Summary
Um método para expandir células T γδ a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) é descrito. PBMC células derivadas de T γδ são estimuladas e expandida usando zoledronato e interleucina-2 (IL-2). Expansão em grande escala de células T γδ podem ser aplicadas a imunoterapia celular autóloga de câncer.
Abstract
Células T γδ podem reconhecer e responder a uma grande variedade de estresse induzido por antígenos, desenvolvendo assim uma atividade ampla inata anti-tumorais e anti-infecciosos. 1 A maioria das células T γδ no sangue periférico tem o Vγ9Vδ2 receptor de células T. Estas células reconhecem o antígeno em um principal de histocompatibilidade forma complexa independente e desenvolver forte citolítica e Th1-like funções efetoras. 1 Portanto, as células T γδ são células efetoras candidato atraente para a imunoterapia do câncer. Vγ9Vδ2 células T responder a phosphoantigens tais como (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enilo pirofosfato (HMBPP), que é sintetizada em bactérias através de biossíntese de isoprenóides; 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), que é produzido em células eucarióticas através da via mevalonato. 3 Na condição fisiológica, a geração de IPP na célula nontransformed não é suficiente para a ativação de células T γδ. Desregulação da via mevalonato em células tumorais leva ao acúmulo de IPP e γδ T ativação das células. 3 Porque aminobisphosphonates (tais como o pamidronato ou zoledronato) inibem sintase farnesil pirofosfato (FPP), a enzima agir a jusante do IPP na via mevalonato, níveis intracelulares de IPP e sensitibity para γδ reconhecimento células T pode ser terapeuticamente aumentou aminobisphosphonates. IPP acumulação é menos eficiente nas células nontransfomred de células tumorais com uma concentração farmacologicamente relevantes da aminobisphosphonates, que nos permitem imunoterapia para o câncer, ativando as células T γδ com aminobisphosphonates. 4 Curiosamente, IPP acumula em monócitos quando PBMC são tratados com aminobisphosphonates, por causa do eficiente absorção de drogas por essas células. 5 monócitos que se acumulam IPP se tornar células apresentadoras de antígenos e estimular Vγ9Vδ2 células T no sangue periférico. 6 Com base nesses mecanismos, nós desenvolvemos uma técnica de expansão em grande escala de culturas de células T γδ usando zoledronato e interleucina -2 (IL-2). 7 Outros métodos para a expansão de células T γδ utilizar o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) 8 ou 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP). 9 Todos estes métodos permitem que ex vivo de expansão, resultando em um grande número de células T γδ para uso em imunoterapia adotiva. No entanto, apenas zoledronato é um reagente FDA-approved disponíveis comercialmente. Zoledronato-expandida de células T γδ mostrar CD27 - CD45RA - fenótipo de memória efetoras e sua função pode ser avaliada por IFN-γ ensaio de produção 7.
Protocol
1. Isolamento de PBMC
- Coleta de sangue (7,5-8,0 ml) em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica. O tubo contém um anticoagulante heparina sódica e um fluido de densidade Ficoll-Hypaque, além de uma barreira de gel de poliéster, que separa os dois líquidos. Tubo de centrifugação / amostra de sangue em temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) em um rotor horizontal (swing out-cabeça) por 20 min a 1800 x g. Interruptor centrífuga freios off.
- Após a centrifugação, a seqüência de camadas ocorre da seguinte forma (visto de cima para baixo): um plasma) - b) células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e plaquetas - c) solução de densidade - d) gel de poliéster - e) granulócitos - f) glóbulos vermelhos (Fig. 1).
- Coletar uma fração da camada de plasma, deixando 5 a 10 mm de plasma acima da interfase sem perturbar a camada de células. O plasma pode ser usado para a cultura (seção 2.5).
- Colheita da fração enriquecida (PBMC) na interfase com uma pipeta e transferir para um tubo de 15 ml.
- Lave o PBMC com 10 ml de tampão fosfato (PBS), invertendo o tubo 5 vezes, e então centrifugar por 5 min a 400 x g.
- Repita os passos de lavagem duas vezes, e, em seguida, ressuspender o sedimento celular em 5 ml de PBS. Determinar o número de células. Normalmente, 1,3 x10 6 células são recuperados a partir de 1 ml de sangue total.
- Determinar a freqüência e fenótipo de células T γδ em PBMC por citometria de fluxo (seção 3) (Fig. 2).
2. Expansão de células T γδ
- Centrífuga suspensões de células em 15 ml tubos cônicos por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente, e descartar o sobrenadante.
- Prepare meio de cultura (CM), acrescentando IL-2 humana (IL-2) e zoledronato (Zometa) para concentrações finais de 1000 UI / ml e 5 mM, respectivamente. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou Optmizer (Invitrogen) o suporte a expansão de células γδ boa T (mais informações em referências 6 e 9). Zometa é fornecido na forma líquida (4 frasco mg/5-ml). Para preparar uma solução de M 5, adicione 50 ul de Zometa para 30 ml de meio de cultura.
- Ressuspender pellet celular em meio de cultura e ajustar a 1x10 6 células / ml.
- Ml pipeta 1 de CM contendo 1x10 6 células em cada poço de uma placa de 24 poços. De grande escala culturas, as células podem ser semeados em 0,5 x 10 6 células / cm 2 de acordo com as áreas de superfície dos poços da placa, prato, ou balão.
- Adicionar plasma autólogo (seção 1.3), agrupados humano AB soros, ou FCS para que seja aproximadamente 10% do volume da cultura (100 l para cada poço de uma placa de 24 poços). Coloque as placas em um umidificado 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 por 24-48 horas.
- Manter a cultura, a uma densidade de células de 0,5-2 x 10 6 células / ml. Adicionar meio fresco contendo IL-2 humana (1000 UI / ml) apenas (sem Zometa) a cada 2-3 dias, ea transferência de células cultivadas em novos poços ou frascos, se necessário, de acordo com o grau de proliferação celular (Fig. 3). Fornecimento de plasma ou soro ao meio de modo que a concentração sérica pode ser mantida pelo menos 1%.
- Células colheita no dia 14/12 e determinar a freqüência de fenótipo, e as funções de células T γδ por citometria de fluxo (veja abaixo).
3. Análise fenotípica por citometria de fluxo
- Transferência de 200 amostras l contendo 2 x 10 5 células para fluorescência-activated cell sorting (FACS) tubos.
- Adicionar 2 ml de frio PBS e centrifugar por 5 min a 400 x g. Então, voltar a suspender as pelotas em 50 mL tampão FACS (PBS + 1% FCS azida de sódio + 0,1%). Adicionar 5 mL de cada anticorpos para as amostras (os anticorpos monoclonais estão listados na Tabela 1).
- Incubar no gelo no escuro por 20 min.
- Adicionar 2 ml de tampão FACS para cada amostra, e depois de vórtice. Amostras de centrífuga por 5 min a 400 x g a 4 ° C. Decantar cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 300 mL de buffer FACS e vortex. Analisar amostras em um citômetro de fluxo (Fig. 2).
4. IFN-γ ensaio de produção de 10
- Um dia antes do ensaio, preparar células estimulador através da cultura 05/03 x10 5 células Daudi / ml em meio RPMI 1640, mais 10% SFB (RPMI-10) durante a noite com Zometa (5 mM) (doravante designado Z-Daudi).
- Coletar Z-Daudi e ressuspender em RPMI-10 em 2x10 6 células / ml. Adicionar 100 ul de Z-Daudi (2x10 5) a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.
- Prepare γδ células T em 2x10 6 células / ml em RPMI-10 contendo Brefeldin A a 20 mg / ml. Transferência de 100 l da suspensão de células T γδ (2x10 5) a cada poço contendo Z-Daudi células ou para controlar poços (100 ul de RPMI-10 apenas, ou RPMI-10 com 20 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato[PMA] mais 2 mg / ml de ionomicina).
- Mix pipetando cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 4 horas a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
- Centrifugar a placa por 5 min a 400 x g a 4 ° C e ressuspender o pellets em 200 mL de frio PBS.
- Transferir as amostras para tubos FACS. Adicionar 4 ml de frio PBS e centrifugar os tubos por 5 min a 400 x g a 4 ° C.
- Volte a suspender as pelotas em 50 ul de tampão FACS com FITC-conjugado anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 mL). Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente.
- Adicionar 100 ul de IntraPrep reagente 1 e incubar por 15 min em temperatura ambiente. Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente.
- Retire o sobrenadante por aspiração e adicione 100 ml de IntraPrep dois reagentes. Incubar por 5 min à temperatura ambiente sem agitação.
- Adicionar 5 mL da PE-conjugado anti-IFN-γ mAb ao tubo de ensaio. Incube ao abrigo da luz por 15 min em temperatura ambiente.
- Adicionar 4 ml de PBS a cada tubo e centrifugar por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet celular em 0,5 ml de tampão FACS.
- Analisar as células por citometria de fluxo. Portão de CD3 + + TCRVγ9 células e examinar a expressão de IFN-γ (Fig. 4).
5. Resultados representativos:
É importante para determinar a porcentagem de células T γδ em PBMC no início da cultura. Como mostrado na figura. 2 A, a porcentagem de células CD3 + + TCRVγ9 células T γδ em PBMC foi de 1,6% no dia 0. As populações dominantes eram CD27 + CD45RA + CD27 + ingênuo ou CD45RA - fenótipos de memória central. Quando as células T γδ foram eficientemente estimulados, eles formaram clusters no dia 05/03 (Fig. 3 A e B). Quando a formação do cluster foi adiada, o crescimento de outros tipos de células, tais como CD4 + ou CD8 + células T αβ ou células NK poderia dominar o crescimento de células T γδ (Fig. 3 C e D). Após 14 dias de cultura, a freqüência de células T γδ aumentou para mais de 93,8% das células cultivadas em culturas de células γδ sucesso T (Fig. 2 E). A cultura de células T γδ NKG2D upregulated CD69 e expressão (Fig. 2 G e H). Eles exibido CD27 - CD45RA - fenótipo de memória efetoras (Fig. 2 F). As funções das células T γδ foram avaliados em relação à produção de citocinas e citotoxicidade. IFN-γ o intracelular coloração demonstraram que as células T γδ IFN-γ produzido em resposta a PMA / ionomicina tratamento ou Z-Daudi células que IPP acumulado após o tratamento zoledronato (Fig. 4). Estes resultados indicam que zoledronato pode eficientemente estimular e expandir funcional das células T γδ.
| tubo | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | camundongo IgG1 | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | camundongo IgG1 | camundongo IgG1 |
Tabela 1. Anticorpos monoclonais utilizados no multicolor de coloração de células T γδ. Um exemplo da análise fenotípica de células T γδ realizados em nosso laboratório é mostrada na figura. 2.
Figura 1. Separação de PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) é desenhada em um BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com heparina sódica e directamente centrifugada por 20 min a 1800 x g. Após a centrifugação, as camadas, resultando como visto de cima para bottom: a Plasma) - b) PBMC e plaquetas - solução Densidade c) - d) gel de poliéster - e) Granulócitos - f) Os glóbulos vermelhos.
Figura 2. Fenótipo de superfície típica de células T γδ. PBMC foram estimuladas com zoledronato e IL-2 por 14 dias. Células foram marcadas com FITC-rotuladas anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 para monitorar a expansão de células T γδ (A e E). As células T γδ foram identificados por sua expressão de TCRVγ9, e sua expressão de CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), ou CD69 (D e H) foi examinada.
Figura 3. Representante culturas de células T γδ. PBMC foram estimuladas com IL-2 (1.000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campos representativos são mostrados (IX71 microscópio invertido [Olympus] x 200). Aglomerados e agregados de células T γδ podem ser observados no dia 3 (A) e dia 5 (B), quando as células T γδ expansão com sucesso. Em contraste, não aglomerados ou agregados foram observados quando o crescimento das células T γδ não era adequado (C e D).
Figura 4. IFN γ-produção. As células T γδ foram incubadas com RPMI-10 apenas (A) ou PMA / ionomicina (B) ou Z-Daudi (C) por 4 horas. Em primeiro lugar, a expressão de superfície de TCRVγ9 estava manchada e IFN-γ, em seguida, a produção foi examinado por intracelular IFN-γ coloração.
Figura 5. Cinética da cultura de células T γδ. (A) o número absoluto de células em cultura, (B) porcentagem de células T γδ, e (C) número absoluto de células T γδ nos pontos de tempo indicado.
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Discussion
O método aqui apresentado permite a expansão eficiente de células T γδ do PBMC. células γδ T ativadas e se expandiu por zoledronato e IL-2 completa desenvolver funções efetoras, refletido pela produção de citocinas e citotoxicidade. Tem sido relatado que o pirofosfato bromohydrin sintéticos phosphoantigens (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) também expandir as células T γδ, no entanto, eles não estão disponíveis comercialmente. Em contraste, zoledronato já está licenciado para aplicações clínicas como Zometa. Portanto, um reagente de confiança é facilmente disponível.
A seleção de meios de cultura e soro é crítica. Use meios de cultura adequados, tais como ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) ou Optmizer (Invitrogen) para a expansão de células T γδ sucesso. 11 Verifique se plasma autólogo, agrupados humano AB soros ou FCS pode apoiar a cultura de células T γδ. Lembrar também que PBMC de alguns doadores não responderem ao estímulo zoledronato independentemente de reagentes outra cultura. Se isso acontecer, a única opção é mudar o doador.
Como já demonstrado, enriquecimento de células T γδ foi alcançado relativamente cedo, quase 80% das células cultivadas foram γδ células T no 7 º dia. As células T γδ continuaram a proliferar até 12-14 dias (Fig. 5). Aproximadamente 2,2 x 10 8 células T γδ podem ser obtidas a partir de 1 x 10 6
PBMC contendo 1,6 x 10 4 células T γδ. Este método de cultura tem sido utilizado na fase I de ensaios clínicos avaliando a segurança ea viabilidade de terapia γδ zoledronato-expandida transferência de células T em pacientes com mieloma múltiplo ou câncer de pulmão. 12,13
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZOMETA | Novartis AG | zoledronate | |
| PROLEUKIN | Novartis AG | human recombinant IL-2 | |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin | BD Biosciences | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203- medium | Cell Science & Technology Institute | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin A | Sigma-Aldrich | B5936-200UL | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| ionomycin | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | |
| IntraPrep | Beckman Coulter Inc. | A07803 | |
| anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| anti-human CD4-ECD | Beckman Coulter Inc. | 6604727 | |
| anti-human CD8-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607011 | |
| anti-human CD14-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07765 | |
| anti-human CD19-PE | Beckman Coulter Inc. | A07769 | |
| anti-human CD45-ECD | Beckman Coulter Inc. | A07784 | |
| anti-human CD56-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07789 | |
| anti-human TCRαβ-PE | Beckman Coulter Inc. | A39499 | |
| anti-human TCR Vγ9-FITC | Beckman Coulter Inc. | IM1463 | |
| anti-human CD27-PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | 6607107 | |
| anti-human CD45RA-ECD | Beckman Coulter Inc. | IM2711 | |
| anti-human CD69-PE | BD Biosciences | 555531 | |
| anti-human NKG2D-PE | Beckman Coulter Inc. | A08934 | |
| Anti-humal IFNγ-PE | Beckman Coulter Inc. | IM2717U | |
| Mouse IgG1 isotype control-PE | Beckman Coulter Inc. | A07796 | |
| Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 | Beckman Coulter Inc. | A07797A07798 |
References
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