Summary
微生物のプランクトンコミュニティからの代謝物抽出のための方法が示されています。コミュニティ全体のサンプリングが特別に用意されたフィルター上にろ過することにより達成される。凍結乾燥後、水性の水溶性代謝物が抽出されます。このアプローチは、自然または実験的な微生物群集のトランスオミクス研究への環境メタボロミクスの応用が可能になります。
Abstract
環境メタボロミクスは生物に対応し、生化学的なレベル1の環境と相互に作用する方法に新たな理解を推進している新興分野である。核磁気共鳴（NMR）分光法は、このような研究のためにかなりの約束で、ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS）を含むいくつかの技術の一つです。 NMRの利点は、非標的分析に適した構造情報を提供し、スペクトルは個々の代謝物のスペクトル2,3の最近使用可能なデータベースに対して、定量的および統計的方法で照会することができますということです。さらに、NMRスペクトルデータは、互いに分類群の生理的応答と環境4,5,6のより包括的な理解を提供するために、他のオミクスレベル（例えばトランスクリプトミクス、ゲノミクス）からのデータと組み合わせることができます。しかし、NMRはAPにそれが難しく、他のメタボローム技術よりも感度が低いです。サンプル集団はそのような全体の組織、生体液または細胞培養物として明確に定義され、容易に抽出可能な情報源からの代謝物に比べて低い低密度及び代謝物濃度になります自然の微生物のシステムへのプライ。その結果、現在までに行われた微生物のいくつかの直接的な環境メタボローム研究はそのようなホスト·シンビオント·システムなどのカルチャベースまたは容易に定義されている高密度の生態系、安定同位体標識をすることができます腸内環境の共培養または操作建設に限られてきたさらに、NMR信号7,8,9,10,11,12を強化するために使用されます。 NMRに適した濃度で、環境の代謝物の濃度と回収を容易にする方法は、不足している。最近の関心は多くのエネルギーと物質の流れがプランクトンコミュニティ13,14によって媒介される水生環境内の生物の環境へのメタボロミクスに与えられているので、濃度のための方法を開発しましたるとろ過による浮遊微生物のシステムからの全コミュニティの代謝物の抽出。市販の親水性ポリ-1,1 - difluoroethene（PVDF）フィルタは、特別に完全にそうでなければ、その後の分析で汚染物質として現れることができる抽出物を除去するために扱われます。これらの処理のフィルタは、興味のある環境や実験サンプルをフィルタリングするために使用されています。湿潤試料材料を含むフィルターを凍結乾燥し、水、水溶性代謝物は、標準化されたリン酸カリウム抽出緩衝液2を使用して、従来のNMR分光法のために直接抽出されます。これらのメソッドから派生したデータは統計的に意味のあるパターンを識別するために分析、またはコミュニティと生態系の機能の包括的な理解のための他のオミクスレベルで統合することができます。
Protocol
1。溶出物を削除するフィルタの準備
- 25 mm径0.22μmの孔サイズデュラポアPVDF親水性フィルター（ミリポア社製）を使用します。ピンセットを使用してクリーン500ミリリットルパイレックスビーカー内のフィルタを配置します。蒸留水で3回プレリンス。あなたがお互いにくっつくのフィルターを防ぐために、リンスとしてよく渦。 300ミリリットルのMilli-Q（ミリポア社製）または同等の高品質の水を追加します。フィルタからの溶出物の完全な除去を容易にするためにオートクレーブします。
- のMilli-Qとこの時間は、ミリQを捨て、再びトリプルフィルターをすすぎます。清潔で乾燥した表面（例えば、アルミ箔など）との合理的な温度（例えば37°C）または空気乾燥のいずれかで乾燥した上でピンセットの場所の個々のフィルタを使用する。フィルタが現在使用することができます。
2。サンプル材料のろ過
- このプロトコルは、ガラスをサポートし、25 mmの微量分析フィルタの列を持つミリポアステンレス鋼3の場所フィルタマニホールドを立証するためのと機械式ポンプが使用されています。無菌テクニックを使用して、フィルターカラムをベースにシングル25mmのフィルタを配置し、列を適用し、一緒にクランプします。
- 、カラムに試料15mlを読み込むフィルタマニホールドにストップバルブを開き、ポンプの電源をオンにします。セルの破損（<5 kPa）を最小限に抑えるために穏やかな圧力下でフィルタリングします。そのような手や蠕動ポンプのような他のポンプは、このプロトコルに適合させることができる。低密度のサンプルについては、水の連続的な追加が必要になることがあり、フィルターは水の添加の間に長時間の乾燥行かせません。
- あなたがサンプルを濾過した後、海洋試料については、あなたは、オプションの淡水は、サンプルでは、フィルタ上の残留常磁性イオンを低減するためにリンスを実行できます。これは、分光器の磁石のより正確なチューニングに役立つことがあります。単に穏やかに少量の水を追加し、末尾に採取した試料を介してフィルタリングします。
- フィルタリングが完了すると、ポンプの電源をオフにし、バルブのOPEを残すnは、フィルタの下の負圧が残っている。クランプとフィルタ列を削除します。
- 片手で、フィルタのホールドを取るためにきれいなピンセットを使用しています。自分自身を越えてフィルタを折るが、しわません。もう一方の手でフィルターを保持するために無菌の2 mlマイクロチューブのリップを使用しています。フィルタの両方のエッジを再つかむためにそれらを使用してピンセットを離します。倍に45°の角度でRegrip。
- それは内側に面した試料側で開きますので、2 mlチューブとリリースにフィルタを配置します。あなたは、無菌の2 mlのマイクロチューブにこのように2つまでのフィルタを配置することができます。二つのフィルターを使用している場合、彼らはできるだけ少し重なるようにします。すぐに（少なくとも-30℃）凍結。
3。水性の水溶性代謝物の抽出
- 一晩または少なくとも10時間あなたのサンプルを凍結乾燥。
- 凍結乾燥後、各チューブ（Tokken）にステンレス製の粉砕機を追加します。 750μlの標準化カリウムを追加します。38.3 mMのKH 2 PO 4、61.7 mMのK 2 HPO 4、DSS 0.1; 2,2 -ジメチル-2 - silapentane-5-スルホネート（DSS）、標準（KPIに重水素酸化物のリン酸塩のNMRバッファ（2 H> 90％） mMのは、pH 7.0、90％D 2 O）2。
- フィルタから細胞物質を除去するために4℃の水超音波でC（断片化、Diagenodeの）で5分間のサンプルを超音波処理してください。きれいなピンセットでフィルタを削除します。
- 5分間のミル粉砕機（1600 rpm）を用いて細胞を破壊する。
- 15分間のベンチトップシェーカー（エッペンドルフ）に（1400 rpm）で振とうしながら65℃でインキュベートします。
- きれいなピンセットで金属製のブタを外し、5分間13,000 gでサンプルを遠心します。
- NMR分光法のNMRチューブに直接上清を描画します。
4。 NMR分光法とデータ解析
- （ここでは、ブルカーDRX-500分光計を搭載したNMR分光計にサンプルをロードするXWIN-NMRを実行するコンピュータによって制御されるトリプル軸勾配とTXIプローブ）。
- XWIN-NMRインターフェースから適切な以前に発行されたメソッドの2,15を使用して 1D 1 H NMRスペクトルを取得します。本研究では1 H NMRスペクトルは、1.2秒の繰り返し時間で、ウォーターゲートパルスシーケンスによって抑制された298 K.残留水信号で500.03 MHzでDRX-500分光器オペレーティング·システム上で記録した。 128過渡は、スペクトルごとに32,000データポイントを取得するために集められた。
- PCにインストールNMRPipeソフトウェア16にNMRデータディレクトリを転送します。生データを処理し、0ppmでの参照は、手動でスペクトルを相としてDSSを設定します。デジタル化し統合するか"ビニング"それらをそのようなrNMR、Automicsとしてソフトウェアを使用して、またはECOMICSのWebサイト（から公的に利用可能なFT2Bパッケージを使用して、離散的な値の集合にスペクトルデータhttps://database.riken.jp/ecomics/ ）3,17。番目の例であり、スペクトルはECOMICSを使用して0.032 ppmの積分領域上0.5〜10.5 ppmの間で統合し、DSSまたは全信号強度のいずれかに正規化された。出力データは現在のようなR 18のようなフリーソフトウェアパッケージを使用して主成分分析（PCA）などの下流の統計分析に使用することができます。
5。代表的な結果
1 H NMRスペクトルの例としては、上記の方法は、 図1に示されている使用して得られた。これらのサンプルは、小宇宙実験の2つの時点から、藻類の代謝活動に起因する明確な違いを示しています。 4日目スペクトルは、1日目のサンプルに比べて、特に3から4 ppmの範囲で、ピークのかなりの豊かさを示しています。これらのピークは、小宇宙の中で珪藻ブルーミングによって生成された糖に起因することができます。人工または天然海水中の天然プランクトン群集の成長を比較して同様の実験では、統計的アプローチのローディングプロットは、スペクトル内のピークを識別することができますがビンのNMRスペクトルから派生した主成分分析（PCA）スコアプロットとしてUCHは、二つの治療法（図2）の間に明確な代謝の違いを示すために使用することができ、その形状データの配布。このような結果はこのようなゲノムフィンガープリント法（図3）から、他のオミクスレベルからのデータと比較することができます。これらのNMRピークは（BMRB時など、個別に照会することができますhttp://www.bmrb.wisc.edu/ ）19、またはスペクトル全体（例えばでSpinAssignと統計的に分析することができますhttp://prime.psc.riken。 JP /？アクション= nmr_search ）2。この例では、治療の違いは、自然のプランクトンコミュニティの代謝物からのスペクトルの糖地域のピークの豊富（3.39 ppmから4.04 ppm）のによるものであったし、人工海水のコミュニティに特有のいくつかのピークが暫定的にIDEだったSpinAssignを使用して乳酸とギとしてntified。
図1は、この手順を使用して処理したサンプルから得られた代表的な1 H NMRスペクトルを示す。小宇宙のサンプルは前に（1日目）と（4日目）強烈な珪藻ブルーム時に撮影された。 NMR実験は、内部標準のピーク高さ（; 0 ppmのDSS）に正規化信号とブルカーDRX-500で行われた。
図2自然と小宇宙で育った天然由来の微生物プランクトンコミュニティ（オープンダイヤモンド）や人工的な（黒丸）海水のメタボロームから選別NMRスペクトルの主成分分析（PCA）スコアプロット。明確な代謝の違いは、散布図で観察することができます。このような分析からロードプロットは、その後の重要性の明確なピークを識別するために使用することができますシステムは、必要に応じて、これらのピークは、さらに分析することができます。
図3マルチオミックス解析の例としては、ゲノムデータとNMRを組み合わせた。変性勾配ゲル18Sの電気泳動（左）と16Sに基づいて、コミュニティの構成（右） 図2に、分析と同じ試料からのrRNA遺伝子は、天然（オープンダイヤモンド）と人工（黒丸）海水の小宇宙の間に明確な微生物群集のパターンを示しています。自然のシステムからメタボロームやゲノムとの間のこのような対応は、このアプローチの有用性を示しています。
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Discussion
ここで示したろ過及び代謝物抽出法は、NMRメタボロミクスのために十分な量で収集する微生物プランクトンのバイオマスが可能になります。 KPIと1D 1 H NMRを用いて水性の水溶性代謝物の抽出のみが実証されていますが、他の抽出溶媒と分光の手法を使用することができます。一つの有用な例は、異種のサンプルから優れたNMRスペクトルを生成するために示され、常磁性イオンによる汚染に敏感であるなどの海洋試料15で発見された半極性溶媒として重水素化メタノールを使用することである。このような場合には、上記抽出物からのペレットは、連続抽出のために保持する必要があります。我々の以前の作品は、インキュベーション時間と温度とNMR分光法15,20の直接の水抽出の適合性の下でのスペクトルの安定性を示している。しかし、研究者はまた、ディー·エヌ·エーを使用することによって、例えば、抽出工程を変更するのを好むかもしれませんチューリングは、抽出前に酵素を不活性化するステップ、または急速な焼入れをここに示すように、単に細胞を凍結する異なる方法を使用します。さらに、ここで紹介する方法は最高の、治療間の代謝産物に比例した変化を観察に適していながら、必要に応じて、フィルタが事前に検討することができますし、乾燥重量を得るためにサンプルのろ過、凍結乾燥した後、再度秤量し、またはろ過した試料の体積はすることができますより定量的な代謝産物のソースデータを取得するために使用されます。
最終的には、プランクトン試料のNMRのユーティリティが正常に収集することができる質量の量によって制限されます。さらに高密度の文化が十分乾燥したバイオマスを得るために大量の（> 100ミリリットル）が必要な場合があります。しかし、ミクロまたはメソコスム実験では実験的な枠組み、安定同位体標識の中で、2D 1 H-13 C異核単一量子コヒーレンス（HSQC）のアプローチが可能です。さらに、私たちは、さらに47を使用している -さらに大きなボリュームとして、抽出のために収集することができるバイオマス量を増加させるミリメートルフィルタ、5 mlのポリプロピレンチューブは細胞密度が低いから自然群集例えば、貧栄養海域のために（すなわち、> 2 L）が必要な場合があります。
それはいくつかの小さな微生物の分類群は（特に小さな従属栄養細菌）閲覧ペレットしていないことを我々の観測であるとして、ろ過、遠心分離上有利である。ろ過は、フィールドに手動で実行することができますし、ろ過したボリュームでのみ使用可能なフィルタの数によって制限されています。さらに、過剰なメディアや水は、この方法で削除することができ、必要に応じてサンプルをリンスすることができます。もちろん、さらにろ過して、収集されたコミュニティは、この例では0.22μmであるフィルタのカットオフにサイズ分までに制限されます。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、文部科学、技術、日本省から探索研究（JK）に挑戦するための科学研究費補助金、および科学研究（A）（JKとSM）によって部分的にサポートされていました。理研FPRフェローシップ（RCE）は、追加サポートを提供。著者は、博士に感謝の意を表明する。英資近山、NMRおよび統計分析と技術支援のための恭代関山と真美岡本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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