Summary
Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.
Abstract
Metabolômica Ambiental é um campo emergente que está promovendo uma nova compreensão de como os organismos respondem e interagem com o ambiente e entre si, no nível bioquímico 1. Nuclear espectroscopia de ressonância magnética (RNM) é uma de várias tecnologias, incluindo cromatografia em fase gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), com a promessa considerável para tais estudos. Vantagens de RMN são de que ele é adequado para análises não-alvo, fornece informações estruturais e espectros podem ser consultados de maneira quantitativa e estatística em bancos de dados recentemente disponíveis de espectros metabólito indivíduo 2,3. Além disso, dados espectrais de RMN podem ser combinados com dados de outros níveis genómica (transcritômica por exemplo, genómica) para fornecer uma compreensão mais abrangente das respostas fisiológicas de taxa para o outro e ao meio ambiente 4,5,6. No entanto, de RMN é menos sensível do que outras técnicas de metabolômica, tornando difícil a APply para sistemas microbianos naturais, onde as populações de amostras podem ser concentrações de baixa densidade e metabólito baixo em comparação com metabólitos de bem-definida e facilmente extraíveis fontes, tais como tecidos inteiros, fluidos biológicos ou de células-culturas. Por conseguinte, os poucos estudos directos ambientais metabolômica de micróbios realizadas até à data têm sido limitados a cultura à base de ou facilmente definido de alta densidade, tais como os ecossistemas hospedeiro simbióticas-sistemas, construídos co-culturas ou manipulações do ambiente intestino, onde rotulagem isótopo estável pode ser adicionalmente utilizado para aumentar os sinais de RMN 7,8,9,10,11,12. Métodos que facilitam a concentração e recolha de metabolitos ambientais em concentrações adequadas para RMN faltam. Uma vez que a atenção recente tem sido dada aos metabolômica ambientais de organismos dentro do meio aquático, onde a maior parte do fluxo de energia e material é mediada pela comunidade planctônicas 13,14, desenvolvemos um método para a concentraçãoção e extração de todo-comunidade metabólitos de sistemas microbianos planctônicos por filtração. Hidrofílicos disponíveis comercialmente poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF) os filtros são especialmente tratado para remover completamente os extraíveis, que podem de outro modo aparecem como contaminantes em análises subsequentes. Estes filtros tratados são então usados para filtrar amostras ambientais ou experimental de interesse. Filtros contendo o material da amostra molhada são liofilizadas e aquosa solúveis em metabolitos são extraídos directamente para a espectroscopia de RMN convencional, utilizando um tampão de extracção padronizados de potássio fosfato 2. Os dados derivados desses métodos podem ser analisados estatisticamente para identificar padrões significativos, ou integrados com outros níveis genómica para compreensão abrangente da comunidade e função do ecossistema.
Protocol
1. Preparação filtro para remover Extraíveis
- Use 25-mm de diâmetro de poro de 0,22 um tamanho de filtros PVDF Durapore hidrofílico (Millipore). Coloque filtros em uma proveta de 500 ml limpa Pyrex usando uma pinça. Pré-lavagem três vezes com água destilada. Redemoinho bem como de enxaguar para impedir que os filtros se colem umas às outras. Adicionar 300 ml Milli-Q (Millipore) ou de água de alta qualidade equivalente. Autoclavar para facilitar a remoção completa de extraíveis a partir dos filtros.
- Decantar a Milli-Q e novamente tripla lavagem dos filtros, desta vez com Milli-Q. O uso de filtros lugar pinças individuais sobre uma superfície limpa e seca (tal como folha de alumínio) e, ou seca a uma temperatura razoável (por exemplo 37 ° C) ou de ar seco. Os filtros agora está pronto para usar.
2. A filtração do material de amostra
- Para demonstrar este protocolo, a Millipore aço inoxidável 3 º lugar-tubo do filtro com colunas de 25 mm de microanálise de filtros de vidro com suportee uma bomba mecânica é utilizada. Utilizando uma técnica asséptica, colocar um filtro de 25 mm único na base da coluna de filtro, aplicar a coluna e pinça juntos.
- Carregar 15 ml de amostra na coluna, abrir o obturador sobre o tubo do filtro, e ligar a bomba. Filtrar sob pressão suave para minimizar a quebra das células (<kPa 5). Outras bombas, tais como mão ou uma bomba peristáltica podem ser adaptados a este protocolo. Para amostras de densidade mais baixa, adições sucessivas de água pode ser necessário, não deixe o filtro ficar seca por um período prolongado de tempo entre as adições de água.
- Para amostras marinhas, depois de ter filtrado a sua amostra, você pode realizar uma de água doce opcional enxágüe para reduzir os íons paramagnéticos residuais em sua amostra e no filtro. Isso pode ajudar com mais ajuste preciso do magneto do espectrômetro. Simplesmente suavemente adicionar um pequeno volume de água e filtrar através de sua amostra recolhida no final.
- Uma vez que a filtragem está terminado, desligue a bomba e deixar o ope válvulan por isso ainda há a pressão negativa sob o filtro. Remover o grampo e coluna de filtro.
- Com uma mão, use uma pinça limpa para tomar posse do filtro. Dobre o filtro em si, mas não prega. Com a outra mão use o lábio de um tubo de microcentrífuga estéril 2-ml para segurar o filtro. Solte as pinças, em seguida, usá-los para voltar a agarrar ambas as bordas do filtro. Regrip em um ângulo de 45 ° ao redil.
- Colocar o filtro para dentro do tubo 2-ml e libertação de modo que se abre com o lado da amostra virada para dentro. Você pode colocar até dois filtros para o tubo de microcentrífuga estéril 2 ml desta forma. Se usando dois filtros, assegurar que eles se sobrepõem tão pouco quanto possível. Imediatamente congelar (pelo menos -30 ° C).
3. Extracção do aquosa solúveis em metabolitos
- Liofilizar suas amostras durante a noite ou por pelo menos 10 horas.
- Após liofilização, adicionar um triturador de aço inoxidável a cada tubo (Tokken). Adicionar 750 ul de potássio padronizadatampão fosfato de RMN em óxido de deutério (2 H> 90%) com 2,2-Dimetil-2-silapentane-5-sulfonato de (DSS) padrão (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM de K 2 HPO 4, DSS 0,1 mM, pH 7,0, 90% de D 2 O) 2.
- Sonicar as amostras durante 5 minutos a 4 ° C num sonicador água (Bioruptor, Diagenode) para remover o material celular a partir do filtro. Remover os filtros com pinças limpas.
- Dissociação das células utilizando um triturador de moinho (1600 rpm) durante 5 minutos.
- Incubar a 65 ° C com agitação (1400 rpm) num agitador de bancada (Eppendorf) durante 15 minutos.
- Remover o porco de metal com uma pinça limpas, e centrifugar a amostra a 13.000 g durante 5 minutos.
- Colhem-se o sobrenadante directamente para um tubo de RMN para espectroscopia de RMN.
4. Espectroscopia de RMN e Análise de Dados
- Carregue o seu exemplo em um espectrômetro de RMN (aqui, um Bruker DRX-500 equipado com espectrômetroTXI sonda com triplo-eixo gradiente controlado por um computador que executa Xwin-RMN).
- 1D obter 1 H espectros de RMN utilizando métodos adequados previamente publicados 2,15 a partir da interface Xwin-RMN. No presente estudo 1 H espectros de RMN foram registados num espectrómetro de funcionamento DRX-500 em 500,03 MHz a 298 K. sinais de água residuais foram suprimida pela sequência de pulso Watergate, com um tempo de repetição de 1,2 s. 128 transientes foram coletadas para obter 32.000 pontos de dados por espectro.
- Transfira os diretórios de dados de RMN para um PC instalado NMRPipe software 16. Processar os dados brutos e DSS definir como 0 ppm de referência, em seguida, manualmente fase do espectro. Digitalizar os dados espectrais em um conjunto de valores discretos, integrando ou "binning-los" com softwares como o rNMR, Automics, ou usando o pacote FT2B publicamente disponível no site da ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. Em diaé exemplo, os espectros foram integrados entre 0,5 e 10,5 ppm ao longo de 0,032 ppm regiões integral usando ECOMICS e normalizado para tanto DSS ou a intensidade do sinal total. Os dados de saída agora pode ser usado para análise estatística jusante, tais como análise de componentes principais (PCA), utilizando softwares livres como o R 18.
5. Os resultados representativos
Um exemplo de um espectros de RMN H obtidos utilizando os métodos acima são mostrados na Figura 1. Estas amostras, a partir de dois pontos de tempo de uma experiência de microcosmos mostram diferenças claras devido a algas actividades metabólicas. O espectro de 4 dias mostra abundância considerável de picos, particularmente na gama de 3-4 ppm em comparação com a amostra de 1 dia. Estes picos pode ser atribuída aos açúcares produzidos por floração diatomáceas dentro do microcosmo. Em um experimento semelhante comparando o crescimento de comunidades naturais de plâncton na água do mar artificial ou natural, abordagens estatísticas such como principal componente trama pontuação análise (PCA) derivado a partir de espectros de RMN binned pode ser usado para mostrar claras diferenças metabólicas entre os dois tratamentos (Fig. 2), enquanto que as parcelas de carregamento pode identificar picos dentro do espectro que forma a distribuição dos dados . Tais resultados podem ser comparados com dados de outros níveis ómicas, tais como a partir de métodos de impressão digital genómicas (Fig. 3). Estes picos de RMN podem ser consultados individualmente (por exemplo, no BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, ou espectros inteiro pode ser analisados estatisticamente (por exemplo, com SpinAssign em http://prime.psc.riken. jp / ação? = nmr_search ) 2. Neste exemplo, as diferenças entre tratamentos foram devido a uma abundância de picos na região açúcares (3,39 ppm para 4,04 ppm) dos espectros de metabolitos naturais da comunidade de plâncton, e vários picos característicos para as comunidades água do mar artificial foram tentativamente identified como de lactato e formiato usando SpinAssign.
Figura 1. Representativas 1 H espectros de RMN obtido a partir de amostras processadas usando este procedimento. As amostras foram tomadas antes microcosmos (dia 1) e durante (dia 4) bloom de diatomáceas uma intensa. Experiências de RMN foram realizadas num Bruker DRX-500 com sinais normalizados para a altura do pico do padrão interno (DSS; 0 ppm).
Figura 2. Análise de Componentes Principais enredo pontuação (PCA) para espectros de RMN de binned metabolomes das comunidades microbianas de origem natural planctônicas cultivadas em microcosmos com naturais (diamantes abertos) ou água do mar artificial (círculos pretos). Limpar diferenças metabólicas pode ser observado no diagrama de dispersão. Um gráfico de carregamento de uma tal análise pode então ser usado para identificar picos distintos de importância nao sistema; estes picos pode ser ainda analisada conforme necessário.
Figura 3. Um exemplo de multi-omics análise combinando RMN com os dados genéticos. Composição da comunidade com base na electroforese em gel com gradiente desnaturante de 18S (esquerda) e 16S (direita) de genes de rRNA das mesmas amostras como analisados na Figura 2 também mostra os padrões de microbianas distintas da comunidade entre naturais (diamantes abertos) e microcosmos artificiais (círculos pretos) de água do mar. Essa correspondência entre metaboloma e genoma dos sistemas naturais demonstra a utilidade dessa abordagem.
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Discussion
O método de extração e filtração metabólito demonstrado aqui permite a biomassa microbiana planctônica a ser coletadas em quantidade suficiente para metabolômica RMN. Enquanto a extracção apenas de solução aquosa solúveis em metabolitos usando KPi e 1D 1 H RMN é demonstrado, outros solventes de extracção e abordagens espectroscópicas pode ser usado. Um exemplo útil é a utilização de metanol deuterado como solvente semi-polar, que tem sido mostrado para produzir espectros de RMN superiores a partir de amostras heterogéneos e é menos sensível à contaminação por iões paramagnéticos como são encontrados em amostras marinhas 15. Em tais casos, o sedimento da extracção acima deve ser mantido para extracções sucessivas. Nosso trabalho anterior demonstrou a estabilidade do espectro em tempos de incubação tais e temperaturas ea adequação de extração aquosa direto para espectroscopia de RMN 15,20. No entanto investigadores também pode preferir para modificar as etapas de extracção, por exemplo, utilizando um denaração passo para inactivar as enzimas antes da extracção, ou usando-quenching rápida métodos que diferem apenas a congelação das células, como mostrado aqui. Além disso, embora os métodos aqui apresentados são os mais adequados para a observação de alterações proporcionais em metabolitos em todos os tratamentos, se desejado, os filtros podem ser pré-pesados e, em seguida, novamente pesados após filtração da amostra e liofilização para se obter o peso seco, ou o volume de amostra filtrada pode ser usado para obter mais quantitativos dados de origem metabolito.
Em última análise, a utilidade de RMN para amostras planctônicas é limitado pela quantidade de massa que pode com sucesso ser recolhida; mesmo alta densidade culturas podem exigir grandes volumes (> 100 ml) para se obter biomassa seca suficiente. No entanto, dentro de um quadro experimental rotulagem isótopo estável, em experimentos de micro ou mesocosmo, 2D 1 H-13 C heteronucleares simples coerência quântica (HSQC) abordagens são possíveis. Além disso, temos adicionalmente utilizados 47 -filtros mm e tubos de 5 ml de polipropileno para aumentar a quantidade de biomassa que podem ser coletadas para a extração, como volumes ainda maiores pode ser necessário (isto é, L> 2) para as comunidades naturais de águas oligotróficas, por exemplo, onde a densidade de células são baixos.
A filtração é vantajoso em relação centrifugação, tal como é nossa observação de que alguns taxa menor microbiana (bactérias heterotróficas particularmente pequenos), muitas vezes não pelete bem. A filtração pode ser realizado manualmente no campo, e os volumes filtrados são limitados apenas pelo número de filtros disponíveis. Além disso, os meios de excesso ou água pode ser removida desta maneira, e as amostras podem ser enxaguados, se necessário. Claro que, mesmo com filtração, a comunidade recolhidos serão limitadas a uma fracção de tamanho para baixo para o corte do filtro, que neste exemplo é de 0,22 um.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Grants-in-Aid para a Investigação Científica para impugnar pesquisa exploratória (JK), e da Investigação Científica (A) (JK e SM) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão . A Riken FPR comunhão (RCE) forneceu apoio adicional. Os autores expressam sua gratidão para com os drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto para assistência técnica com RMN e análises estatísticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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