Summary
Une méthode pour l'extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.
Abstract
L'environnement métabolomique est un domaine émergent qui est de promouvoir la compréhension nouvelle dans la façon dont les organismes de répondre et d'interagir avec l'environnement et l'autre au niveau biochimique 1. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est l'un de plusieurs technologies, y compris chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), avec la promesse considérable pour de telles études. Avantages de la RMN est qu'il est adapté à des analyses non ciblées, fournit des informations structurelles et les spectres peuvent être interrogés de façon quantitative et statistique des bases de données récemment disponibles contre des spectres métabolite individuelle 2,3. En outre, les données spectrales de RMN peuvent être combinées avec des données provenant d'autres niveaux omique (transcriptomique, par exemple, la génomique) pour fournir une compréhension plus complète des réponses physiologiques des taxons les uns aux autres et l'environnement 4,5,6. Cependant, la RMN est moins sensible que d'autres techniques de métabolomique, ce qui rend difficile à apnappe à des systèmes microbiens naturels où les populations d'échantillons peuvent être concentrations de faible densité et de son métabolite faibles par rapport à des métabolites de bien défini et facilement extractibles sources telles que les tissus entiers, ou de cellules biofluides-cultures. Par conséquent, les quelques directs sur l'environnement métabolomique de microbes réalisées à ce jour ont été limitées à la culture à base de ou facilement définies à haute densité tels que les écosystèmes d'accueil-symbiotes systèmes, construits co-cultures ou des manipulations de l'environnement intestin, où l'étiquetage des isotopes stables peuvent être en outre utilisé pour amplifier les signaux de RMN 7,8,9,10,11,12. Les méthodes qui facilitent la concentration et la collecte des métabolites de l'environnement à des concentrations appropriées pour la RMN font défaut. Depuis l'attention récente a été donnée aux métabolomique de l'environnement d'organismes dans le milieu aquatique, où une grande partie du flux d'énergie et des matériaux est médiée par la communauté planctonique 13,14, nous avons développé une méthode pour la concentrationtion et l'extraction de l'ensemble de la communauté-métabolites de systèmes microbiens planctoniques par filtration. Disponibles dans le commerce hydrophiles poly-1 ,1-difluoroéthylène (PVDF) filtres sont spécialement traitées pour supprimer complètement extractibles, ce qui peut apparaître autrement en tant que contaminants dans les analyses ultérieures. Ces filtres traités sont ensuite utilisés pour filtrer des échantillons environnementaux ou expérimentaux d'intérêt. Filtres contenant l'échantillon humide sont lyophilisée et une solution aqueuse-solubles métabolites sont extraits directement de la spectroscopie RMN classique en utilisant un tampon phosphate de potassium standardisé d'extraction 2. Données issues de ces méthodes peuvent être analysées statistiquement pour identifier les tendances significatives, ou intégrée à d'autres niveaux omique pour la compréhension globale de la communauté et la fonction des écosystèmes.
Protocol
1. Préparation du filtre pour éliminer extractibles
- Utilisez de 25 mm de diamètre de 0,22 um des pores de taille Durapore PVDF filtres hydrophiles (Millipore). Placer les filtres dans un bécher propre de 500 ml en pyrex à l'aide des pincettes. Pré-rincer trois fois avec de l'eau distillée. Swirl bien que vous rincer pour éviter les filtres de coller les uns aux autres. Ajouter 300 ml Milli-Q (Millipore) ou l'équivalent en eau de qualité. Autoclave pour faciliter l'enlèvement complet des substances extractibles par les filtres.
- Décanter le Milli-Q et encore rincer trois fois les filtres, cette fois avec Milli-Q. L'utilisation de filtres lieu pincettes individuelles sur une surface propre et sec (comme une feuille d'aluminium) et soit à sec à une température raisonnable (par exemple 37 ° C) ou l'air sec. Les filtres sont maintenant prêt à utiliser.
2. Filtration des matières échantillon
- Pour démontrer ce protocole, un acier inoxydable Millipore 3-lieu collecteur filtrant avec des colonnes de microanalyse de 25 mm avec filtre en verre prend en chargeet une pompe mécanique sont utilisés. En utilisant une technique aseptique, placer un seul filtre de 25 mm sur la base de la colonne de filtre, appliquer de la colonne et serrer ensemble.
- Chargez 15 ml de l'échantillon à la colonne, ouvrez l'obturateur sur le collecteur filtrant, et tourner sur la pompe. Filtrer sous une légère pression pour minimiser la rupture des cellules (<5 kPa). D'autres pompes, comme la main ou une pompe péristaltique peut être adapté à ce protocole. Pour les échantillons à faible densité, des additions successives d'eau peut être nécessaire, ne laissez pas le filtre est à sec pendant une période prolongée de temps entre les additions d'eau.
- Pour les échantillons marins, après avoir filtré l'échantillon, vous pouvez effectuer une eau douce de rinçage en option pour réduire les ions paramagnétiques résiduelles dans votre échantillon et sur le filtre. Cela peut aider avec le réglage plus précis de l'aimant du spectromètre. Il suffit de douceur ajouter un petit volume d'eau et filtrer à travers votre échantillon prélevé à la fin.
- Une fois que le filtrage est terminé, éteignez la pompe, et de laisser le robinet OPEn Il ya donc encore une pression négative dans le filtre. Retirez la pince et de la colonne filtre.
- Avec une main, utilisez des pinces propres pour prendre la main sur le filtre. Repliez le filtre à travers lui-même, mais ne se froisse pas. Avec votre autre main utiliser la lèvre d'un microtube de 2 ml stérile à maintenir enfoncé le filtre. Libérer la pince de les utiliser pour re-saisir les deux bords du filtre. Regrip à un angle de 45 ° au bercail.
- Placez le filtre dans le tube de 2 ml et la libération de sorte qu'il s'ouvre avec le côté de l'échantillon vers l'intérieur. Vous pouvez placer jusqu'à deux filtres dans le stérile tube de 2 ml de cette façon. Si vous utilisez deux filtres, veiller à ce qu'ils se chevauchent aussi peu que possible. Geler immédiatement (au moins à -30 ° C).
3. Extraction d'une solution aqueuse-solubles métabolites
- Lyophiliser vos échantillons pendant la nuit ou pendant au moins 10 heures.
- Après lyophilisation, ajouter un concasseur acier inoxydable à chaque tube (Tokken). Ajouter 750 ul de potassium normaliséetampon phosphate de RMN en oxyde de deutérium (2 H> 90%) avec le 2,2-diméthyl-2-silapentane-5-sulfonate (DSS) norme (KPI; 38,3 mM KH 2 PO 4, 61,7 mM de K 2 HPO 4, DSS 0.1 mM, pH 7,0, 90% de D 2 O) 2.
- Sonication des échantillons pendant 5 minutes à 4 ° C dans un sonicateur eau (Bioruptor, Diagenode) pour enlever le matériau cellulaire provenant du filtre. Retirer les filtres avec des pincettes propres.
- Dissocier les cellules en utilisant un broyeur moulin (1600 rpm) pendant 5 minutes.
- Incuber à 65 ° C avec agitation (1400 rpm) sur un agitateur de paillasse (Eppendorf) pendant 15 minutes.
- Retirer le porc de métal avec des pincettes propres, et centrifuger l'échantillon à 13000 g pendant 5 minutes.
- Prélever le surnageant directement à un tube de RMN pour la spectroscopie RMN.
4. La spectroscopie RMN et analyse des données
- Chargez votre échantillon dans un spectromètre de RMN (ici, un Bruker DRX-500 spectromètre équipé d'Sonde TXI avec triple axe du gradient contrôlé par un ordinateur exécutant xwin-RMN).
- Obtenir 1D spectres RMN 1 H en utilisant des méthodes appropriées publiées précédemment 2,15 à partir de l'interface xwin-RMN. Dans la présente étude 1 H RMN ont été enregistrés sur une exploitation DRX-500 spectromètre à 500,03 MHz à 298 K. signaux d'eau résiduels ont été supprimées par la séquence d'impulsions du Watergate, avec un temps de répétition de 1,2 s. 128 transitoires ont été recueillies pour obtenir 32.000 points de données par spectre.
- Transférer les répertoires de données RMN à un PC installé le logiciel NMRPipe 16. Traiter les données brutes et de la DSS ensemble comme référence 0 ppm ensuite manuellement éliminer les spectres. Numérisez les données spectrales dans un ensemble de valeurs discrètes, en intégrant ou «binning» eux avec des logiciels tels que rNMR, Automics, ou en utilisant le paquet FT2B la disposition du public sur le site Web ECOMICS ( https://database.riken.jp/ecomics/ ) 3,17. En eest, par exemple, les spectres ont été intégrés entre 0,5 et 10,5 ppm sur 0,032 ppm régions intégrales en utilisant ECOMICS et normalisées pour soit DSS ou de l'intensité totale du signal. Les données de sortie peuvent maintenant être utilisées pour l'analyse statistique en aval tels que l'analyse en composantes principales (ACP) à l'aide des logiciels gratuits comme R 18.
5. Les résultats représentatifs
Un exemple de spectres RMN 1 H obtenu en utilisant les méthodes ci-dessus sont présentés dans la figure 1. Ces échantillons, à partir de deux points dans le temps d'une expérience en microcosme montrent des différences claires en raison de l'activité métabolique des algues. Le jour 4 spectre montre abondance considérable de pics, en particulier dans la gamme 3-4 ppm par rapport à l'échantillon une jour. Ces pics peuvent être attribués à des sucres produits par la floraison des diatomées dans le microcosme. Dans une expérience similaire de comparer la croissance des communautés planctoniques naturelles en eau de mer artificielle ou naturelle, les approches statistiques sette comme tracé analyse en composantes principales score (PCA) provenant de spectres RMN binned peut être utilisé pour montrer clairement les différences métaboliques entre les deux traitements (Fig. 2), alors que les parcelles de chargement peut identifier les pics dans les spectres que la forme de la distribution des données . Ces résultats peuvent être comparés avec les données de niveaux omique autres, tels que des méthodes empreintes génomiques (Fig. 3). Ces pics de RMN peut être interrogé individuellement (par exemple à la BMRB; http://www.bmrb.wisc.edu/ ) 19, ou des spectres entière peut être analysé statistiquement (par exemple avec SpinAssign à http://prime.psc.riken. jp /? action = nmr_search ) 2. Dans cet exemple, les différences entre les traitements étaient dus à une abondance de pics dans la région sucres (3,39 ppm à 4,04 ppm) des spectres de métabolites naturels de la communauté de plancton, et plusieurs pics caractéristiques des communautés d'eau de mer artificielle étaient provisoirement identified que le lactate et le formate en utilisant SpinAssign.
Figure 1. Représentant spectres RMN 1 H obtenu à partir d'échantillons transformés en utilisant cette procédure. Échantillons ont été prélevés avant Microcosm (jour 1) et pendant (jour 4) une prolifération de diatomées intense. Des expériences de RMN ont été effectuées sur un appareil Bruker DRX-500 avec des signaux normalisés à la hauteur du pic standard interne (DSS; 0 ppm).
Figure 2. L'analyse des principaux composants score de parcelle (PCA) pour les spectres RMN binned de metabolomes de d'origine naturelle communautés planctoniques microbiens cultivés dans des microcosmes avec naturel (losanges vides) ou d'eau de mer artificielle (cercles noirs). Effacer les différences métaboliques peuvent être observés dans le nuage de points. Une parcelle de chargement d'une telle analyse peut ensuite être utilisé pour identifier les pics distincts d'importance dansle système; ces pics peuvent être analysées en fonction des besoins.
Figure 3. Un exemple de multi-omique analyse combinant la RMN avec les données génomiques. Composition de la communauté basés sur l'électrophorèse sur gel en gradient de dénaturation de 18S (à gauche) et 16S (à droite) ARNr provenant des mêmes échantillons analysées dans la figure 2 montre également différents schémas de répartition des communautés microbiennes naturelles entre (losanges vides) et artificiels (cercles noirs) microcosmes d'eau de mer. Cette correspondance entre le métabolome et du génome de systèmes naturels démontre l'utilité de cette approche.
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Discussion
La méthode d'extraction de filtration et de son métabolite démontré ici permet de biomasse planctonique microbienne être collectées en quantité suffisante pour la métabolomique RMN. Bien que l'extraction d'une solution aqueuse ne solubles métabolites en utilisant des KPI et 1D 1 H RMN est démontrée, les solvants d'extraction d'autres approches et spectroscopiques peuvent être utilisés. Un exemple intéressant est l'utilisation de méthanol deutéré comme solvant semi-polaire, qui a été montré pour produire des spectres RMN supérieure à partir d'échantillons hétérogènes et est moins sensible à la contamination par des ions paramagnétiques comme on en trouve dans des échantillons marins 15. Dans de tels cas, le culot de l'extraction ci-dessus doivent être conservés pendant extractions successives. Nos travaux antérieurs ont montré la stabilité des spectres sous les durées d'incubation et des températures telles et la pertinence de l'extraction aqueuse directe pour la spectroscopie RMN 15,20. Cependant les chercheurs peuvent aussi préférer modifier les étapes d'extraction, par exemple en utilisant un denaétape de Turing pour inactiver les enzymes avant l'extraction, ou en utilisant des méthodes de trempe rapide qui diffèrent de la simple congélation des cellules, comme indiqué ici. En outre, alors que les méthodes présentées ici sont le mieux adapté pour observer les changements proportionnels en métabolites à travers les traitements, si vous le souhaitez, les filtres peuvent être pré-pesés, puis pesés à nouveau après filtration de l'échantillon et de la lyophilisation pour obtenir le poids à sec, ou le volume d'échantillon filtré peut être utilisé pour obtenir de plus amples données quantitatives sources métabolites.
En fin de compte, l'utilité de la RMN pour les échantillons planctoniques est limitée par la quantité de masse qui peuvent être collectées avec succès; même à haute densité des cultures peut exiger de grands volumes (> 100 ml) pour obtenir suffisamment de biomasse sèche. Toutefois, dans un cadre, l'étiquetage expérimentale des isotopes stables dans les expériences de micro-ou en mésocosme, 2D 1 H-13 C hétéronucléaires simples cohérence quantique (HSQC) approches sont possibles. En outre, nous avons en outre utilisé 47 -filtres mm et des tubes en polypropylène de 5 ml d'augmenter la quantité de biomasse qui peut être recueilli pour l'extraction, les volumes encore plus importants peuvent être nécessaires (c.-à-> 2 L) pour les communautés naturelles, par exemple à partir des eaux oligotrophes où les densités cellulaires sont faibles.
La filtration est plus avantageux que la centrifugation comme il est de notre observation selon laquelle certains taxons petite microbienne (bactéries hétérotrophes en particulier les petites) font souvent pas bien à granulés. La filtration peut être effectuée manuellement dans le domaine, et les volumes filtrés ne sont limitées que par le nombre de filtres disponibles. En outre, les supports en excès ou de l'eau peut être retiré de cette manière, et les échantillons peuvent être rincés, si nécessaire. Bien sûr, même avec filtration, la communauté recueillie sera limitée à une fraction de taille vers le bas pour la coupure du filtre, qui dans cet exemple est de 0,22 um.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par des subventions en aide à la recherche scientifique pour contester la recherche exploratoire (JK), et la recherche scientifique (A) (JK et SM) du ministère de l'Education, la Culture, des Sports, des Sciences et Technologie, Japon . Un RIKEN FPR bourse (RCE) a fourni un appui supplémentaire. Les auteurs expriment leur gratitude à MM. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama et Mami Okamoto pour l'assistance technique avec la RMN et les analyses statistiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | EMD Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | EMD Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | EMD Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker Corporation | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
References
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