1. Utarbeidelse av katetre og mus antenne for Sampling Access (MASA tm) Forbered arteriekateter ved å sette inn en 1,3 cm stykke av PE-10 (0,011 tommer indre diameter) i en 6 cm stykke silastic tubing (0,012 tommer indre diameter) som vist i figur 1A. Bevel spissen av PE-10 med en skalpell slik at lengden fra enden av silastic til tuppen av skråkant er 0,9 cm. Forbered venekateter ved å skyve en 1 mm stykke silastic tubing (0,020 tommer indre diameter) 1,1 cm fra den skrå enden av en 6 cm stykke silastic tubing (0,012 tommer indre diameter) som vist i Figur 1B. Den 1 mm stykke silastic brukes som et besøksforbud perle. For å forberede en MASA tm, setter hver av to 1,3 cm stykker av 25 gauge rustfritt stål plugger i hver av to 3 cm biter av PE-20 (0,015 tommer indre diameter). Sikre PE-20/connectors til hverandre ved å skyve en 5 mm stykke silastictubing (0,040 tommer indre diameter) over området der stål rør og PE-20 møtes. Bøy stålrør til en ~ 120 ° vinkel og skill hvert rør av ~ 45 °. Plasser ferdig riggen i en klatt av medisinsk silikon slik at PE-20 rør er loddrett og endene av rustfritt stålrør utover limet (figur 1C). Tillat denne for å stille for 24h. 2. Kirurgisk kateterisering Før kirurgi, sterilisere katetre med 70% etanol, fyll dem med heparinisert saltvann (200 U heparin / ml saltvann) og sett i rustfritt stål plugger. Anesthetize mus, fortrinnsvis ved hjelp av en metode som kontinuerlig leverer anestesimiddel (f.eks inhalert isofluran). Bruk steril teknikk, fjerne hår fra snittet områder ved hjelp clippers og / eller en hårfjerningskrem krem og desinfiser huden med alkohol etterfulgt av en betadine skrubb. For kateterinnleggelse, fjerne hår påregionen som strekker seg fra underkjeven til toppen av brystkassen og mellom clavicles. For eksternalisering av kateter bak hodet, fjerne hår i området mellom bunnen av skallen og interscapular regionen og desinfiser huden med alkohol etterfulgt av en betadine skrubb. Legg musen på ryggen på en varmende overflate og under visning området av et kirurgisk mikroskop. Fest halen og ekstremiteter med kirurgisk tape. Sikre hodet i nesen kjegle levere anestesi. Lag en liten vertikalt midtlinjen snitt 5 mm cephalica til brystbenet. Bruk pinsett, sløv dissekere vevet å eksponere venstre sternomastoid muskel. Reflektere denne muskelen å eksponere venstre carotisar. Forsiktig tease off bindevev fra arterien. Det er viktig på dette punktet for å isolere vagus nerven fra en arterie uten å skade verken arterien eller nerven. Isoler arterien og ligate den cephalica enden med silke sutur. Løst knute annenstykke sutur på caudal slutten av utsatte fartøyet. Clamp fartøyet med en micro-serrefine klemme på den bakre enden og kuttet like nedenfor ligated enden med våren saks. Forsiktig inn kateter så langt som klemmen. Nøye slipp mikro-serrefine klemme og forhånd kateteret til silastic-PE krysset. Tie både ligaturer sikkert til kateteret og bekrefter at kateteret prøvene ved å koble den frie enden av kateteret til en sampling sprøyte. Gjør et annet snitt 5 mm til høyre for midtlinjen og ca 2 mm caudal til den første snittet. Bruk pinsett, sløv dissekere vevet å avsløre og isolere høyre vena jugularis. Nøye ligate den cephalica ende med silke sutur og løst slips annen bit av sutur ved caudal slutten. Klipp rett nedenfor cephalica ligaturen med våren saks og sette kateteret opp til besøksforbud perle. Tie en sutur bak perle og bekrefter at kateteret prøvene. Turn musen over og lage et lite snitt mellom skulderbladene. Tunnel en 14-gauge nål under huden fra snittet for arteriekateter, på forsiden av musen, til interscapular snitt på baksiden. Tre arteriekateter gjennom nålen å exteriorize det på baksiden av musen. Gjenta dette for vena jugularis kateter ved tunnel på 14-gauge nål under huden på høyre side av musen fra snittet nettstedet på forsiden til interscapular snitt på baksiden. Klem arteriekateter med en micro-serrefine klemme på innsnitt området mellom skulderbladene. Skjær kateteret ~ 1 cm over denne klemmen. Plasser MASA tm med rustfritt stål kontaktene vender mot hodet av musen. Koble arteriekateter til rustfritt stål kontakten pekte mot venstre side av musen. Pass på å sikre at det ikke er hull eller knekk på kateteret. Gjenta for venekateter,koble den til rustfritt stål kontakten peker til høyre side av musen. Sett MASA tm i snitt mellom skulderbladene. PE-20 rør tilsvarer vena jugularis kateteret skal være til høyre side av musen og PE-20 rør tilsvarer arteriekateter bør ligge til venstre. Lukk ventral og dorsal snitt med nylon sutur. For dorsal stengetid, kan sutur kjøres gjennom herdet silikon av MASA tm å feste den på plass. Bekreft patency av kateter med en flushing løsning som inneholder heparinisert saltvann og antibiotika for å minimere risikoen for infeksjon. Plasser musen i en oppvarmet, rent bur for umiddelbar gjenoppretting. Figur 2 viser det ferdige produktet. La musen til å gjenopprette i minst 5 dager. Monitor vekt og generell helse. Utnytte den aktuelle postoperative smertestillende diett som er godkjent av institusjonens Animal Care ogBruk Committee. 3. Hyperinsulinemic-euglycemic klemme Rask musen for 5-6t. Som en referanse, refererer tiden t = 0 min til slutten av den raske og begynnelsen av insulin og glukose infusjonsvæske (dvs. klemmen perioden). Oppsettet og tidsplan for en typisk forsøk er vist i figur 3. Bruk Micro-Renathane eller tilsvarende slange for infusjon og prøvetaking linjer. Suspendere en dual-channel sving over musen. Dette fungerer som et knutepunkt mellom musen og infusjon / sampling sprøyter. Under eksperimentet forblir musen i et hjem bur eller lignende beholder, og er bundet til svivelen. Før tilkobling av mus, fyll arteriell prøvetaking linje med heparinisert saltvann (10 U heparin / ml saltvann) og plasser i rustfritt stål kontakten i bunnen slutten av linjen. Legg igjen en sprøyte med heparinisert saltvann (clearing sprøyte) koblet til toppen av prøvetaking linjen. Dette vil bli brukt til å trekke opp blod SAMPles. Fyll venøs infusjon linje med ikke-heparinisert saltløsning starter fra Infusjonsporten av svivelen (segment A i figur 3A) hele veien til bunnen av linjen. Plugg den øverste enden av linjen og plassere et rustfritt stål kontakt (eller en Y-kobling hvis en bolus skal administreres) nederst slutten av linjen. Hvis en isotop glukose tracer (f.eks [3 – 3 H] glukose) blir tilført, sikre en 1 ml sprøyte som inneholder tracer til en infusjon sprøyte. Fyll venøs infusjon linje med tracer istedenfor saltvann (Figur 3B). Tre timer inn i den raske, veie musen, og koble PE-20 for vena jugularis og arterielle katetre til infusjon og prøvetaking linjer, henholdsvis. Hvis administrere [3 – 3 H] glukose tracer, begynne en primet-kontinuerlig tracer infusjon ved t = -90 min (Figur 3C). En typisk priming dose er 1 μCi. Utarbeide en 0,05 μCi / mikroliter [3 – 3 H] glukose solution i ikke-heparinisert saltvann. Load løsningen i en 1 ml sprøyte og sikre sprøyten i en infusjonspumpe. Administrere priming dosen med infusjonen 20 mL / min for 1 min. Følg med en kontinuerlig infusjon på 0,05 μCi / min (1 mL / min) for en 90 min likevekt perioden. Forbered infusates av insulin og glukose. Insulin er utarbeidet i ikke-heparinisert saltløsning som inneholder 3% plasma som en transportør (en passende konsentrasjon av BSA kan også brukes). Glukose infusates er kommersielt tilgjengelig i en rekke konsentrasjoner (5, 20 og 50%). Forbered saltvann-vasket erythorocyte infusate ved å få fullblod fra en donor mus, helst av samme belastning bakgrunn som eksperimentell mus. Vanligvis 1 ml av fullblod er nødvendig per studere mus. Sentrifuge blod å skille erytrocytter. Vask erytrocytter med 10 U / ml heparinisert saltløsning og sentrifuger til å forkaste saltvann. Bestem volumet av erytrocytter og resuspender i et tilsvarende volum på 10 U / ml heparinized saltvann. Tegn hver infusate inn i en 1 ml sprøyte og sikker hver sprøyte til en individuell infusjonspumpe. Koble hver sprøyte til en 4-veis kontakt (figur 3). Ved t = -15 min ta en blodprøve ved sakte å utarbeide 50-100 mL av blod inn i clearing sprøyten. Klem arteriell prøvetaking linjen og fjern clearing sprøyten. Ved hjelp av en håndholdt glukose meter, ta et blodsukker lesing ved å fjerne klemmen på arteriell prøvetaking linjen og lar blodet å strømme inn i glukosemåler stripen. Når glukose måling er tatt, klemme den arterielle prøvetaking linjen og sette inn en stump-nål sprøyte (sampling sprøyte) inn i arteriell prøvetaking linjen. Fjern klemmen og tegne en mengde blod (se note) i prøvetaking sprøyten. Klem arteriell prøvetaking linjen og fjern prøvetaking sprøyten. Sett clearing sprøyten tilbake i arteriell prøvetaking linjen. Tegn opp på stempelet for å fjerne eventuelle luftbobler og re-fyller50-100 mL blod som opprinnelig var tegnet. Merk: Volumet av blod samplet avhenger analysen utføres. For eksempel, analyse av [3 – 3 H] krever glukosekonsentrasjonen 10 mL av plasma, så 50 mL blod er trukket. Dette gir 20-30 mL av plasma, som er tilstrekkelig for analyse pluss ekstra plasma hvis nødvendig. Målinger av hormoner og andre metabolitter (f.eks insulin, frie fettsyrer) krever prøvetaking av ekstra blod. Tilsett blod i prøvetaking sprøyten inn en EDTA-belagt microtube. Sentrifuge og samle plasma. Hold plasma på is fram til slutten av studien eller umiddelbart butikken ved -20 ° C. Gjenta trinn 3,10 gjennom 3,12 ved t = -5 min. Innhente ytterligere blod (50 mL) for måling av baseline plasma insulin nivåer. Mål baseline hematokrit ved å tegne blod inn i et heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør. Målingene innhentet from plasmaprøver ved t = -15 og -5 min representere baseline (dvs. faste) verdier. Etter prøven ved t = -5 min, fylle infusjon linjer for glukose, insulin og salt-vasket erytrocytter opp til 4-veis kontakt. Koble 4-veis kontakten til slangen er festet til svivelen Infusjonsporten (eller slange koblet til Y-kobling hvis infusjonen [3 – 3 H] glukose) som vist i Figur 3. Begynn infusjonen saltvann-vasket erytrocytter først. Sett infusjonshastigheten å erstatte det totale volumet av blod blir samplet over varigheten av studien (f.eks hvis en total av 500 mL blod er samplet over 120 minutter av studien, sette infusjonshastighet til 4,2 mL / min). I motsetning til de andre infusates er erytrocytt løsningen rødt. Infusjonen denne løsningen gir først for eventuelle motstand eller hindringer i infusjonen linjer for å bli identifisert og korrigert. Når erytrocytt infusate når musen begynner insulin ogglukose infusjoner. Dette er nå t = 0 min. Insulin er tilført en konstant, forhåndsbestemt rate. En insulin infusjonshastighet på 4 mU • kg -1 • min -1 vil