Summary
माइक्रोबियल planktonic समुदायों से metabolite का निष्कर्षण के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है. पूरे समुदाय के नमूने निस्पंदन द्वारा विशेष रूप से तैयार फिल्टर पर हासिल की है. Lyophilization के बाद, जलीय घुलनशील चयापचयों निकाले जाते हैं. इस दृष्टिकोण से पर्यावरण metabolomics की प्राकृतिक या प्रयोगात्मक सूक्ष्म समुदायों के पार omics जांच करने के लिए आवेदन के लिए अनुमति देता है.
Protocol
1. फिल्टर करने के लिए तैयार extractables निकालें
- 25 मिमी व्यास .22 माइक्रोन ताकना आकार Durapore PVDF हाइड्रोफिलिक फिल्टर (Millipore) का प्रयोग करें. चिमटी का उपयोग कर एक स्वच्छ 500 मिलीलीटर Pyrex बीकर में जगह फिल्टर. आसुत जल के साथ तीन बार पूर्व कुल्ला. भंवर के रूप में अच्छी तरह से आप के लिए एक दूसरे से चिपके से फिल्टर को रोकने के कुल्ला. 300 मिलीलीटर मिल्ली क्यू (Millipore) या समकक्ष उच्च गुणवत्ता वाले पानी जोड़ें. आटोक्लेव extractables के फिल्टर से पूरी तरह हटाने की सुविधा.
- बंद मिल्ली क्यू डालो और फिर ट्रिपल फिल्टर कुल्ला, मिल्ली - क्यू के साथ इस बार. चिमटी एक साफ शुष्क सतह (जैसे एल्यूमीनियम पन्नी के रूप में) और या तो एक उचित तापमान (37 जैसे डिग्री सेल्सियस) या शुष्क हवा में सूखे पर जगह अलग - अलग फिल्टर का उपयोग. फिल्टर अब कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं.
2. नमूना सामग्री का निस्पंदन
- 25 मिमी microanalysis फिल्टर कॉलम के साथ कांच का समर्थन करता है के साथ इस प्रोटोकॉल, एक Millipore स्टेनलेस स्टील 3 - जगह फिल्टर कई गुना का प्रदर्शन करने के लिएऔर एक यांत्रिक पंप किया जाता है. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, एक एकल 25 मिमी फिल्टर फिल्टर स्तंभ के आधार पर जगह के लिए, स्तंभ लागू करते हैं और एक साथ दबाना है.
- नमूने के 15 मिलीलीटर स्तंभ के लिए लोड करने के लिए, फिल्टर कई गुना पर रोक वाल्व खोलने, और पंप पर बारी. फ़िल्टर कोमल दबाव में सेल टूटना (<5 kPa) कम से कम. अन्य पंप, हाथ या एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के रूप में इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. कम घनत्व नमूने के लिए, पानी का लगातार परिवर्धन आवश्यक हो सकता है, नहीं फिल्टर पानी के जोड़ के बीच समय की एक विस्तारित अवधि के लिए सूख.
- समुद्री नमूने के लिए, के बाद आप अपने नमूना फ़िल्टर्ड है, तो आप प्रदर्शन कर सकते हैं एक वैकल्पिक मीठे पानी अपने नमूना और फिल्टर पर अवशिष्ट समचुंबक आयनों को कम कुल्ला. यह अधिक स्पेक्ट्रोमीटर चुंबक की सटीक ट्यूनिंग के साथ मदद कर सकते हैं. बस धीरे पानी की एक छोटी मात्रा जोड़ने और अंत में अपने एकत्र नमूना के माध्यम से फिल्टर.
- एक बार फ़िल्टरिंग समाप्त हो गया है, बंद पंप बारी, और वाल्व खोलना छोड़एन इसलिए वहाँ अभी भी फिल्टर के तहत नकारात्मक दबाव है. दबाना और फिल्टर स्तंभ निकालें.
- एक हाथ से, स्वच्छ चिमटी का उपयोग करने के लिए फिल्टर की पकड़ ले. खुद भर में फिल्टर मोड़ो, लेकिन क्रीज नहीं है. अपने दूसरे हाथ से एक बाँझ 2 मिलीलीटर microcentrifuge के ट्यूब के होंठ का उपयोग करने के लिए नीचे फिल्टर पकड़. चिमटी तो उन्हें रिलीज का उपयोग फिल्टर के दोनों किनारों को फिर से पकड़. एक 45 ° गुना कोण पर regrip.
- 2 मिलीलीटर ट्यूब और रिहाई में फिल्टर प्लेस तो यह नमूना भीतर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ खुलता है. आप को बाँझ 2 मिलीलीटर microcentrifuge के इस तरह से ट्यूब में दो फिल्टर करने के लिए जगह कर सकते हैं. यदि दो फिल्टर का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए, वे के रूप में संभव के रूप में थोड़ा ओवरलैप. तुरंत फ्रीज (कम से कम -30 ° सी).
3. जलीय घुलनशील चयापचयों का निष्कर्षण
- अपने रातोंरात या कम से कम 10 घंटे के लिए नमूने Lyophilize.
- Lyophilization के बाद, प्रत्येक ट्यूब (Tokken) के लिए एक स्टेनलेस स्टील के कोल्हू में जोड़ें. 750 μl मानकीकृत पोटेशियम जोड़ेंफॉस्फेट (DSS) 2,2 - डाइमिथाइल -2 silapentane-5-सल्फ़ोनेट मानक (KPI के साथ ड्यूटिरियम ऑक्साइड (एच 2> 90%) में एनएमआर बफर, 38.3 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 61.7 मिमी 2 कश्मीर HPO 4, 0.1 DSS मिमी, 7.0 पीएच, 2 90% डी 2 हे).
- 5 मिनट के लिए नमूने 4 ° C (Bioruptor, Diagenode) के एक पानी sonicator में फिल्टर से सेल सामग्री को दूर करने के लिए Sonicate. साफ चिमटी के साथ फिल्टर निकालें.
- 5 मिनट के लिए मिल कोल्हू (1600 आरपीएम) का उपयोग कोशिकाओं को बाधित.
- एक बेंच शीर्ष हिलनेवाला (Eppendorf) (1400 आरपीएम) 15 मिनट के लिए हिल के साथ 65 ° C सेते हैं.
- स्वच्छ चिमटी के साथ धातु सुअर निकालें, और 13,000 जी पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र.
- एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक एनएमआर ट्यूब सीधे सतह पर तैरनेवाला ड्रा.
4. एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और डेटा विश्लेषण
- एक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में अपनी नमूना लोड (यहाँ, Bruker DRX 500 - स्पेक्ट्रोमीटर के साथ सुसज्जितट्रिपल - अक्ष एक कंप्यूटर चल XWIN एनएमआर) द्वारा नियंत्रित ढाल के साथ TXI जांच.
- 1D 1 एच एनएमआर उपयुक्त पहले प्रकाशित तरीकों XWIN एनएमआर इंटरफ़ेस से 2,15 का उपयोग कर स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं. वर्तमान अध्ययन में 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा DRX 500 स्पेक्ट्रोमीटर ऑपरेटिंग पर 298 लालकृष्ण अवशिष्ट पानी संकेतों पर 500.03 मेगाहर्ट्ज पर दर्ज किए गए थे वाटरगेट पल्स अनुक्रम द्वारा 1.2 के एक पुनरावृत्ति समय के साथ, दबा दिया. 128 यात्रियों को स्पेक्ट्रम प्रति 32,000 डेटा अंक प्राप्त करने के लिए एकत्र किए गए.
- एक पीसी NMRPipe 16 सॉफ्टवेयर स्थापित करने के लिए स्थानांतरण एनएमआर डेटा निर्देशिका. कच्चे डेटा और सेट इस के बारे प्रक्रिया के रूप में 0 पीपीएम संदर्भ तो मैन्युअल रूप से स्पेक्ट्रा चरण. Digitize एकीकरण या 'binning उन्हें rNMR, Automics जैसे सॉफ्टवेयर के साथ, या ECOMICS वेब साइट (से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध FT2B पैकेज का उपयोग करके असतत मूल्यों का एक सेट में वर्णक्रमीय डेटा https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. वें मेंउदाहरण के लिए, स्पेक्ट्रा 0.5 और 10.5 पीपीएम के बीच 0.032 पीपीएम अभिन्न ECOMICS का उपयोग क्षेत्रों, और या तो इस के बारे या कुल संकेत तीव्रता सामान्यीकृत में एकीकृत किया गया. उत्पादन डेटा अब प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) 18 आर की तरह मुफ्त सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर के रूप में बहाव के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा के एक उदाहरण से ऊपर तरीकों का उपयोग कर चित्र 1 में दिखाया जाता है प्राप्त की. इन नमूनों, दो सूक्ष्म प्रयोग के समय अंक से काई चयापचय गतिविधियों के कारण स्पष्ट मतभेद दिखा. दिन 4 स्पेक्ट्रम चोटियों की काफी बहुतायत, 1 दिन नमूना तुलना में 3-4 पीपीएम रेंज में विशेष रूप से पता चलता है. इन चोटियों के सूक्ष्म जगत के भीतर डायटम खिल द्वारा उत्पादित शर्करा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. एक समान प्रयोग कृत्रिम या प्राकृतिक समुद्री जल में प्राकृतिक प्लवक समुदायों के विकास की तुलना में, सांख्यिकीय दृष्टिकोणप्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) स्कोर binned एनएमआर स्पेक्ट्रा से प्राप्त भूखंड के रूप में uch दो उपचार (छवि 2) के बीच स्पष्ट चयापचय मतभेदों को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लोड हो रहा है भूखंडों स्पेक्ट्रा भीतर चोटियों की पहचान कर सकते हैं कि डेटा के आकार वितरण . इस तरह के परिणाम में जीनोमिक फिंगरप्रिंटिंग तरीकों से जैसे अन्य omics के स्तर, (छवि 3) से डेटा के साथ तुलना में किया जा सकता है. इन चोटियों व्यक्तिगत एनएमआर पूछे जा सकता है (जैसे, http://www.bmrb.wisc.edu/ BMRB पर ) 19, या पूरे स्पेक्ट्रा सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है (पर SpinAssign के साथ जैसे http://prime.psc.riken. जेपी / = nmr_search? कार्रवाई ) 2. इस उदाहरण में, शर्करा क्षेत्र में प्राकृतिक प्लवक समुदाय चयापचयों से स्पेक्ट्रा की चोटियों की एक बहुतायत (3.39 पीपीएम 4.04 पीपीएम) के कारण उपचार के बीच मतभेद थे, और कई कृत्रिम समुद्री जल समुदायों के लिए विशेषता चोटियों अंतरिम थे आईडीईलैक्टेट और formate SpinAssign का उपयोग कर के रूप में ntified.
चित्रा 1 प्रतिनिधि 1 एच एनएमआर संसाधित नमूने इस कार्यविधि का उपयोग कर से प्राप्त स्पेक्ट्रा. सूक्ष्म जगत नमूने (1 दिन) से पहले और (4 दिन) एक तीव्र डायटम खिलने के दौरान लिया गया था. एनएमआर प्रयोगों Bruker DRX-500 पर आंतरिक मानक चोटी ऊंचाई (0 पीपीएम DSS) के लिए सामान्य संकेत के साथ प्रदर्शन किया गया.
2 चित्रा प्रधानाचार्य घटक विश्लेषण (पीसीए) स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न सूक्ष्म planktonic समुदायों प्राकृतिक साथ लघु में हो (खुली हीरे) या (काले हलकों) कृत्रिम समुद्री जल के metabolomes से binned एनएमआर स्पेक्ट्रा के लिए स्कोर साजिश. स्पष्ट चयापचय मतभेदों को scatterplot में मनाया जा सकता है. इस तरह के एक विश्लेषण से लोड हो रहा है साजिश तो महत्व का अलग चोटियों की पहचान में इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रणाली, इन चोटियों और जरूरत के रूप में विश्लेषण कर सकते हैं.
चित्रा 3. बहु - omics विश्लेषण का एक उदाहरण जीनोमिक डेटा के साथ संयोजन एनएमआर. समुदाय रचना 18S की ढाल denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (बाएं) और (दाएं) एक ही नमूने के रूप में चित्रा 2 में विश्लेषण से rRNA जीन 16S पर आधारित भी प्राकृतिक (खुली हीरे) और (काले हलकों) कृत्रिम समुद्री जल लघु के बीच अलग माइक्रोबियल समुदाय पैटर्न से पता चलता है. Metabolome और प्राकृतिक प्रणालियों से जीनोम के बीच इस तरह के पत्राचार के इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को दर्शाता है.
