Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Summary

Protocol

NIH3T3-Zellen der Zubereitung:

A. Zellen für Ejection

1. Trypsinize Zellen, dann verdünnt 1:1 mit Zell-Medien und Übertragung von einem T75 Kolben in ein 15 ml Falcon-Röhrchen
2. Spin down-Zellen zu einem Pellet durch Zentrifugation, Absaugen des Überstandes und waschen Sie die Zellen mit DPBS
3. Spin down-Zellen zu einem Pellet erneut, und saugen Überstand
4. Die Zellen in den Medien
5. Bestimmen Sie die Zelldichte mit Zählkammer (~ 200 X 10 ⁴ Zellen / ml pro Flasche T75)
6. Zentrifugenzelle Lösung absaugen Überstand und resuspendieren in entsprechender Höhe von Medien für unterschiedliche Zell-Konzentrationen

B. Zell-Ausstoß

1. Vortex-Zellen, bevor Sie zum Auswerfen
2. Transfer-200 ul der Zell-Lösung in die Spritze
3. Festlegen geeigneter Modus Impulsgeber
   1. Zum Auswerfen einzelner Tropfen und mehrere Tröpfchen (Bursts), setzen Impulsgeber zu "E. BUR"-Modus
   2. Für die kontinuierliche Tröpfchenausstoß setzen Impulsgeber auf "NORM"-Modus
4. Ändern Signal-Einstellungen
   1. Set hohen und niedrigen Ausgangsspannung: HIL bis 5 V und LOL auf 0 V und sicherstellen, dass die "LIM" LED ist an
   2. Set-Signal als Rechteckimpuls
   3. Ändern Sie die Höhe der Zeit das Magnetventil ist offen für Tröpfchenausstoß indem Sie den Wert für "WID" oder Ändern Einschaltdauer ("Pflicht")
   4. Ändern Sie die Frequenz eines Rückschlags indem Sie den Wert für "PRO"
   5. Ändern Sie die Anzahl der Tropfen in einem Ausbruch, indem der Wert für "BUR" ausgeworfen
5. Eject Zelle Lösung auf den vorbereiteten Untergrund für die Bildgebung mit Mikroskop

C. Färbung

1. Make up Farbstofflösung mit 0,5 ul Calcein-AM und 2 ul Ethidium Homodimer pro ml DPBS
2. Tauchen vorbereiteten Untergrund in Farbstofflösung
3. Lassen Sie Probe für 10 Minuten bei 37 ° C inkubieren, bevor Bildgebung

Experiment Validation

1. Auf einem Nikon Eclipse TE-2000 U Fluoreszenzmikroskop
   1. Spot fortschrittliche Software (Diagnostics, Inc.)
   2. Live / Dead Assay

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent Microscope		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Solenoid valve cell ejector				Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current
5-Gallon Portable air tank		Coleman	Powermate CT5	Pressurized air: 30 PSI
Pressure regulators		Marsh Bellofram
Pulse Generator			HP8112A	Actuation frequency generation: 50 MHz
XYZ-stage		Newmark Systems		With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution
NIH 3T3	Cell-line			fibroblasts
Trypsin				0.05% solution
NIH 3T3 cell medium
DPBS	Buffer
T75				Tissue culture flasks
Plastic conical tubes				15 ml, for tissue culture