Lentivirala expressionsvektorer är de mest effektiva vehiklar för stabilt uttrycker olika effektor-molekyler eller konstruktioner reportergrupper i delande och icke delande däggdjursceller och hela organismer. Här erbjuder vi ett protokoll om hur man paketerar lentivector uttryck konstruktioner i pseudoviral partiklar och att omvandla målceller med hjälp av pseudoviral partiklarna.
Som med standardmetoder plasmidvektorer, är det möjligt att transfektera lentivectors i plasmiden formen in i celler med låg-till-mediet effektivitet för att erhålla transient expression av effektorer. Förpackning lentivirala expressionskonstruktioner i pseudoviral partiklar, men medger att upp till 100% transduktion, även med svåra att transfektera celler, såsom primära, stam, och differentierade celler. Dessutom producerar inte lentivirala leverans inte de specifika cellulära svar som normalt förknippas med kemiska transfektioner, såsom celldöd som följer toxicitet transfektionsreagens 1, 2. När transducerade in i målceller, integrerar den lentivirala konstruktionen i genomisk DNA och tillhandahåller stabilt uttryck av den lilla hårnålen RNA (shRNA), cDNA-, mikro-RNA eller reportergen 3, 4. Mål-celler som stabilt uttrycker den verkställande molekylen kan isoleras med användning av en selekterbar markör som finns i expressionsvektorn konstruktion såsom puromycin eller GFP. Efter pseudoviral partiklar infektera målceller, kan de inte replikera inuti målcellerna eftersom de virala strukturella generna är frånvarande och de långa terminala upprepningarna (LTR) är utformade för att vara själv-inaktiverande på transduktion 5, 6.
Det finns tre huvudsakliga komponenter som krävs för effektiv lentiviral förpackning 1, 5, 6, 7.
En översikt av den virala produktionen protokoll kan ses i figur 1. Viral produktion börjar genom att samtransfektera 293TN producerande celler med den lentivirala vektor för uttryck och plasmiderna förpackningar. Viruspartiklar utsöndras i mediet. Efter 48-72 timmar av cellodlingsmedia skördas. Cellrester avlägsnas från cellodlingsmedier, och de virala partiklarna utfälldes genom centrifugering med PEG-det för koncentrering. Framställda lentivirala partiklama får därpå titrerades och kan användas för att transducera målceller. Information om viral titrering ingår inte i detta protokoll, men kan hittas på:
ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
Detta protokoll har optimerats med hjälp av specifika produkter som anges. Andra reagens kan vara substituerad, men samma resultat kan inte garanteras.
Detta viral förpackning och transduktion av målceller protokoll har optimerats för användning med SBI: s virala förpackningar reagens. Substitution av andra reagenser kan påverka resultatet av protokollet. Detta protokoll har endast optimerats för lentiviral produktion och får inte vara lämplig för att producera andra typer av virus eller pseudoviruses.
Framgångsrik viral förpackningar är beroende av flera viktiga steg. De 293TN celler uttrycker SV40 stor T-antigen, vilket är absolut nödvändig för utsöndring av de lentivirala partiklarna in i cellkultursupernatanten. Densitet vid vilken 293TN cellerna är vid tidpunkten för transfektion är särskilt viktigt för att den PureFection reagens för att tillräckligt överföra lentivector och plasmider förpackningsmaterial in i cellerna. Tillsats av den PureFection blandningen till vävnadsodlingsplattan i en droppvis sätt följt av noga virvling plattan är viktig för spridning av det förpackningsmaterial plasmideroch lentivector konstruera hela alla cellerna. Misslyckande att korrekt fördela de vektorer kan resultera i otillräcklig lentivirala partiklar som produceras. Den virala förpackningen Reaktionen kan skalas upp för produktion av höga titrar viruset, baserad på ytan av de vävnadsodlingsplattor. Man kan välja att plattan flera vävnadsodlingsskålar av 293TN celler per konstrukt som ska paketeras. Koncentration av de virala supernatanterna är särskilt användbart för att skapa hög titer virus. Viral supernatant från multipla plattor av celler kan kombineras och koncentreras för användning i in vivo experiment, eller för celler som är svåra att transducera.
Titrering de producerade lentivirala partiklarna är viktig för att beräkna en korrekt MOI att använda för transduktion av målceller. Att veta MOI som användes i ett visst transduktion gör felsökning i händelse av att transduktionen inte lyckas. Exempelvis med användning av en MOI som äralltför låg kan resultera i mycket få målceller som uttrycker konstruktionen av intresse. Användning av en MOI som är alltför hög kan emellertid resultera i målceller som uppvisar tecken på stress. Målet är att använda en MOI som maximerar uttryck av konstruktionen av intresse och samtidigt bevara hälsan hos cellerna. Även om vi rekommenderar en qPCR-baserat titrering protokoll som mäter integrerade kopior av lentiviral konstruktionen i HT1080 celler kan andra titrering metoder också användas, såsom p24 ELISA eller uppskattning av den procentuella GFP-positiva celler.
Framgångsrik transduktion av målceller är också beroende av flera viktiga faktorer. TransDux är en unik infektion reagens som möjliggör höga transduktionsmekanismer effektivitet, men det är inte giftigt för celler. TransDux kan användas i stället för polybren, som ofta är toxiska för målcellerna. Införandet av TransDux i transduktion av målceller hjälper till att neutralisera eventuell på de virala partiklarna och låter viruset in i cellens. Eftersom TransDux inte är toxisk för cellerna, kan man tillåta de lentivirala partiklarna att förbli i kontakt med cellerna under upp till 72 timmar (den tid vid vilken de virala konstruktionerna har integrerats i värdcellens genom), vilket ökar sannolikheten för att virala partiklar som kommer in i cellen. För vissa är svåra att omvandla celler kan transduktioner upprepas på varandra följande dagar för att öka transduktion effektivitet. Exempelvis transducera celler på dag 1, tillåta cellerna att vila på dag 2, och därefter omvandla cellerna åter på dag 3. Det är viktigt att vänta 72 timmar efter den sista transduktionen Innan du börjar val ytterligare experiment eller karakterisering av målceller.
Effektiv viral förpackning är också beroende av storleken av den lentivirala konstruktionen mellan de 5 'och 3' LTR regioner. Denna sektion av lentiviralt konstruktionen bör vara ca 9 kb eller mindre, vilket motsvarar storleken av den nativa HIV-genomet. Högst 9 kb maj deveck titern av de producerade pseudoviral partiklarna. Ny teknik, såsom piggyBac transposonmutanter vektorer, låt för tillförlitlig och stabil integrering av transgener upp till 100 kb genom en enda transfektion. Detta tillvägagångssätt kan användas för konstruktioner som överskrider den tillåtna storleken på lentivirala vektorer, i fall där det är möjligt att transfektera målceller, och ger den ytterligare fördelen att inte kräva en viral förpackningssteget 9,10.
De pseudoviral producerade partiklar med hjälp av detta protokoll är smittsamma att de kan infektera de flesta däggdjur celltyper. De produkter som används i detta protokoll, men är tredje generationens BioSafe att de producerar icke-replikativ och själv-inaktiverande pseudoviruses. Därför, när omvandlade till målceller eller djur, de målceller eller djur inte är smittsam. Substitution av andra lentivector plasmider som inte är tredje generationens BioSafe är möjligt men inte rekommenderat ett biosäkerhetperspektiv. Den virala produktionen protokollet och efterföljande transduktion av målceller bör utföras under biosäkerhetsnivå 2, enligt NIH riktlinjerna 11, och forskare bör alltid bära skyddsrock och handskar vid hantering av viruspartiklar. Används 293TN producerande celler, bör rör med virala partiklar, och engångspipetter tas om hand i en lämplig biologiskt behållare. Återanvändbara pipetter och glas ska saneras med blekmedel och autoklavering för att minska exponering av personal.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för personalen och forskare vid SBI för deras stöd i utvecklingen och testningen av dessa protokoll.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |