Summary
从微生物浮游社区的代谢产物提取方法。抽样实现整个社会上特意准备的过滤器过滤。冷冻干燥后，溶于水，代谢产物中提取。这种方法用于环境代谢的自然或实验的微生物群落的跨组学研究中的应用。
Abstract
环境代谢组学是一个新兴的领域有了新的认识，促进生物体是如何应对和交互环境和对方在生化水平1。核磁共振（NMR）光谱是多种技术，包括气相色谱 - 质谱（GC-MS法）之一，此类研究大有前途。核磁共振的优点是，它是适用于不相关的分析，提供结构化信息和光谱可以对最近2,3个人代谢物谱数据库查询数量和统计的举止。此外，核磁共振光谱数据可与其他组学水平（如转录，基因组学）的数据，以提供更全面的了解类群的生理反应，彼此和环境4,5,6。然而，核磁共振是比其他代谢组学技术的敏感，使其难以AP铺设天然微生物系统，样本人群低密度及代谢物浓度比较低的代谢物的定义和随时提取来源，如整个组织，biofluids或细胞培养。因此，一些直接环境日期进行微生物的代谢物的研究一直局限于文化为基础的或容易定义的高密度的生态系统，如主机的共生系统，构建联合培养或肠道内环境的稳定同位素标记可以操作此外用于增强核磁共振信号7,8,9,10,11,12。核磁共振适合浓度的方法，促进环境代谢物的浓度和收集所缺乏的。由于近期关注已在水生环境，其中大部分能量和物质流介导由的浮游社区13,14生物体对环境的代谢，我们已经开发出一种浓度的方法TION和全社会的代谢产物从浮游微生物系统过滤提取。市售亲水性的聚-1 ,1-difluoroethene（PVDF）过滤器是经过特殊处理，以彻底清除萃取物，可作为后续分析中的污染物，否则会出现。然后，这些治疗的过滤器用于过滤利益的环境或实验样品。湿样品材料的过滤器含有冻干和使用一个标准化的钾磷酸盐提取液常规核磁共振光谱直接溶于水的代谢产物中提取。可以从这些方法得出的数据进行统计分析，找出有意义的模式，或集成水平与其他组学为社会和生态系统功能的全面了解。
Protocol
1。过滤删除萃取物的制备
- 使用25毫米直径0.22微米孔径Durapore PVDF（Millipore公司）亲水性过滤器。放置在一个干净的500毫升耐热烧杯过滤器，使用镊子。前用蒸馏水冲洗三次。漩涡以及你冲洗过滤器，以防止从坚持彼此。加入300毫升的Milli-Q（Millipore公司）或相当于高品质的水。釜萃取物彻底清除，以方便从过滤器。
- 倒掉的Milli-Q和再次三重冲洗过滤器，这个时候用Milli-Q。使用镊子个人清洁干燥的表面（如铝箔），要么在一个合理的温度（例如37℃）或空气干燥干燥过滤器。现在可以使用过滤器。
2。过滤材料的样品
- 玻璃支持这一协议，微孔不锈钢3就地过滤多方面展示与25毫米的微量过滤列使用机械泵。使用无菌操作技术，将一个单一的25毫米的过滤器，适用于过滤柱基列和取缔一起。
- 列装入15毫升的样品，打开过滤器流形上的截止阀，并打开泵。温柔的压力下，过滤器，以减少细胞破损（<5千帕）。如手或蠕动泵，其他泵，可适应于本议定书。对于密度较低的样品，连续增加的水可能是必要的，不要让去添置水之间的时间间隔较长时间的干燥过滤器。
- 海洋样品，你过滤你的样品后，您可以执行一个可选的淡水冲洗，以减少您的样品，并在过滤器上的残余顺磁离子。这可能有助于更精确调谐谱仪磁铁。只是轻轻地补充水分，体积小，并在年底通过您收集的样本进行筛选。
- 一次过滤完成后，关闭泵，并留下阀门OPE列印因此仍有负压下过滤器。取出钳和过滤器列。
- 用一只手，用干净的镊子，采取保留在过滤器中。双臂交叉本身的过滤器，但没有折痕。使用无菌的2 ml离心管唇用另一只手按住过滤器。然后松开镊子，用他们重新夹住过滤器的两边。 regrip在45°角对折。
- 放入2毫升管和释放过滤器，所以它与样品的一面朝内打开。您可以将高达两成无菌的2 ml离心管这种方式过滤。如果使用两个过滤器，确保他们尽可能少的重叠。立即冻结（至少-30℃）。
3。提取溶于水的代谢
- 冻干的样品过夜或至少10个小时。
- 冻干后，添加到每个管（Tokken）不锈钢破碎机。加入750μL标准化钾磷酸盐在氧化氘（2H> 90％）与2,2 -二甲基-2-silapentane-5-磺酸钠（DSS）的标准（KPI核磁共振缓冲区; 38.3毫米KH 2 PO 4计 ，61.7毫米K 2 HPO 4，决策支持系统0.1毫米，pH值7.0，90％D 2 O）2。
- 超声在4样品°水sonicator的℃（Bioruptor，Diagenode）的电池材料从过滤器中删除5分钟。用干净的镊子取出过滤器。
- 使用一个磨式破碎机（1600转）5分钟，破坏细胞。
- 在65°C孵育摇晃在台式振动筛（Eppendorf公司）为15分钟（1400转）。
- 用干净的镊子取出金属猪，离心13,000Ğ样本为5分钟。
- 绘制了核磁共振光谱，核磁共振管上清液直接。
4。核磁共振光谱和数据分析
- 加载您的样品（在这里，在Bruker DRX-500光谱仪配备到核磁共振仪TXI探头由计算机正在运行的XWIN-NMR）控制的三轴梯度。
- 获得1D 1 H NMR谱，采用适当的方法原样XWIN-NMR接口2,15。在本研究中均录得1 H NMR谱在500.03兆赫在298 K的残留水信号被抑制水门事件的脉冲序列重复了1.2秒的时间，在DRX-500光谱仪的工作。 128的瞬态采集，获得了32000个频谱数据点。
- NMR数据目录转移NMRPipe软件16安装一台PC。处理的原始数据和一套决策支持系统，为0 ppm的参考，然后手动相位谱。数字化成一套整合软件，如rNMR，Automics或“分级”，或使用公开可用FT2B包ECOMICS网站（离散值光谱数据https://database.riken.jp/ecomics/的 ）3,17。在日例如，被谱进行了整合之间0.5和10.5 ppm的0.032 ppm的积分使用ECOMICS地区，要么DSS或总信号强度和规范化。输出数据，现在可以用于下游的统计分析，如主成分分析（PCA），使用免费的软件包， 如 R 18。
5。代表结果
例如1 H NMR谱的取得，使用上述方法如图1所示。这些样本，从两个时间点的一个缩影实验显示明显的差异，由于藻类的代谢活动。 4天的频谱显示相当丰富，尤其是在3-4 ppm范围内的高峰相比，天1个样本。这些山峰，可以归结为绽放在缩影硅藻产生的糖。在一个类似的实验，比较自然的浮游生物群落生长在人工或天然海水，统计方法小号主成分分析（PCA）的得分分级核磁共振光谱所得情节UCH可以用来表明两者之间的处理（图2）明确的代谢差异，而负荷地块内可以识别的光谱峰形状分布的数据。可以与其他组学的水平，从基因组的指纹识别方法，如（图3）的数据相比，这样的结果。这些核磁共振峰可以单独查询（例如在BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ）19，或整个光谱可以进行统计分析（与在SpinAssign如http://prime.psc.riken。 JP /？行动= nmr_search ）2。在这个例子中，处理之间的差异是由于糖的地区丰富的山峰，从天然浮游生物群落代谢产物的光谱（3.39 ppm到4.04 ppm）的人工海水社区特点的几座山峰，并初步IDE作为乳酸ntified和使用SpinAssign的甲酸。
图1代表1 H NMR谱从处理的样品，使用此过程中获得。前（1天）和（4日）激烈的硅藻水华期间的缩影样本。 NMR实验在Bruker DRX-500信号与内标峰高（决策支持系统; 0 ppm）的正常化。
图2。主成分分析（PCA）的得分为自然衍生的浮游微生物的成长与自然的缩影社区（开放的钻石）或人工（黑眼圈）海水metabolomes分级核磁共振光谱图。散点图中可以观察到清晰的代谢差异。从这样的分析，加载情节可以被用来确定不同的重要性峰系统;这些山峰可以进一步分析需要。
图3。与基因组数据相结合的多组学分析的一个例子核磁共振。根据群落组成的18S变性梯度凝胶电泳（左）和（右）从16S rRNA基因相同的样本分析图2也显示出不同的微生物之间的自然（开放的钻石）及人工（黑圈）海水的缩影社区模式。从自然生态系统之间的代谢组学和基因组等通信演示了这种方法的有效性。
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Discussion
这里展示的过滤和代谢产物提取方法允许在收集足够数量的核磁共振代谢微生物浮游生物。虽然只溶于水的使用KPI和1D 1 H核磁共振的代谢产物提取证明，其他的提取溶剂和光谱方法可以使用。一个有用的例子是使用氘代甲醇作为一个半极性溶剂，这已被证明产生优越的核磁共振光谱，从异构样品及顺磁离子污染不敏感，在15个海洋样品发现。在这种情况下，从上面提取的颗粒应保持连续提取。我们以前的工作表明在这样的孵育时间和温度和适宜的直接水提取核磁共振光谱15,20光谱的稳定性。然而，研究人员可能还喜欢修改提取的步骤，例如，通过使用DENA图灵一步灭活酶前提取，或利用快速淬火的方法，从简单的冻结如下所示的细胞不同。此外，虽然这里介绍的方法最适合用于观察整个治疗代谢产物中的比例的变化，如果需要的话，过滤器可以预先称重，然后称重样品过滤和冻干后再次获得的干重，或过滤的样品体积可以用于获取更多的定量代谢物源数据。
浮游样品的核磁共振的效用，最终被限制的大规模量，可以成功地收集，即使是高密度的文化，可能需要大量（> 100毫升），以获得足够的干物质。然而，在一个实验性的框架内，在微型或围隔实验稳定同位素标记，2D 1 H-13型 ç异核单量子相干性（HSQC）方法是可能的。此外，我们还另外使用了47 -毫米的过滤器和5毫升聚丙烯管，以增加生物量，提取量更大，可以收集，可能是必要的自然群落，如贫营养水域的细胞密度低（即> 2升）。
以上离心过滤是有利的，因为它是我们的观察，一些规模较小的微生物类群（尤其是小异养菌）经常做不沉淀。在外地，可以手动进行过滤，过滤卷是唯一可用的过滤器数量有限。此外，多余的介质或水，可以在这种方式中删除，如果需要的话，样品可冲洗。当然，即使有过滤，收集社会将受到限制，大小比滤波器的截止，在这个例子中是0.22微米。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究得到了部分赠款援助具有挑战性的探索性研究（JK），科研（一）（JK和SM），从教育，文化，体育，科学部，科研和技术，日本。一个RIKEN的玻璃钢奖学金“（RCE），提供额外的支持。作者表达自己的谢意博士。英介Chikayama Yasuyo Sekiyama和冈本真身用核磁共振和统计分析的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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