Lentiviral uttrykk vektorer er de mest effektive biler for stabilt uttrykke forskjellige effektor molekyler eller reporter konstruksjoner i å dele og ikke-delende celler hos pattedyr og hele organismer. Her tilbyr vi en protokoll om hvordan å pakke lentivector uttrykk konstruksjoner i pseudoviral partikler og til transduce målceller ved hjelp av pseudoviral partikler.
Som med standard Plasmid vektorer, er det mulig å transfektere lentivectors i plasmidet form til celler med lav til middels effektivitet for å få forbigående uttrykk av effektorer. Emballasje lentiviral uttrykk konstruerer inn pseudoviral partikler, men lar opptil 100% transduksjon, selv med vanskelige å transfektere celler, slik som primær, stem, og differensierte celler. Videre gjør lentiviral leveransen ikke produsere de spesifikke cellulære responser som typisk assosieres med kjemiske transfections, for eksempel celledød som følge av toksisitet av transfeksjon reagens 1, 2. Når transduced inn målceller, integrerer lentiviral konstruktet inn genomisk DNA og gir stabil uttrykk for den lille hårnål RNA (shRNA), cDNA, mikroRNA eller reporter gen 3, 4. Målcellene stabilt uttrykker effektor molekylet kan isoleres ved hjelp av en valgbar markør som finnes i uttrykk vektor konstruere eksempel puromycin eller GFP. Etter pseudoviral partikler infisere målcellene, kan de ikke gjenskape innenfor målceller fordi de virale strukturelle genene er fraværende og de lange terminale repetisjoner (liter) er designet for å være selv-inaktivere ved transduksjon 5, 6.
Det er tre hovedkomponenter som er nødvendige for effektiv lentiviral emballasje 1, 5, 6, 7.
En oversikt over viral produksjonen protokollen kan sees i figur 1. Viral produksjonen starter ved co-transfecting 293TN produsent celler med lentiviral uttrykk vektor og emballasje plasmider. Viruspartikler utskilles i media. Etter 48-72 timer cellekultur media er høstet. Cellular rusk blir fjernet fra cellekultur media, og de virale partikler er påskyndet av sentrifugering med PEG-it for konsentrasjon. Produserte lentiviral partiklene blir så titered og kan brukes til å transduce målceller. Detaljer om viral titering er ikke inkludert i denne protokollen, men kan finnes på:
ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av spesifikke produkter angitt. Andre reagenser kan erstattes, men de samme resultatene kan ikke garanteres.
Dette viral emballasje og transduksjon av målcellene protokollen er optimalisert for bruk med SBI sin viral emballasje reagenser. Bytte av andre reagenser kan påvirke utfallet av protokollen. Denne protokollen har bare blitt optimalisert for lentiviral produksjon og kan ikke være egnet for produksjon av andre typer virus eller pseudoviruses.
Vellykket viral emballasje er avhengig av flere viktige skritt. De 293TN cellene uttrykker SV40 store T antigen, som er absolutt nødvendig for utskillelse av lentiviral partiklene inn i cellekultur supernatanten. Tettheten på hvor 293TN cellene er på tidspunktet for transfeksjon er spesielt viktig for at PureFection reagens til tilstrekkelig overføre lentivector og emballasje plasmider inn i cellene. Legge til PureFection blandingen til vevskultur plate i en drop-klok måte fulgt av grundig virvlende platen er viktig for spredning av emballasje plasmiderog lentivector konstruere gjennom alle cellene. Unnlatelse av å hensiktsmessig distribuere vektorene kan resultere i utilstrekkelig lentiviral partikler blir produsert. Viral emballasje reaksjonen kan skaleres opp for produksjon av høy titer virus, basert på arealet av vevet kultur platene. Man kan velge å plate flere vevskulturstudier retter av 293TN celler per konstruksjon som må pakkes. Konsentrasjon av de virale supernatants er spesielt nyttig i å skape høy-titer virus. Viral supernatanten fra flere plater av celler kan kombineres og konsentrert til bruk i in vivo eksperimenter, eller for celler som er vanskelige å transduce.
