Lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर stably विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं स्तनधारी और पूरे जीवों में विभिन्न प्रेरक अणुओं या रिपोर्टर constructs व्यक्त करने के लिए सबसे प्रभावी वाहनों रहे हैं. यहाँ हम कैसे pseudoviral कणों में lentivector अभिव्यक्ति constructs के पैकेज के लिए और लक्ष्य pseudoviral कणों का उपयोग कर कक्षों transduce पर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7.
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter.
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein.
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.
इस वायरल पैकेजिंग और लक्ष्य कोशिकाओं प्रोटोकॉल के पारगमन को एसबीआई वायरल पैकेजिंग अभिकर्मकों के साथ प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. अन्य अभिकर्मकों के प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रभावित कर सकता है. यह प्रोटोकॉल केवल से lentiviral उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है और हो वायरस या pseudoviruses के अन्य प्रकार के उत्पादन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता.
सफल वायरल पैकेजिंग कई महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर है. 293TN कोशिकाओं SV40 बड़ी टी प्रतिजन, जो बिल्कुल सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में lentiviral कणों के स्राव के लिए आवश्यक है व्यक्त करते हैं. घनत्व जिस पर 293TN कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में कर रहे हैं PureFection अभिकर्मक के लिए आदेश में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के लिए पर्याप्त और कोशिकाओं में lentivector के पैकेजिंग प्लास्मिड हस्तांतरण. एक बूंद के लिहाज से अच्छी तरह से थाली घूमता के बाद ढंग से टिशू कल्चर थाली लिए PureFection मिश्रण जोड़ने से पैकेजिंग plasmids के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैऔर lentivector कोशिकाओं के सभी भर में निर्माण. वैक्टर करने के लिए उचित रूप से वितरित करने में विफलता अपर्याप्त lentiviral कणों का उत्पादन किया जा रहा में परिणाम कर सकते हैं. वायरल पैकेजिंग प्रतिक्रिया उच्च अनुमापांक वायरस के उत्पादन के लिए बढ़ाया जा सकता है ऊतक संस्कृति प्लेट की सतह क्षेत्र के आधार पर. एक थाली है निर्माण करने के लिए पैक किया जाना चाहिए प्रति 293TN कोशिकाओं के कई ऊतक संस्कृति बर्तन करने के लिए चुन सकते हैं. वायरल supernatants की एकाग्रता विशेष रूप से उच्च अनुमापांक वायरस बनाने में सहायक है. कोशिकाओं के कई प्लेटों से वायरल सतह पर तैरनेवाला और संयुक्त में, vivo प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है, या कोशिकाओं है कि transduce मुश्किल कर रहे हैं के लिए.
उत्पादन lentiviral कणों Titering एक सही MOI के लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन के लिए उपयोग की गणना के लिए महत्वपूर्ण है. MOI जानते हुए भी कि किसी दिए गए पारगमन में इस्तेमाल किया गया था इस घटना में है कि पारगमन सफल नहीं है में समस्या निवारण सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एक MOI है कि का उपयोगबहुत कम बहुत कुछ लक्ष्य निर्माण के हित व्यक्त कोशिकाओं में हो सकता है. एक MOI कि बहुत अधिक है का प्रयोग, तथापि, लक्ष्य कोशिकाओं है कि तनाव के लक्षण दिखाने में परिणाम कर सकते हैं. लक्ष्य एक MOI कि अधिकतम निर्माण के ब्याज की अभिव्यक्ति है, जबकि कोशिकाओं के स्वास्थ्य के संरक्षण का उपयोग है. जब तक हम एक titering qPCR आधारित प्रोटोकॉल है कि HT1080 कोशिकाओं में lentiviral निर्माण के एकीकृत प्रतियां उपायों की सिफारिश, अन्य titering के दृष्टिकोण ऐसे p24 एलिसा या GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत के अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है,.
लक्ष्य कोशिकाओं के सफल पारगमन भी कई महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर है. TransDux एक अद्वितीय संक्रमण अभिकर्मक है कि उच्च पारगमन क्षमता के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन है कि कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है. TransDux polybrene, जो अक्सर लक्ष्य कोशिकाओं को विषाक्त के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. TransDux के लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन में शामिल वायरल कणों पर आरोप बेअसर में मदद करता है और सेल में वायरस की अनुमति देता हैहै. के बाद से TransDux कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है, एक lentiviral कण कोशिकाओं के साथ संपर्क में रहने के लिए 72 घंटे (जो समय पर वायरल constructs मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत है) के लिए की अनुमति देते हैं, इस प्रकार की संभावना में वृद्धि कर सकते हैं वायरल कणों सेल में प्रवेश. कुछ कठिन करने के लिए transduce कोशिकाओं के लिए, transductions लगातार दिन पर दोहराया जा सकता है लिए पारगमन दक्षता को बढ़ावा देने. उदाहरण के लिए, 1 दिन कोशिकाओं transduce, कोशिकाओं 2 दिन आराम करने की अनुमति है, और तब कक्षों 3 दिन फिर transduce. यह शुरुआत चयन, आगे के प्रयोग या लक्ष्य कोशिकाओं के लक्षण वर्णन से पहले पिछले पारगमन के बाद 72 घंटे प्रतीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
कुशल वायरल पैकेजिंग भी है है lentiviral निर्माण के आकार पर निर्भर 5 'और 3'LTR क्षेत्रों के बीच,. Lentiviral निर्माण के इस अनुभाग के लगभग 9 केबी या कम, जो देशी एचआईवी जीनोम के आकार से मेल खाती होनी चाहिए. 9 केबी सकता डे से अधिकक्रीज उत्पादन pseudoviral कणों की अनुमापांक. नई प्रौद्योगिकी, ऐसे piggyBac transposon वैक्टर के रूप में, transgenes की विश्वसनीय, स्थिर एक अभिकर्मक के माध्यम से 100 केबी के लिए एकीकरण के लिए अनुमति देते हैं. यह दृष्टिकोण constructs कि lentiviral वैक्टर आकार मामलों में जहां यह संभव है करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं transfect, सीमा से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और की आवश्यकता होती है एक वायरल पैकेजिंग 9,10 कदम नहीं की अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.
pseudoviral कणों का उत्पादन इस प्रोटोकॉल का उपयोग संक्रामक में है कि वे सबसे स्तनधारी सेल प्रकार को संक्रमित कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उत्पादों, लेकिन तीसरी पीढ़ी BIOSAFE में है कि वे गैर replicative और स्वयं निष्क्रिय pseudoviruses के उत्पादन कर रहे हैं. इसलिए, एक बार में transduced लक्ष्य कक्षों या जानवर, लक्ष्य कक्षों या जानवरों संक्रामक या संक्रामक नहीं हैं. हालांकि एक जैव सुरक्षा से अनुशंसित नहीं है कि तीसरी पीढ़ी BIOSAFE नहीं हैं अन्य lentivector प्लास्मिड का प्रतिस्थापन संभव हैपरिप्रेक्ष्य. वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल और लक्ष्य कोशिकाओं के बाद पारगमन जैवसुरक्षा स्तर 2 के तहत बाहर किया जाना चाहिए, एनआईएच 11 के दिशा निर्देशों के अनुसार, और शोधकर्ताओं हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनने के लिए जब वायरल कणों से निपटने चाहिए. खेतों में प्रयुक्त किए गए 293TN उत्पादक कोशिकाओं, एक उपयुक्त biohazard कंटेनर में वायरल कणों, और प्रयोज्य pipettes ट्यूबों का निपटारा किया जाना चाहिए. पुर्नप्रयोग योग्य pipettes और कांच के बने पदार्थ ब्लीच साथ decontaminated और वाष्पदावी विसंक्रण कर्मियों के जोखिम को कम किया जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
हम इन प्रोटोकॉल के विकास और परीक्षण में उनके समर्थन के लिए कर्मचारियों और एसबीआई में वैज्ञानिकों को स्वीकार करना चाहते हैं.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |