1. Udarbejdelse af katetre og mus Antenne til Sampling Access (MASA tm) Forbered arteriekateter ved at indsætte en 1,3 cm stykke af PE-10 (0,011 tommer indre diameter) i en 6 cm stykke silastic slange (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1A. Bevel spidsen af PE-10 med en skalpel, så længden fra slutningen af silastic til spidsen af den skrå kant er 0,9 cm. Forbered venekateter ved at skyde en 1 mm stykke silastic slange (0,020 tommer indre diameter) 1,1 cm fra det afskårne slutningen af en 6 cm stykke silastic slange (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1B. Den 1 mm stykke silastic bruges som en fastholdende perle. At udarbejde en MASA tm, indsætte hver af to 1,3 cm stykker 25 gauge rustfri stål stik i hver af to 3 cm stykker af PE-20 (0,015 tommer indre diameter). Fastgør PE-20/connectors til hinanden ved at skubbe en 5 mm stykke silasticslange (0,040 tommer indre diameter) over det område, hvor stålrør og PE-20 mødes. Bøj stålrør til en ~ 120 ° vinkel og separate hvert rør med ~ 45 °. Placer afsluttet rig i en klat af medicinsk silikone lim, således at PE-20 slanger er lodret og enderne af rustfrie stålrør rækker ud over den selvklæbende (Figur 1C). Tillad denne til at indstille til 24 timer. 2. Kirurgisk kateterisation Forud for kirurgi, sterilisere katetre med 70% ethanol, fylde dem med hepariniseret saltvand (200 U heparin / ml saltvand) og indsæt rustfrit stål stik. Bedøver mus, helst ved hjælp af en metode, der kontinuerligt leverer narkosemiddel (f.eks inhalerede isofluran). Ved hjælp af steril teknik, hår fjernes fra den incision websteder ved hjælp af klippere og / eller et hårfjerningsmiddel, og desinficer huden med alkohol efterfulgt af en betadine krat. For kateteret, skal du fjerne hår påregion, der strækker fra underkæben til toppen af brystkassen og mellem kraveben. For eksternalisering af katetre bag hovedet, fjerne hår i området mellem bunden af kraniet og interscapular regionen og desinficer huden med alkohol efterfulgt af en betadine krat. Læg musen på ryggen på en opvarmning overflade og under visning område af en kirurgisk mikroskop. Sikker halen og ekstremiteter med kirurgisk tape. Sikker hovedet i næse kegle leverer anæstesi. Lav en lille lodret midtlinie incision 5 mm cephalic til brystbenet. Brug pincet, stumpt dissekere vævet til at afsløre venstre sternocleidomastoideus muskel. Afspejler denne muskel til at udsætte venstre halspulsåren. Forsigtigt drille off bindevæv fra arterie. Det er vigtigt på dette punkt for at isolere vagus nerve fra arterie uden at beskadige enten arterie eller nerve. Isoler arterie og ligate de cephalic ende med silke sutur. Løst knude andenstykke af sutur på den caudale ende af den udsatte fartøjet. Klemme fartøj med en mikro-serrefine klemme på caudale ende og snit tæt under ligated ende med fjeder saks. Sæt forsigtigt kateter for så vidt angår klemme. Forsigtigt frigøre mikro-serrefine klemme og fremme kateter til silastic-PE krydset. Tie både ligaturer sikkert til kateteret og bekræfte, at kateteret prøver ved at forbinde den frie ende af kateteret til en prøveudtagning sprøjte. Lav en anden incision 5 mm til højre for midterlinjen og ca 2 mm caudale til det første snit. Brug pincet, stumpt dissekere det væv, afsløre og isolere de rigtige halsfedt. Forsigtigt ligate de cephalic ende med silke sutur og løst binde et andet stykke af sutur ved caudale ende. Skær lige under cephalic ligatur med fjeder saks og indsætte katetret op til fastholdelses perle. Bind en sutur bag perle og bekræfte, at kateteret prøver. Turn musen over og gøre et lille snit mellem skulderbladene. Tunnel en 14-gauge kanyle under huden fra den incision for