Titering de produserte lentiviral partiklene er viktig for beregning av en nøyaktig MOI å bruke for transduksjon av målcellene. Knowing MOI som ble brukt i en gitt transduksjon gjør feilsøking i tilfelle at transduksjon er ikke vellykket. For eksempel bruker en MOI som erfor lav, kan resultere i svært få målceller uttrykker konstruksjon-of-interesse. Bruke en MOI som er for høy, men kan resultere i målceller som viser tegn på stress. Målet er å bruke en MOI som maksimerer uttrykk for konstruksjon-of-interesse og samtidig bevare helsen til cellene. Selv om vi anbefaler en qPCR-basert titering protokoll som måler integrerte eksemplarer av lentiviral konstruktet i HT1080 celler, kan andre titering tilnærminger også brukes, slik som p24 ELISA eller estimering av prosent av GFP-positive celler.
Vellykket transduksjon av målcellene er også avhengig av flere viktige faktorer. TransDux er en unik infeksjon reagens som gir høy transduksjon effektivitet, men det er ikke giftig for cellene. TransDux kan brukes i stedet for polybrene, som ofte er giftig for målcellene. Inkludering av TransDux i transduksjon av målcellene bidrar til å nøytralisere kostnader på viruspartikler og lar viruset inn i cellens. Siden TransDux er ikke giftig for cellene, kan man la lentiviral partiklene til å forbli i kontakt med cellene i opptil 72 timer (det tidspunkt de virale constructs har integrert i vertscellen genomet), og dermed øke sannsynligheten for viruspartikler inn i cellen. For noen er vanskelig å transduce celler, kan transductions gjentas på påfølgende dager for å øke transduksjon effektivitet. For eksempel, transduce cellene i dag en, la cellene hvile på dag 2, og deretter transduce cellene igjen på dag tre. Det er viktig å vente 72 timer etter siste transduksjon før begynnelsen utvalg, ytterligere eksperimenter eller karakterisering av målcellene.
Effektiv viral emballasje er også avhengig av størrelsen på lentiviral konstruere, mellom 5 'og 3'LTR regioner. Denne delen av lentiviral konstruksjonen bør være ca 9 kb eller mindre, noe som tilsvarer størrelsen på de innfødte HIV genomet. Overskridelse 9 kb kan deskrukk titer av de produserte pseudoviral partikler. Ny teknologi, for eksempel piggyBac transposon vektorer, tillate for pålitelig, stabil integrering av transgener opptil 100 kb gjennom en enkelt transfeksjon. Denne tilnærmingen kan brukes til konstruksjoner som overstiger størrelsen grensen for lentiviral vektorer, i tilfeller der det er mulig å transfektere målceller, og gir den ekstra fordelen av ikke krever en viral emballasje steg 9,10.
De pseudoviral partikler produsert ved hjelp av denne protokollen er smittsom i at de kan infisere mest pattedyr celletyper. Produktene som brukes i denne protokollen, men er tredje generasjons biosafe i at de produserer ikke-replicative og selv-inaktivere pseudoviruses. Derfor, når transduced inn målcellene eller dyr, målcellene eller dyr ikke er smittsom eller smittsom. Bytte av andre lentivector plasmider som ikke er tredje generasjons biosafe er mulig men ikke anbefalt fra en biosikkerhetperspektiv. Den viral produksjon protokollen og påfølgende transduksjon av målcellene bør utføres under biosikkerhetsnivå 2, ifølge NIH retningslinjer 11, og forskerne bør alltid ha en lab frakk og hansker ved håndtering av viruspartikler. Brukte 293TN produsent celler, bør rør av viruspartikler og disponibel pipetter kastes i en egnet beholder biohazard. Gjenbrukbare pipetter og glass skal dekontamineres med blekemiddel og autoklavering for å redusere eksponeringen av personell.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke de ansatte og forskere ved SBI for deres støtte i utvikling og testing av disse protokollene.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |