Lentivirale ekspressionsvektorer er de mest effektive køretøjer til stabilt at udtrykke forskellige effektormolekyler eller reporterkonstruktioner i delende og ikke-delende mammale celler og hele organismer. Her giver vi en protokol om, hvordan man pakker lentivector ekspressionskonstrukter i pseudoviral partikler og transducere målceller ved hjælp af de pseudoviral partikler.
Som med standard plasmidvektorer, er det muligt at transficere lentivectors i plasmid form i celler med lav-til-medium effektivitet til opnåelse af forbigående ekspression af effektorer. Emballage lentivirale ekspressionskonstruktioner til pseudoviral partikler imidlertid muligt op til 100% transduktion, selv med vanskelige at transficere celler, såsom primære, stilk og differentierede celler. Endvidere har lentiviral levering ikke frembringe de specifikke cellulære responser typisk er forbundet med kemiske transfektioner, såsom celledød som følge af toksiciteten af transfektionsreagens 1, 2. Når transducerede i målceller, den lentivirale konstruktionen integreres i genomisk DNA og tilvejebringer stabil ekspression af det lille hårnålen RNA (shRNA), cDNA microRNA eller reportergen 3, 4. Målceller stabilt udtrykker effektor-molekyle kan isoleres ved anvendelse af en selekterbar markør, der er indeholdt i ekspressionsvektoren konstruktionen såsom puromycin eller GFP. Efter pseudoviral partikler inficere målceller, kan de ikke replikere i målceller, fordi de virale strukturelle gener er fraværende, og de lange terminale repeats (LTR'er) er udformet til at være selv-inaktiverende ved transduktion 5, 6.
Der er tre hovedkomponenter, der er nødvendige for effektiv lentiviral emballage 1, 5, 6, 7.
En oversigt over virusproduktion protokol kan ses i figur 1. Viral produktion begynder ved co-transfektion 293TN producerende celler med lentiviral ekspressionsvektoren og emballering plasmider. Virale partikler udskilles i mediet. Efter 48-72 timer cellekulturen mediet høstes. Cellerester fjernes fra celledyrkningsmedier, og de virale partikler udfældes ved centrifugering med PEG-det for koncentration. Fremstillet lentivirale partikler derefter titreret og kan anvendes til at transducere målceller. Nærmere oplysninger om viral titrering er ikke medtaget i denne protokol, men kan findes på:
ANK "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af de specifikke produkter, der er angivet. Andre reagenser kan være substitueret, men de samme resultater ikke kan garanteres.
Dette viral pakning og transduktion af mål celler protokol er blevet optimeret til brug med SBI 's virale emballage reagenser. Substitution af andre reagenser kan påvirke resultatet af protokollen. Denne protokol er kun blevet optimeret til lentiviral produktion og kan ikke være egnet til fremstilling af andre typer virus eller pseudoviruses.
Vellykket viral emballage er afhængig af en række vigtige skridt. De 293TN celler udtrykker SV40 stort T-antigen, hvilket er absolut nødvendigt for sekretion af lentivirale partiklerne ind i cellekultursupernatanten. Massefylden ved hvilken 293TN celler ved transfektion er særlig vigtig, for at PureFection reagens tilstrækkelig overføre lentivector og emballering plasmider ind i celler. Tilsætning af PureFection blandingen til vævskulturplade i en dråbevis måde efterfulgt af grundig omrystning af pladen er vigtig for spredning af emballagen plasmiderog lentivector konstruere gennem hele celler. Manglende passende fordele vektorerne kan resultere i utilstrækkelig lentivirale partikler, der produceres. Den viral pakning Reaktionen kan opskaleres til fremstilling af høj titer virus, baseret på overfladearealet af vævskulturplader. Kan man vælge at pladen flere vævskulturskåle i 293TN celler pr konstruktion, der skal emballeres. Koncentrationen af de virale supernatanter er især nyttig til at skabe høje titer virus. Viral supernatant fra multiple plader af celler kan kombineres og koncentreres til anvendelse i in vivo-forsøg, eller celler, der er vanskelige at transducere.
Titrering de fremstillede lentivirale partiklerne er vigtig for at beregne et nøjagtigt MOI til brug for transduktion af målceller. Kende MOI der blev anvendt i en given transduktion muliggør fejlfinding i tilfælde af, at transduktion ikke er vellykket. For eksempel ved anvendelse af en MOI, der erfor lav, kan resultere i meget få målceller udtrykker konstruktionen af interesse. Anvendelse af en MOI, som er for høj, kan dog resultere i målceller, der viser tegn på stress. Målet er at anvende en MOI der maksimerer ekspression af konstruktionen af interesse samtidig sundhed af cellerne. Selvom vi anbefaler qPCR baseret titrering protokol, der måler integrerede kopier af lentiviral konstruktionen i HT1080-celler, kan andre titrering fremgangsmåder også anvendes, såsom p24 ELISA eller estimering af procentdelen af GFP-positive celler.
Vellykket transduktion af målceller er også afhængig af flere vigtige faktorer. TransDux er en unik infektion reagens, hvilket giver høj transduktion effektivitet, men som ikke er toksisk for celler. TransDux kan anvendes i stedet for polybren, som ofte er toksiske for målcellerne. Optagelse af TransDux i transduktionen af målcellerne hjælper til at neutralisere ladninger på viruspartikler og tillader virusset ind i cellensek. Idet TransDux ikke er toksisk for cellerne, kan man tillade lentivirale partiklerne forbliver i kontakt med cellerne op til 72 timer (det tidspunkt, hvor de virale konstruktioner er integreret i værtscellens genom), hvilket øger sandsynligheden for virale partikler ind i cellen. For visse vanskelige at transducere celler, kan transduktioner gentages på hinanden følgende dage for at øge transduktionseffektivitet. For eksempel cellerne på dag 1 transducere, tillader cellerne at hvile på dag 2, og derefter transduktion af cellerne igen på dag 3. Det er vigtigt at vente 72 timer efter den sidste transduktionen før begyndelsen udvælgelse yderligere eksperimenter eller karakterisering af målcellerne.
Effektiv viral pakning er også afhængig af størrelsen af lentiviral konstruktionen, mellem 5'-og 3'-LTR regionerne. Dette afsnit af lentiviral konstruktionen skal være ca 9 kb eller mindre, hvilket svarer til størrelsen af det native HIV-genomet. Over 9 kb kan destigning i titer af de fremstillede pseudoviral partikler. Ny teknologi, såsom piggyBac transposonsekvenser vektorer, giver mulighed for pålidelig, stabil integration af transgener op til 100 kb via et enkelt transfektion. Denne fremgangsmåde kan anvendes til konstruktioner, der overstiger grænsen for størrelsen af lentivirale vektorer, i tilfælde hvor det er muligt at transficere målceller, og tilvejebringer den yderligere fordel ikke at kræve en viral pakning trin 9,10.
De pseudoviral fremstillede partikler med denne protokol er infektiøse, at de kan inficere de fleste pattedyrcelletyper. De produkter, der anvendes i denne protokol, dog er tredje generation Biosafe i, at de producerer ikke-replikativt og selv-inaktiveringsbetingelser pseudoviruses. Derfor, når transduceret i målceller eller dyr, de målceller eller dyr, der ikke er smitsom. Substitution af andre lentivector plasmider, der ikke er tredje generation Biosafe er mulig, selv om ikke anbefales ud fra et biosikkerhedperspektiv. Den virale produktion protokollen og efterfølgende transduktion af målceller skal udføres under biosikkerhedsniveau 2, i henhold til NIH retningslinier 11, og forskerne bør altid bære en laboratoriekittel og handsker ved håndtering af de virale partikler. Anvendes 293TN producentceller, bør rør af viruspartikler og engangsartikler pipetter skal bortskaffes på en passende beholder til smittefarligt. Genanvendelige pipetter og glas skal dekontamineres med blegemiddel og autoklavering for at reducere eksponeringen af personalet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende den ansatte og forskere på SBI for deres støtte til udvikling og afprøvning af disse protokoller.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |