Summary
שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.
Abstract
Metabolomics הסביבה היא תחום המתפתח כי הוא מקדם הבנה חדשה כיצד אורגניזמים להגיב ולתקשר עם הסביבה ועל זה ברמה הביוכימית 1. ספקטרוסקופיה מגנטית גרעינית (NMR) תהודה היא אחת מספר טכנולוגיות, כולל כרומטוגרפיה המוני גז ספקטרומטריית (GC-MS), עם הבטחה רבה מחקרים כאלה. היתרונות של התמ"ג הם כי הוא מתאים ניתוחים לא ממוקדים, מספק מידע מבניים ספקטרה ניתן שאילתה באופנים כמותיים וסטטיסטיים מול מסדי נתונים זמינים לאחרונה של ספקטרום המטבוליט הפרט 2,3. בנוסף, נתוני תמ"ג ספקטרליות ניתן לשלב עם נתונים אחרים (רמות omics transcriptomics למשל הגנומיקה) כדי לספק הבנה מקיפה יותר של התגובות הפיזיולוגיות של מינים זה לזה ולסביבה 4,5,6. עם זאת, התמ"ג הוא רגיש פחות טכניקות metabolomic אחרים, ולכן קשה APרובדי חיידקים למערכות הטבעיות שבה אוכלוסיות המדגם ניתן בריכוזים נמוכים, צפיפות המטבוליט נמוכה בהשוואה מטבוליטים של מוגדרים היטב ובנפש חפצה מקורות שניתן להפיק כגון רקמות, biofluids שלמים או תאים תרבויות. כתוצאה מכך, המחקרים המעטים ישיר metabolomic הסביבתיות של חיידקים שבוצעו עד כה היה מוגבל צפיפות גבוהה מערכות אקולוגיות התרבות מבוססות או להגדיר בקלות כמו מארח הסימביונט מערכות, שנבנו שיתוף תרבויות או מניפולציות של הסביבה שבה המעיים תיוג איזוטופ יציב יכול להיות בנוסף משמש כדי לשפר את אותות תמ"ג 7,8,9,10,11,12. שיטות להקל על ריכוז ואיסוף של מטבוליטים סביבתיים בריכוזים מתאימים NMR חסרים. מאז תשומת לב לאחרונה ניתנה על metabolomics הסביבתיות של אורגניזמים בתוך הסביבה המימית, שם הרבה זרימת האנרגיה והחומר מתווך על ידי הקהילה planktonic 13,14, פיתחנו שיטה הריכוזtion והפקת כולו הקהילה מטבוליטים של מערכות חיידקים planktonic על ידי סינון. זמינים מסחרית הידרופילי פולי-1 ,1-difluoroethene (PVDF) מסננים מטופלים במיוחד כדי להסיר לחלוטין extractables, אשר יכול אחרת המופיעים מזהמים ניתוחים שלאחר מכן. מסננים אלה שטופלו משמשות לאחר מכן כדי לסנן דגימות סביבתיות או ניסיוני של עניין. מסננים המכילים את החומר מדגם רטוב הם lyophilized ו מימית מסיסים מטבוליטים מופקים ישירות ספקטרוסקופית NMR קונבנציונאלי באמצעות אשלגן זרחתי מיצוי מתוקנן חיץ 2. הנתונים המופקים בשיטות אלו ניתן לנתח סטטיסטית לזהות תבניות בעלות משמעות, או משולב עם רמות omics אחרים הבנה מקיפה של הקהילה ותפקוד המערכת האקולוגית.
Protocol
1. הכנה מסנן להסיר extractables
- השתמש 25 מ"מ בקוטר 0.22 מיקרומטר נקבוביות בגודל Durapore מסננים PVDF הידרופילי (Millipore). מקום מסננים כוס נקי 500 מ"ל פיירקס באמצעות פינצטה. לפני שלוש פעמים לשטוף עם מים מזוקקים. מערבולת גם לך לשטוף את המסננים כדי למנוע יידבקו זה לזה. הוספת 300 מ"ל מילי-Q (Millipore) או מים שווה ערך באיכות גבוהה. החיטוי כדי להקל על הסרה מלאה של extractables מן המסננים.
- יוצקים את מילי-Q ושוב טריפל לשטוף את המסננים, הפעם עם מילי-Q. שימוש במסננים פינצטה מקום בודדים על משטח יבש ונקי (כגון אלומיניום) ויבש גם בטמפרטורה סבירה (למשל 37 ° C) או אוויר יבש. המסננים נמצאים כעת מוכן לשימוש.
2. סינון של חומר דגימה
- עבור הוכחת בפרוטוקול זה, נירוסטה Millipore 3 במקום סעפת פילטר עם 25 מ"מ עמודות microanalysis מסנן עם זכוכית תומךומשאבה מכנית משמשים. באמצעות טכניקה האספטי, הנח מסנן אחד 25 מ"מ על בסיס טור מסנן, החל את העמודה לצבוט יחד.
- טען 15 מ"ל של דגימה לעמודה, פתח את שסתום עצירה על סעפת פילטר, והפעל את המשאבה. סנן תחת לחץ מתון כדי למזער שבירה תא (<5 kPa). משאבות אחרות, כגון יד או משאבת peristaltic יכול להיות מותאם פרוטוקול זה. לקבלת דוגמיות צפיפות נמוכה יותר, תוספות רצופים של מים עשוי להיות נחוץ, אל תיתן מסנן ללכת יבש במשך תקופה ארוכה של זמן בין תוספת של מים.
- לקבלת דוגמיות ימיים, לאחר שהחלת סינון לדוגמה, תוכל לבצע שטיפה במים מתוקים לא חובה להפחית יונים פאראמגנטיים שיורית במדגם שלך על המסנן. זה עשוי לעזור עם כוונון מדויק יותר של המגנט ספקטרומטר. פשוט בעדינות להוסיף נפח קטן של מים ולסנן דרך המדגם נאספו שלך בסוף.
- לאחר סינון נגמר, כבה את המשאבה, ולהשאיר אופ שסתוםn כך שאין עדיין תחת לחץ שלילי המסנן. הסר את תפס ועמודה הסינון.
- עם יד אחת, להשתמש בפינצטה נקיים לאחוז המסנן. מקפלים את המסנן על עצמו, אבל לא קמט. עם היד השנייה להשתמש השפה של הצינור 2-מ"ל סטרילי microcentrifuge להחזיק את המסנן. לשחרר את פינצטה ואז להשתמש בהם כדי לתפוס מחדש את שני הקצוות של המסנן. Regrip על 45 ° זווית לקיפול.
- מניחים את המסנן לתוך צינור 2-ml ושחרור כך נפתח בצד מדגם מול פנימה. ניתן למקם עד שני מסננים לתוך צינור מ"ל סטרילי 2 microcentrifuge כך. אם באמצעות שני מסננים, להבטיח חפיפה מועטה ככל האפשר. מיד להקפיא (לפחות -30 ° C).
3. הפקת מימית מסיסים מטבוליטים
- Lyophilize דגימות שלך לילה או לפחות 10 שעות.
- לאחר lyophilization, להוסיף מגרסה נירוסטה לצינור זה (Tokken). הוסף 750 μl אשלגן סטנדרטיתפוספט חיץ התמ"ג ב תחמוצת דאוטריום (2 H> 90%) עם 2.2-דימתיל-2-silapentane-5-sulfonate (DSS) סטנדרטי (KPI, 38.3 mM KH 2 PO 4, 61.7 mM K 2 HPO 4, DSS 0.1 מ"מ, pH 7.0, 90% D 2 O) 2.
- Sonicate דגימות במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס sonicator מים (Bioruptor, Diagenode) להסיר את החומר לתא מן המסנן. הסר את המסננים עם פינצטה נקיים.
- לשבש את התאים באמצעות מגרסה הטחנה (1600 סל"ד) במשך 5 דקות.
- דגירה על 65 מעלות צלזיוס עם רעד (1400 סל"ד) על הספסל העליון שאכר (Eppendorf) במשך 15 דקות.
- הסר את החזיר מתכת עם פינצטה נקיים, צנטריפוגות מדגם של 13,000 גרם במשך 5 דקות.
- צייר את supernatant ישירות צינור NMR עבור NMR ספקטרוסקופיה.
4. NMR ספקטרוסקופיה וניתוח נתונים
- טען המדגם שלך ספקטרומטר התמ"ג (כאן, DRX-500 Bruker ספקטרומטר מצוידTXI בדיקה משולשת עם שיפוע ציר נשלט על ידי המחשב פועל XWIN-NMR).
- קבל 1 1D H ספקטרום NMR בשיטות שפורסמו בעבר המתאימים 2,15 מממשק XWIN-NMR. במחקר הנוכחי 1 H NMR ספקטרה נרשמו על ההפעלה DRX-500 MHz ספקטרומטר ב 500.03 ב אותות 298 ק מים שנשארו דוכאו על ידי רצף הדופק ווטרגייט, עם הזמן חזרה על 1.2 s. 128 הארעיים נאספו להשיג 32,000 נקודות נתונים בכל הספקטרום.
- להעביר את נתוני תמ"ג מדריכים למחשב התקנת תוכנה NMRPipe 16. לעבד את הנתונים גלם DSS כמפורט 0 התייחסות עמודים לדקה באופן ידני בשלב ספקטרה. לספרת את הנתונים רפאים לתוך מערכת של ערכים בדידים על ידי שילוב או "binning" אותם עם תוכנה כגון rNMR, Automics, או באמצעות חבילת FT2B זמין לציבור באתר האינטרנט של ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. במאות ההוא למשל, ספקטרה שולבו בין ppm 0.5 ו 10.5 על 0.032 אזורים בלתי נפרד עמודים לדקה באמצעות ECOMICS ו לנורמליזציה לאחת DSS או עוצמת האות מוחלט. נתוני הפלט כעת ניתן להשתמש לניתוח סטטיסטי במורד כגון ניתוח מרכיבים עיקריים (PCA), תוך שימוש בחבילות תוכנה חופשית כמו R 18.
5. נציג תוצאות
דוגמה 1 ספקטרום NMR H המתקבל באמצעות השיטות הנ"ל מוצגים באיור 1. דוגמאות אלה, משתי נקודות זמן הניסוי מיקרוקוסמוס מראים הבדלים ברורים בשל פעילות מטבולית אצות. קשת יום 4 מציג שפע רב של פסגות, במיוחד בטווח 3-4 עמודים לדקה לעומת המדגם 1 יום. פסגות אלה ניתן לייחס סוכרים המיוצר על ידי פורח הצורניות בתוך המיקרוקוסמוס. בניסוי דומה להשוות את הצמיחה של טבע הקהילות הפלנקטון במי ים מלאכותיים או טבעיים, שיטות סטטיסטיות שלuch כמו העלילה העיקרי ניתוח מרכיבים ציון (PCA) נגזר ספקטרום NMR זרקת לפח ניתן להשתמש כדי להראות הבדלים מטבוליים ברורים בין שני הטיפולים (איור 2), ואילו מגרשים טעינת ניתן לזהות פסגות בתוך הספקטרום כי צורת ההפצה של הנתונים . תוצאות אלה ניתן להשוות את נתוני רמות omics אחרות, כגון טביעות אצבעות משיטות גנומית (איור 3). פסגות אלה תמ"ג ניתן שאילתה בנפרד (למשל על BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, או כל ספקטרום ניתן לנתח סטטיסטית (למשל עם SpinAssign ב http://prime.psc.riken. jp /? פעולה = nmr_search ) 2. בדוגמה זו, ההבדלים בין הטיפולים היו בשל שפע של פסגות באזור סוכרים (3.39 ppm ל 4.04 ppm) של ספקטרום מן הטבע מטבוליטים פלנקטון הקהילה, ואת פסגות כמה אופייני לקהילות מי ים מלאכותיים היו בהיסוס IDEntified כמו חומצת חלב ו formate באמצעות SpinAssign.
באיור 1. נציג 1 H ספקטרום NMR המתקבל דגימות מעובד באמצעות הליך זה. דגימות נלקחו לפני מיקרוקוסמוס (יום 1) ובמהלך בלום (יום 4) diatom אינטנסיבי. הניסויים בוצעו על תמ"ג Bruker DRX-500 עם אותות מנורמל לגובה שיא פנימי סטנדרטי (DSS: 0 ppm).
איור 2. ניתוח מרכיבים ראשיים (PCA) ציון על העלילה של ספקטרום NMR זרקת לפח מ metabolomes של טבעי המופק planktonic קהילות חיידקים הגדלים מיקרוקוסמוס עם טבעי (ללא יהלומים) פתוחים או מי ים מלאכותיים (עיגולים שחורים). הבדלים מטבוליים ברורים ניתן לצפות scatterplot. העלילה טוען מניתוח כזה יכול לשמש כדי לזהות שיאים שונים של חשיבותהמערכת; פסגות אלו ניתן לנתח נוספת לפי הצורך.
איור 3. דוגמה ניתוח רב omics שילוב NMR עם הנתונים הגנומי. הרכב הקהילה מבוסס על אלקטרופורזה denaturing צבע ג'ל של 18s (משמאל) 16S (מימין) גנים rRNA מן דגימות אותו כפי שנותחו איור 2 מראה גם חיידקים שונים בקהילה (בין דפוסי יהלומים) פתוחים טבעיים ומלאכותיים (עיגולים שחורים) מיקרוקוסמוס מי ים. התכתבות כזו בין metabolome ו הגנום של מערכות טבעיות ממחיש את התועלת של גישה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת סינון המטבוליט החילוץ הפגינו כאן מאפשר ביומסה planktonic חיידקים כדי לאסוף כמות מספקת metabolomics תמ"ג. תוך מיצוי רק מימית מסיסים מטבוליטים באמצעות KPI ו 1D 1 H NMR באה לידי ביטוי, מיצוי בממסים אחרים וגישות ספקטרוסקופיות ניתן להשתמש. דוגמה שימושית הוא השימוש מתנול deuterated כמו חצי הקוטב ממס, אשר הוכח לייצר ספקטרום NMR מעולה מדגימות הטרוגניות והוא פחות רגיש לזיהום על ידי יוני פאראמגנטיים כפי נמצאים דגימות ימיים 15. במקרים כאלה, גלולה של מיצוי לעיל יש לשמור על עקירות ברציפות. העבודה הקודמת שלנו הוכיח את היציבות של ספקטרום תחת פעמים דגירה כאלה וטמפרטורות ואת התאמתו להפקת מימית ישירה NMR ספקטרוסקופיה 15,20. עם זאת החוקרים גם מעדיפים לשנות צעדים חילוץ, למשל באמצעות דינהצעד טיורינג להשבית אנזימים לפני החילוץ, או באמצעות מרווה מהירה שיטות השונים פשוט הקפאת תאים כפי שמוצג כאן. בנוסף, בעוד השיטות שהוצגו כאן הם המתאימים ביותר לצפייה שינויים מידתיים של מטבוליטים על פני טיפולים, אם רוצים, מסננים ניתן מראש שקל ולאחר מכן שקלו שוב לאחר סינון מדגם lyophilization להשיג משקל יבש, או את עוצמת הקול של מדגם יכול להיות מסוננים על מנת להשיג יותר כמותיים נתוני המקור המטבוליט.
בסופו של דבר, התועלת של NMR עבור דגימות planktonic מוגבל על ידי כמות המסה כי ניתן לאסוף בהצלחה, אפילו צפיפות גבוהה תרבויות עשויה לדרוש כמויות גדולות (> 100 מ"ל) להשיג ביומסה יבשה מספיק. עם זאת, בתוך תיוג ניסיוני, במסגרת איזוטופ יציב בניסויים מיקרו או mesocosm, 2 ד 1 H-13-C heteronuclear יחיד הקוונטים קוהרנטיות (HSQC) גישות אפשריות. יתר על כן, השתמשנו בנוסף 47 -מסננים מ"מ ו 5 מ"ל צינורות פוליפרופילן כדי להגדיל את כמות ביומסה כי ניתן לאסוף למיצוי, כמו גם כמויות גדולות יותר ייתכן שיהיה צורך (כלומר> 2 L) עבור קהילות טבעיים, מים oligotrophic למשל שבו צפיפות התא הוא נמוך.
סינון יש יתרון על פני צנטריפוגה כפי שהוא התצפית שלנו שכמה מינים של חיידקים קטן יותר (חיידקים heterotrophic קטנים במיוחד) בדרך כלל לא גלולה היטב. הסינון יכול להתבצע באופן ידני בשטח, וכן אמצעי האחסון מסוננים מוגבלים רק במספר מסננים זמינים. בנוסף, התקשורת או עודף מים ניתן להסיר באופן זה, את הדוגמאות ניתן לשטוף אם יש צורך. כמובן, גם עם סינון, הקהילה שנאסף יהיה מוגבל חלק בגודל עד הפסקת מסנן, אשר בדוגמה זו הוא 0.22 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים, סיוע, למחקר מדעי על מאתגר מחקר גישוש (JK), ומחקר מדעי (A) (ג'יי קיי ו SM) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן . FPR RIKEN המילגה (RCE) מספקת תמיכה נוספת. המחברים מביעים את תודתם בני הזוג. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama ו מאמי אוקמוטו לקבלת סיוע טכני עם NMR וניתוחים סטטיסטיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- The R Project for Statistical Computing. , Available from: http://www.r-project.org/ (2010).
- Eldon, L., et al.
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