arteriel kateter, på forsiden af musen, til den interscapular incision på bagsiden. Før arteriekateter gennem nålen for at exteriorize det på bagsiden af musen. Gentag dette for halsfedt kateteret ved tunneling den 14-gauge kanyle under huden på højre side af musen fra incisionssted på forsiden til interscapular incision på bagsiden. Spænd arteriekateter med en mikro-serrefine klemme på incisionssted mellem skulderbladene. Skær kateteret ~ 1 cm over denne klemme. Placer MASA tm med rustfrit stål stikkene vender mod hovedet af musen. Slut arteriekateter til rustfrit stål stikket peger mod venstre side af musen. Vær omhyggelig med at sikre, at der ingen huller eller knæk på kateteret. Gentag for venekateter,at tilslutte den til rustfrit stål stikket peger mod højre side af musen. Sæt MASA tm ind i indsnittet mellem skulderbladene. PE-20 slange, der svarer til halsfedt kateteret skal være til højre side af musen og PE-20 slange, der svarer til arteriekateter skal til venstre. Luk ventrale og dorsale incisioner med nylon sutur. For den dorsale lukning, kan sutur køres gennem hærdet silikone af MASA tm for at sikre det på plads. Bekræft åbenheden af katetre ved hjælp af en rødmen opløsning med hepariniseret saltvand og et antibiotikum for at minimere risikoen for infektion. Placer musen i den varme, rent bur til umiddelbar bedring. Figur 2 viser det færdige produkt. Lad musen til at komme i mindst 5 dage. Monitor vægt og generelle sundhed. Udnyt den relevante postoperative smertestillende regime som er godkendt af institutionens Animal Care ogBrug udvalget. 3. Hyperinsulinemic-euglycemic klemme Hurtig musen for 5-6h. Som reference, refererer tiden t = 0 min til slutningen af den hurtige og begyndelsen af insulin og glukose infusion (dvs. den klemme periode). Opsætningen og tid linje for et typisk eksperiment er vist i Figur 3. Brug Micro-Renathane eller tilsvarende slanger til infusion og prøveudtagning linjer. Suspendere en dual-channel dreje over musen. Dette fungerer som en hub mellem musen og infusion / prøvetagning sprøjter. Under eksperimentet stadig mus i et hjem bur eller lignende container og er bundet til den dreje. Inden etablering af musen, skal du udfylde den arterielle prøveudtagningsledningen med hepariniseret saltvand (10 U heparin / ml saltvand) og placere en rustfri stål-stik i den nederste ende af linjen. Efterlad en sprøjte med hepariniseret saltvand (clearing sprøjte) tilsluttet til toppen af prøvetagningsledningen. Dette vil blive brugt til at udarbejde blod SAMPles. Fyld venøs infusion linje med ikke-hepariniseret saltvand fra infusionen port swivel (Segment A i figur 3A) hele vejen til bunden af linjen. Sæt den øverste ende af linjen og placere en rustfri stål-stik (eller et Y-stik, hvis en bolus skal administreres) i den nedre ende af linjen. Hvis en isotopisk glukose tracer (fx [3 – 3 H] glukose) er ved at blive infunderet, sikre en 1 ml sprøjte indeholder sporstof til en infusion sprøjte. Fyld venøs infusion linje med sporstof i stedet for saltvand (figur 3B). Tre timer i den hurtige, vejer musen og tilslut PE-20 for halsfedt og arterielle katetre til infusion og prøveudtagning linjer, hhv. Hvis administration [3 – 3 H] glukose tracer, begynder en primet-kontinuerlig tracer infusion ved t = -90 min (figur 3C). En typisk grunding dosis er 1 μCi. Forbered en 0,05 μCi / mikroliter [3 – 3 H] glukose Solution i ikke-hepariniseret saltvand. Læg løsningen i en 1 ml sprøjte og sikre sprøjten i en infusionspumpe. Administrer den grunding dosis ved at tilføre 20 μl / min i 1 min. Følg med en kontinuerlig infusion på 0,05 μCi / min (1 ml / min) for et 90 min ligevægt periode. Forbered infusates af