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Discussion
निस्पंदन और metabolite निष्कर्षण विधि यहाँ का प्रदर्शन माइक्रोबियल planktonic बायोमास के लिए पर्याप्त राशि के में एनएमआर metabolomics के लिए एकत्र होने की अनुमति देता है. जबकि जलीय घुलनशील चयापचयों का उपयोग कर KPI और 1D 1 एच एनएमआर की ही निकासी का प्रदर्शन किया जाता है, अन्य निष्कर्षण सॉल्वैंट्स और स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उपयोगी उदाहरण के एक अर्द्ध ध्रुवीय विलायक, जो विषम नमूने से बेहतर एनएमआर स्पेक्ट्रा का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है और कम समचुंबक आयनों द्वारा संदूषण के प्रति संवेदनशील है के रूप में समुद्री 15 नमूनों में पाया जाता है रूप में deuterated मेथनॉल के उपयोग है. ऐसे मामलों में, ऊपर निष्कर्षण से गोली लगातार एक्सट्रेक्शन के लिए बनाए रखा जाना चाहिए. हमारे पिछले काम में ऊष्मायन समय और तापमान और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी 15,20 के लिए प्रत्यक्ष जलीय निष्कर्षण की उपयुक्तता के तहत स्पेक्ट्रा की स्थिरता को दिखाया गया है. हालांकि शोधकर्ताओं ने भी एक देना का उपयोग करने के लिए निष्कर्षण कदम उदाहरण के लिए, संशोधित करने के लिए पसंद कर सकते हैंट्यूरिंग कदम एंजाइमों निकासी के लिए पहले निष्क्रिय, या तेजी से शमन तरीकों कि केवल कोशिकाओं को ठंड जैसा कि यहाँ दिखाया से अलग का उपयोग करके. इसके अतिरिक्त, जबकि यहाँ प्रस्तुत तरीकों सबसे अच्छा उपचार भर चयापचयों में आनुपातिक परिवर्तन देख, अगर वांछित के लिए अनुकूल हैं, फिल्टर पूर्व - तौल कर सकते हैं और तब नमूना निस्पंदन और lyophilization के बाद फिर से वजन सूखी वजन, या नमूना फ़िल्टर कर सकते हैं सकता है की मात्रा प्राप्त करने के और मात्रात्मक metabolite स्रोत डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
अंततः, planktonic नमूने के लिए एनएमआर की उपयोगिता जन की राशि है कि सफलतापूर्वक एकत्र किया जा सकता द्वारा विवश है, यहां तक कि उच्च घनत्व संस्कृतियों बड़ी मात्रा में (100> मिलीलीटर) की आवश्यकता के लिए पर्याप्त सूखे बायोमास प्राप्त कर सकते हैं. हालांकि, एक प्रयोगात्मक रूपरेखा, सूक्ष्म या mesocosm प्रयोगों में स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के भीतर, 2 डी 1 एच 13 सी heteronuclear एकल क्वांटम जुटना दृष्टिकोण (HSQC) के संभव हैं. इसके अलावा, हम अतिरिक्त 47 का इस्तेमाल किया है -मिमी फिल्टर और 5 मिलीलीटर की polypropylene ट्यूबों कि निकासी के लिए एकत्र किया जा सकता है के रूप में भी बड़ी मात्रा में, बायोमास की राशि वृद्धि से प्राकृतिक समुदायों, जैसे oligotrophic पानी जहां सेल घनत्व कम कर रहे हैं के लिए आवश्यक हो सकता है (यानी एल> 2).
छानने का काम, centrifugation अधिक लाभदायक है के रूप में यह हमारे अवलोकन है कि कुछ छोटे सूक्ष्म taxa (विशेष रूप से छोटे परपोषी बैक्टीरिया) अक्सर अच्छी तरह से गोली नहीं करना है. निस्पंदन क्षेत्र में मैन्युअल रूप से प्रदर्शन कर सकते हैं, और फ़िल्टर संस्करणों फिल्टर्स की संख्या उपलब्ध केवल द्वारा सीमित हैं. इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त मीडिया या पानी इस तरह से हटाया जा सकता है, और अगर जरूरत नमूने rinsed होना कर सकते हैं. बेशक, निस्पंदन के साथ भी एकत्र समुदाय एक आकार अंश के लिए सीमित किया जाएगा फिल्टर cutoff, जो इस उदाहरण में 0.22 माइक्रोन के लिए नीचे.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध में भाग द्वारा समर्थित किया गया अनुदान सहायता में शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान मंत्रालय से खोजपूर्ण (जे), अनुसंधान और वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (जे और एस) को चुनौती देने के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए, और प्रौद्योगिकी, जापान . एक आरआईकेईएन fpr फैलोशिप (RCE) अतिरिक्त सहायता प्रदान की है. लेखकों डीआरएस के प्रति अपनी कृतज्ञता व्यक्त करते हैं. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama और एनएमआर और सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ तकनीकी सहायता के लिए ममी Okamoto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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