik plakasını belirlemek için, her bir kuyunun, önce numune plaka ilgili iyi ve bileşik eklenmesinden sonra tampon hacmine göre seyreltme faktörü göz önünde bulundurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris ve verdikleri destek için Olga Chumakova. FlexStation 3 sisteminin UTHSC Cytodynamic Görüntüleme Tesis bir parçası. Ayrıca Dr teşekkür. Scripps Araştırma Enstitüsü ve HEK293-hTRPA1 istikrarlı hücre hattı sağlamak için Novartis Araştırma Vakfı (GNF) Genomik Enstitüsü Ardem Patapoutian ve Michael Bandell. Araştırma NIH (MXZ için GM081658) ve Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi (HH) ve Mission Bağlan / TIRR Vakfı (HH) hibe kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