typisk undertrykke endogen glukose produksjonen med 80-100% og stimulere glukose forsvinning av 2-3 fold. Den innledende glukoseinfusjon rate (GIR) er estimert basert på baseline blodsukker og tidligere erfaring. Hvis infusjonen [3 – 3 H] glukose, kan man velge å øke tracer infusjonshastigheten for å matche den anslåtte økningen i glukose omsetningen (vanligvis en 2-3 ganger økning). Tatt i betraktning den høye frekvensen av glukose omsetningen i mus, bør blodprøver hentes fra den arterielle linjen ikke mindre enn hvert 10 min for måling av glukose konsentrasjon over varigheten av forsøket. Juster GIR å oppnå og opprettholde mål euglycemia (Figur 3C). Dette målet kan variere avhengig av modell eller formålet med studien. Et godt mål glucose konsentrasjon er 150 mg • L-1 siden dette er en typisk 6t fastende glukose nivå for en chow-matet C57Bl/6J mus. Målet er å oppnå euglycemia raskt, helst innen de første 40-50 min, og for å ha glukose og GIR stabil ved begynnelsen av steady-state periode (t = 80 min). Hvis infusjonen [3 – 3 H] glukose, innhente ytterligere blod på t = 80, 90, 100, 110 og 120 min for måling av plasma [3 – 3 H] glukose spesifikke aktivitet. Samle ekstra blod ved t = 100 og 120 min for måling av plasma insulin og andre hormon (s) eller metabolitten (e). Ved t = 110 min, trekker blodet inn i en heparin-eller EDTA-behandlede kapillarrør for måling av klemme hematokrit. Etter prøven ved t = 120 min er tatt, 2 [14 C] deoxyglucose kan gis for måling av vev-spesifikke glukoseopptaket. Administrere en 12 μCi bolus inn i bolus linjen koblet til jugularis prøvetaking linje (Figur 3B </strong>). Innhente blodprøver (50 mL) fra den arterielle prøvetaking linjen ved t = 2, 15, 25 og 35 min etter inntak av bolus for måling av plasma 2 [14 C] deoxyglucose nivåer. Etter den siste prøven, anesthetize musen med en infusjon av pentobarbital gitt direkte inn i arteriell linjen. Raskt dissekere noen vev er nødvendig for vurderingen av glukoseopptak (f.eks skjelettmuskulatur av ulike typer, fettvev, hjerte, hjerne) og eventuelle andre vev (for eksempel lever, milt, nyrer). Snap fryse vev i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C til de analysert. Tissue glukose er analysert ved å måle akkumulasjon av fosforylert 2 [14 C] deoxyglucose i frosset vev og forsvinningen av 2 [14 C] deoxyglucose fra plasma. Fire. Representant Resultater Et eksempel på resultatene oppnådd fra et insulin klemme forsøket er vist i Figur 4.Dette eksempelet viser evne til et fettrikt kosthold for å fremskynde insulinresistens hos mus. Alle presentasjoner av insulin klemme resultater må inneholde følgende å bli tolke: en gang i løpet av blodsukker, en tid løpet av GIR og plasma insulin nivåer (baseline og klemme). Som vist her, fastende glukose (figur 4A) og insulin (Figur 4C) nivåene er høyere i mus matet en høy fett diett, som tyder på insulinresistens. Presentere en tid i løpet av blodsukkeret gjennom hele klemme studien (figur 4A) tillater leseren å vurdere hvor godt euglycemia ble opprettholdt, noe som er en indikasjon på kvaliteten av klemmen. Tilsvarende tillater en gang løpet av GIR (Figur 4B) leseren å avgjøre hvor raskt en steady-state ble oppnådd. Viser disse dataene ettersom tiden kurs er betydelig mer informativ enn den konvensjonelle praksis i musen insulin klemmen litteratur av å presentere en 2-timers eksperimentsom en enkelt datum punkt representerer gjennomsnittsverdier fra en udefinert "klemme" perioden (4-13). I dagens eksempel, var blodsukkeret lik mellom kontroll og høye fett-matet grupper, men GIR