Summary
نحن تصف
Abstract
طفيليات البلهارسيا هي العوامل المسببة للمرض البلهارسيا ، وهو مرض مزمن يؤثر على المنهكة أكثر من 200 مليون شخص حول العالم ويحتل المرتبة الثانية بعد الملاريا من بين الأمراض الطفيلية في مجال الصحة العامة وآثار اجتماعية واقتصادية (1-4). طفيليات البلهارسيا والديدان مثقوبة مع دورة حياة معقدة تتبادل بين الحياة الطفيلية في الثدييات والرخويات المضيفين مع التدخل السباحة الحرة مراحل. لفترة وجيزة ، حرر السباحة cercariae تصيب مجموعة الثدييات عن طريق اختراق الجلد مع المعونة من البروتياز يفرز ، خلال الوقت الذي تفقد cercariae ذيولها ، تتحول schistosomules. يجب أن تهرب الآن schistosomules النظام المضيف المناعي ، ووضع القناة الهضمية للهضم من خلايا الدم الحمراء ، وعلى الرغم من أن ترحيل الرئتين والدورة الدموية بوابة طريقها إلى وجهتها النهائية في الكبد ونظام البوابة في نهاية المطاف الأوردة المساريقي (لS. المنسونية) حيث الذكور والإناث والديدان لم الزوج ، وتنتج مئات من البيض يوميا. تفرز بعض البيض من الجسم في المياه العذبة ، حيث يفقس البيض في السباحة الحرة miracidia (5-10). وتصيب أنواع القواقع miracidia محددة وتحويلها الى sporocysts الأم وابنتها ، والتي بدورها ، تنتج cercariae المعدية ، واستكمال دورة الحياة. للأسف ، لا يمكن كامل دورة حياة البلهارسيا يمكن تربيتها في المختبر ، ولكن يمكن أن تتحول إلى عدوى cercariae schistosomules ، ويمكن تربيتها في schistosomules لأسابيع لتحليل التنمية البلهارسيا في المختبر أو تحليل ميكروأري. في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم وصفا للتحول بالمذنبات البصرية واستزراع schistosomules المختبر. تسلط علينا من cercariae المعدية ذات السرتين الجرداء الحلزون المضيف وتحويل يدويا لهم في فصل schistosomules التي ذيولها باستخدام الاستحلاب المزدوج انتهت الإبرة. وصف التحول في المختبر بالمذنبات وتقنيات الثقافة schistosomules تجنب استخدام مجموعة الثدييات ، والذي يبسط التصور من البلهارسيا ويسهل جمع الطفيلي للتحليل تجريبي. التحول في المختبر وتقنيات زراعة من البلهارسيا وقد تم القيام به لسنوات (11 ، 12) ، ولكن لم توضع بروتوكولات البصرية التي تتوافر للمجتمع الدولي بأسره.
Protocol
تدابير السلامة :
يمكن cercariae البلهارسيا اختراق الجلد مباشرة من دون حاجة لخفض أو المسام ، وتسبب مرض البلهارسيا من الأمراض المزمنة. S. المنسونية هو مستوى السلامة الحيوية 2 الكائن ، وبالتالي السليم معدات الحماية الشخصية ويجب اتباع تدابير السلامة المناسبة عند العمل مع المذنبات المعدية. معظم المعدات اللازمة للنمو وتحويل البلهارسيا هو المعيار ، مع وجود استثناءات قليلة لاحظت المفتاح في الجدول في نهاية البروتوكول. وينبغي القيام بجميع الأعمال بالمذنبات في غرفة منعزلة. وينبغي أن المثقف Schistosomules في العقيمة ، وافق هود للسلامة الأحيائية. وينبغي أن ترتديه من طبقتين أو النتريل قفازات مطاطية ، كما ينبغي أن معطف المختبر ، وزوج من الأحذية للماء ، والسراويل مع عدم وجود ثقوب أو الدموع ، وحماة الأكمام ماء لمعصميك والأسلحة. في حالة وجود تسرب عرضي ، رش المنطقة الملوثة فورا مع الايثانول 70 ٪ أو 10 ٪ التبييض ، وفرك بقوة إذا كان على الشخص الخاص. هذا سوف يكون كافيا لتعطيل الطفيلي ، ولكن ينبغي الإبلاغ عن جميع حالات العدوى المحتملة وتؤخذ على محمل الجد. على الرغم من schistosomules ليست معدية بالفطرة ، والمبادئ التوجيهية المؤسسية تختلف ، وينبغي استشارة لتحديد ما إذا كان يلزم BSL2 الاحتياطات خلال مراحل الحياة غير المعدية. تطهير جميع الأسطح التي تتلامس مع أي مادة قد تكون معدية بعد تنفيذ التجربة والتخلص من النفايات في حاوية an بيولوجية المعتمدة.