insulin og glucose. Insulin er udarbejdet i ikke-hepariniseret saltvand indeholder 3% plasma som en transportør (en passende koncentration af BSA kan også bruges). Glucose infusates er kommercielt tilgængelige i en række af fusioner (5, 20 og 50%). Forbered saltvand-vasket erythorocyte infusate ved at indhente fuldblod fra en donor mus, helst af den samme stamme baggrund som de eksperimentelle musen. Typisk 1 ml fuldblod er nødvendige pr studere mus. Centrifugér blodet til at adskille erytrocytter. Vask erythrocytter med 10 U / ml hepariniseret saltvand og centrifuger til at skille sig af med saltvand. Bestem mængden af erytrocytter og resuspender i en tilsvarende mængde på 10 U / ml hepariseret saltvand. Tegn hver infusate i en 1 ml sprøjte og sikkert hver sprøjte til en person infusionspumpe. Tilslut hver sprøjte til en 4-vejs multistik (Figur 3). Ved t = -15 min tage en blodprøve ved langsomt at udarbejde 50-100 μl af blod ind i clearing sprøjten. Spænd arterielle prøvetagningsledningen og fjern clearing sprøjten. Ved hjælp af en håndholdt blodsukkerapparat, en blodsukkerværdi tage ved at fjerne klemme på arteriel prøvetagningsledningen og tillade blodet at strømme ind i blodsukkerapparat strimmel. Når glukose måling er taget, klemme den arterielle prøvetagningsledningen og indsætte en stump-kanylesprøjten (prøveudtagning sprøjte) i den arterielle prøveudtagsledning. Fjern klemmen og tegne en mængde blod (se note) i sampling sprøjten. Spænd arterielle prøvetagningsledningen og fjern prøveudtagning sprøjten. Sæt clearing sprøjten tilbage i den arterielle prøveudtagsledning. Træk op i stemplet for at fjerne eventuelle luftbobler og re-tilføre50-100 μl af blod, der oprindelig blev udarbejdet. Bemærk: Mængden af udtagne blod beror på en analyse, der udføres. For eksempel, en analyse af [3 – 3 H] kræver glukosekoncentrationen 10 μl af plasma, så 50 μl af blod er tegnet. Dette giver 20-30 μl af plasma, hvilket er tilstrækkeligt for analysen plus ekstra plasma hvis det er nødvendigt. Målinger af hormoner og andre metabolitter (fx insulin, frie fedtsyrer) kræver prøvetagning af ekstra blod. Dispenser blodet i prøveudtagningen sprøjten i et EDTA-belagt mikrorør. Centrifuger og indsamle plasma. Hold plasma på is indtil slutningen af studiet eller umiddelbart opbevares ved -20 ° C. Gentag trin 3,10 ved 3,12 ved t = -5 min. Indhente yderligere blod (50 μl) til måling af basal plasma insulin niveauer. Mål baseline hæmatokrit ved at trække blod ind i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør. Målingerne indhentes frabout plasmaprøver ved t = -15 og -5 min repræsenterer baseline (dvs. fastende) værdier. Efter at prøven ved t = -5 min fylde infusionsslanger for glucose, insulin og saltholdige-vasket erytrocytter op til 4-vejs stik. Tilslut 4-vejs stik til slangen fastgjort til dreje infusion port (eller slange forbundet til Y-stik, hvis infusion [3 – 3 H] glukose) som vist i figur 3. Begynd infusion af den saltholdige-vaskede erytrocytter først. Indstil infusionshastigheden til at erstatte den samlede mængde af blod blive opsamlet gennem hele undersøgelsen (fx hvis et alt 500 μl af blod er opsamlet gennem 120 min af studiet, skal du angive infusionshastigheden til 4,2 μl / min). I modsætning til de andre infusates er erytrocyt løsningen røde. Infusion af denne løsning først giver mulighed for enhver potentiel modstand eller forhindringer i infusionen strækninger, der skal identificeres og korrigeres. Når erythrocyt infusate når musen, begynder insulin ogglukose infusioner. Dette er nu t = 0 min. Insulin er infunderes med en konstant, forud fastsat sats. En insulin infusionshastighed af 4 mU • kg -1 • min -1 typisk vil undertrykke endogene glukoseproduktion ved 80-100% og stimulerer glukose forsvinden med 2-3 gange. Den indledende glukose infusionshastighed (GIR) er estimeret baseret på baseline blodsukkerniveau og tidligere erfaringer. Hvis infusion [3 – 3 H] glukose, kan man vælge at øge tracer infusionshastigheden til at matche den anslåede stigning i glukose omsætningen (typisk en 2-3 gange stigning). I betragtning af den høje glukose omsætning i musen, skal blodprøverne tages fra den arterielle linje ikke mindre end hver 10 minutter til måling af glukose koncentrationen gennem hele forsøget. Juster GIR at opnå og fastholde målet euglycemia (figur 3C). Dette mål kan variere afhængigt af model eller formålet med undersøgelsen. Et godt mål glucose koncentration er 150 mg • dL-1, da dette er et typisk 6h fastede glukose niveau i en Chow-fodret C57Bl/6J mus. Målet er at opnå euglycemia hurtigt, helst inden for de første 40-50 min, og at have glukose og GIR stabil i begyndelsen af steady state perioden (t = 80 min). Hvis infusion [3 – 3 H] glukose, få yderligere blod ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 minutter til måling af plasma-[3 – 3 H] glukose specifikke aktivitet. Indsamle yderligere blod ved t = 100 og 120 min til måling af plasma insulin og andre hormon (r) eller metabolit (ter). Ved t = 110 min, trække blod ind i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør for måling af klemme hæmatokrit. Efter at prøven ved t = 120 min er taget, 2 [14 C] deoxyglucose kan gives til måling af vævsspecifikke glukoseoptagelse. Administrere en 12 μCi bolus i bolus linje tilsluttet jugularis prøveudtagsledning (figur 3B </strong>). Opnå blodprøver (50 μl) fra arterielle prøveudtagningsledningen ved t = 2, 15, 25 og 35 min efter indgift af bolus til måling af plasma-2 [14 C] deoxyglucose niveauer. Efter den sidste prøve, bedøver musen med en infusion af pentobarbital gives direkte i arterielle linje. Hurtigt dissekere alle væv er nødvendige for vurderingen af glukose optagelse (f.eks skeletmuskulatur af forskellige typer, fedtvæv, hjerte, hjerne) og andre væv (fx lever, milt, nyrer). Snap fryse væv i flydende kvælstof og opbevares ved -80 ° C indtil analyse. Tissue glukose er analyseret ved at måle ophobningen af fosforyleret 2 [14 C] deoxyglucose i den frosne væv og forsvinden af 2 [14 C] deoxyglucose fra plasma. 4. Repræsentative resultater Et eksempel på resultater fra et insulin clamp forsøget, vises i Figur 4.Dette eksempel viser muligheden for en højt fedtindhold kost til udfældning insulinresistens hos mus. Alle præsentationer af insulin clamp Resultaterne skal omfatte de følgende for at være fortolkelige: en tid løbet af blodsukkerniveauet, en tid løbet af GIR og plasma insulin-niveau (baseline og klemme). Som vist her, fastende glukose (figur 4A) og insulin (figur 4C) er højere hos mus fodret med et højt fedtindhold kost, tegn på insulinresistens. At præsentere en tid løbet af blodsukkerniveauet i hele klemme studiet (Figur 4A) gør det muligt for læseren at vurdere, hvor godt euglycemia blev opretholdt, hvilket er tegn på kvaliteten af klemmen. Tilsvarende, en tid løbet af GIR (Figur 4B) gør det muligt for læseren at afgøre, hvor hurtigt en steady state blev opnået. Viser disse data som tidsforløbet er betydeligt mere informativ end den konventionelle praksis i musen insulin clamp litteratur for at præsentere en 2-timers eksperimentsom en enkelt datum point svarende til gennemsnitlige værdier fra en udefineret "klemme" periode (4-13). I det aktuelle eksempel var blodsukkerniveauet lige mellem kontrol og høj fedt-fodret grupper, men GIR var signifikant lavere i den høje fedt-fed gruppe (figur 4B). Dette er tegn på en svækkelse i hele kroppen insulin handling. Clamp insulin niveauet var også højere i den høje fedt-fed gruppe (figur 4C), yderligere støtte til tilstedeværelsen af en insulin resistente fænotype i disse mus. Brugen af isotopiske sporstof infusioner giver mulighed for vurdering af insulin indsats i specifikke væv. [3 – 3 H] glukose bruges til at estimere hastigheden af endogene glukose udseende (endoRa), som er et indeks af hepatisk glukoseproduktion (HGP), og satsen for hele kroppen glukose forsvinden (RD). Ud fra følgende betragtninger insulin helt undertrykker HGP i kontrol mus, er dette nedsat hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4D). Tilsvarende evne til isulin at stimulere Rd i kontrol mus er kompromitteret hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose bruges til at vurdere glukose metaboliske indeks (Rg), et mål for vævsspecifikke glukoseoptagelse. Som det ses i dette eksempel, er insulin-stimuleret glukoseoptagelse i skeletmuskulaturen nedsat hos mus fodret med et højt fedtindhold kost (Figur 4F). Figur 1: Forberedelse af arteriel (A) og (B) venøse katetre og (C) MASA tm. Arterielle katetre er udarbejdet ved at indsætte en 1,3 cm stykke af PE-10 ca 3 mm ind i en 6 cm stykke på 0,012 "ID silastic. PE-10 tip er facetslebne sådan, at længden fra facet til silastic er 0,9 cm. Venøs katetre er lavet ved at skubbe et lille stykke af 0,020 "ID silastic 1,1 cm fra det afskårne slutningen af en 6 cm stykke på 0,012" ID silastic. The 0,020 "ID silastic stykke fungerer som en fastholdende perle at se helbrede kateter til halsfedt. Til samling af MASA tm, hver af to 1,3 cm 25-gauge stik er sat i hver af to 3 cm stykker PE-20. Disse er holdt sammen af et lille stykke af 0,040 "ID silastic. Stikkene er bøjet til en 120 ° vinkel og adskilt i en 45 ° vinkel. Hele samlingen er nedsænket i medicinsk silikone klæber. Figur 2: Catheterized mus. Katetre er indopereret i venstre halspulsåren og højre halsfedt. De frie ender af katetre er eksternaliseres bag hovedet og forbundet til en MASA tm. Den MASA tm indsættes subkutant mellem skulderbladene. Dette giver mulighed for vaskulær adgang under insulin clamp eksperimenter uden det er nødvendigt at begrænse, håndtere eller bedøver musen. jpg "/> Figur 3: skildring af setup og tid linje for et insulin clamp eksperiment. Musen er bundet til en dual-channel drejelig, der fungerer som et knudepunkt for infusion og prøveudtagning sprøjter. Typiske opsætninger for forsøg, der ikke bruger sporstof infusioner (A) og ved hjælp af både [3 – 3 H] glukose og 2 [14 C] deoxyglucose (B) er vist. En tidslinje af procedurerne for oprettelse og udføre insulin clamp (C) er også vist. I løbet af klemmen, blodprøver ( ) Er taget hver 10 min til at måle blodsukker. Det GIR er justeret i overensstemmelse hermed for at opretholde euglycemia. Prøver til baseline blodsukker, plasma insulin, og plasma [3 – 3 H] glukose er taget ved t = -15 og -5 min. Prøver til klemme plasma-[3 – 3 H] glukose er taget ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 og til klemme insulin ved t = 100 og 120 min. 2 [14 C] deoxyglucose administreres efter prøven ved t = 120 min, og blood er indsamlet ved t = 2, 15, 25 og 35 min efter. Væv er truffet, efter at t = 35 min prøve. Figur 4: Resultater fra et insulin clamp eksperiment sammenlignede mus på en kontrol kost (Chow) til mus på et højt fedtindhold kost (HFD). Tidsforløbet for arteriel glukose (A) og GIR (B), baseline og klemme insulin (C), EndoRa (D), og Rd (E) og skeletmuskulatur (gastrocnemius og vastus lateralis) Rg (F) er vist. Alle resultater viser effekten af højt fedtindhold fodringen til at inducere insulinresistens.