var signifikant lavere i høy fett-matet gruppe (Figur 4B). Dette er et tegn på en svekkelse i hele kroppen insulin action. Clamp insulin nivåene var også høyere i høy fett-matet gruppe (Figur 4C), noe som ytterligere støtter tilstedeværelsen av en insulin resistent fenotype i disse musene. Bruk av isotoper tracer infusjoner gjør for vurdering av insulin action i bestemte vev. [3 – 3 H] glukose brukes til å anslå frekvensen av endogen glukose utseende (Endora), som er en indeks av hepatisk glukoseproduksjon (HGP) og frekvensen av hele kroppen glukose forsvinning (Rd). Mens insulin helt undertrykker HGP i kontroll mus, dette er svekket i mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4D). Likeledes evne til isulin å stimulere Rd i kontroll mus er kompromittert på mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose brukes for å vurdere glukose metabolske indeks (RG), et mål av vev-spesifikke glukoseopptaket. Som vist i dette eksemplet er insulin-stimulert glukoseopptak i skjelettmuskulatur svekket i mus fôret med et fettrikt kosthold (Figur 4F). Figur 1: Utarbeidelse av arteriell (A) og (B) venøse katetre og (C) MASA tm. Arterielle katetre er forberedt ved å sette inn en 1,3 cm stykke av PE-10 ca 3 mm inn i en 6 cm stykke 0.012 "ID silastic. PE-10 spissen er skrå slik at lengden fra bevel til silastic er 0,9 cm. Venøse kateter er laget ved å skyve et lite stykke 0.020 "ID silastic 1,1 cm fra den skrå enden av en 6 cm stykke 0.012" ID silastic. Den 0.020 "ID silastic stykke fungerer som et besøksforbud perle å se kur kateteret til vena jugularis. For montering av MASA tm, hver av to 1,3 cm 25-gauge plugger settes inn i hver av to 3 cm biter av PE-20. Disse er holdt sammen av et lite stykke 0.040 "ID silastic. Kontaktene er bøyd til en 120 ° vinkel og skilt i 45 ° vinkel. Hele forsamlingen er nedsenket i medisinsk silikon. Figur 2: Catheterized mus. Kateter er implantert i venstre carotisar og høyre vena jugularis. Den frie endene av kateter er externalized bak hodet og koblet til en MASA tm. Den MASA tm settes subkutant mellom skulderbladene. Dette åpner for vaskulær tilgang løpet insulin klemme eksperimenter uten behov for å begrense, håndtak eller anesthetize musen. jpg "/> Figur 3: Visning av oppsett og tidslinje for en insulin klemme eksperiment. Musen er tjoret til en dual-channel svivel som fungerer som en hub for infusjon og prøvetaking sprøyter. Typisk oppsett for eksperimenter ikke bruker tracer infusjoner (A) og bruker både [3 – 3 H] glukose og 2 [14 C] deoxyglucose (B) er vist. En tidslinje av prosedyrer for etablering og gjennomføring av insulin klemme (C) er også vist. Under klemmen, blodprøver ( ) Blir tatt hvert 10 min for å måle blodsukker. GIR er justert tilsvarende for å opprettholde euglycemia. Prøver for baseline blodsukker, plasma insulin, og plasma [3 – 3 H] glukose er tatt ved t = -15 og -5 min. Prøver for clamp plasma [3 – 3 H] glukose er tatt ved t = 80, 90, 100, 110 og 120 og for klemme insulin ved t = 100 og 120 min. 2 [14 C] deoxyglucose er gitt etter prøven ved t = 120 min og blood samles ved t 2 =, 15, 25 og 35 min etter. Vev er tatt etter t = 35 min prøve. Figur 4: Resultater fra en insulin klemme eksperiment sammenlikne mus på en kontroll kosthold (Chow) til mus på et fettrikt kosthold (HFD). Tid løpet av arteriell glukose (A) og GIR (B), baseline og klemme insulin (C), Endora (D), og Rd (E) og skjelettmuskelbetennelse (gastrocnemius og vastus lateralis) Rg (F) er vist. Alle resultater indikerer at effekten av høyt fettinnhold fôring å indusere insulinresistens.