ملاحظة : صناديق غطاء الحلزون المضيف 1-2 قبل أيام من إلقاء الضوء وحمايتها من
1. حصاد cercariae من المضيف الحلزون
- شغل نظيف وخال من دورق 500mL المنظفات الكامل في منتصف الطريق مع الماء المقطر معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة. إذا كان يعمل مع القواقع المضيفة المصابين miracidia في تواريخ مختلفة ، واستخدام كوب منفصلة لكل تاريخ العدوى (وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان سيتم استخدامها لاجراء تجارب على القواقع في المستقبل). يمكن حجم الدورق أيضا أن تكون أصغر اعتمادا على تجربة المستخدم.
- يستضيف جمع القواقع المصابة ترغب في إلقاء ودائع بعناية في الدورق باستخدام معيار صافي أسماك الزينة وملقط الغرض العام حسب الحاجة.
- درج دورق مكان على بقعة الطوارئ حوالي 8 إلى 12 بوصة تحت مصدر ضوء ساطع. اسمحوا الوقوف لمدة 1-2 ساعات تحت الضوء. Cercariae خروج المضيف الحلزون عند التعرض لضوء ساطع.
- تصفية بعناية القواقع من خليط cercariae. اتخاذ احتياطات السلامة الإضافية ، كما هو مزيج شديد العدوى. تذكر ، cercariae يمكن ان تخترق الجلد مباشرة الإنسان!
- استبدال المخلوط تحت مصدر الضوء لمدة 15 دقيقة ، مما يسمح أي مسألة النفايات الجسيمات إلى تسوية.
- نقل cercariae في دورق مخروطي نظيف باستخدام الماصة ، وتجنب الحطام في قاع الكأس. ضع قارورة في حوالي زاوية 45 درجة على الجليد في الظلام لمدة 45 -- 60 دقيقة ، مما يسمح لتسوية cercariae في زاوية واحدة.
- استخدام الماصة 50 مل لإزالة 75-90 ٪ من طاف وايداعها في دورق يحتوي على مواد التبييض 10 ٪ أو 70 ٪ من الإيثانول ، مع الحرص على عدم السماح لقطرات المياه التي تحتوي على بالتنقيط cercariae من الماصة.
- دوامة في دورق مخروطي يحتوي على cercariae برفق لresuspend في cercariae في الحل. استخدام الماصة لنقل العينة إلى أنابيب معقمة مل 50 المخروطية. مكان الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 20 دقيقة في الظلام. سوف Cercariae تسوية نحو الجزء السفلي من أنبوب في الظلام.
2. دليل لتحويل cercariae schistosomules
قبل البدء : قم RPMI 1640 كاملة (RPMI ، 5 ٪ مصل بقري جنيني ، 1X القلم / بكتيريا) ودافئة إلى 37 درجة مئوية. (ومن الأهمية بمكان أن تم المعطل المصل البقري الأجنة المستخدمة من قبل الحضانة a 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والبلهارسيا يمكن أن تكون حساسة لتكملة).
- في قلنسوة واقية ، وإزالة طاف وصولا الى 5-10 مل من الحل في كل مخروطية 50 مل باستخدام pipettor أو جهاز فراغ.
- إرفاق قياس 22 المزدوج انتهت ، luer لوك الاستحلاب الإبرة إلى حقنة بحجم مناسب.
- رسم ببطء الخليط في المحاقن. جمع cercariae من جميع الأنابيب في 50 مل حقنة. تكون منتبهة لنازف.
- بدوره عبر حقنة بعناية بحيث نهاية الإبرة غير مرتبط متروك. حقنة أخرى نعلق على هذا الجانب من الإبرة الاستحلاب.
- تمرير الخليط من خلال إبرة ما مجموعه 40 مرات (20 مرات ذهابا وإيابا) لتحويل cercariae.
- موقف مثل المحاقن عموديا محتواة الخليط في المحقنة القاع ورأس المحقنة فارغة. إزالة وتطهير حقنة الأعلى في الايثانول 70 ٪.
- انخفاض مزيج الودائع قطرة في ارتفاع الجدران نظيفة طبق بيركس س 100mm 50mm أو صحن بلورة. تعقيم الإبر والمحاقن في الايثانول 70 ٪.
- إضافة 37 درجة مئوية RPMI 1640 كاملة وسائل الإعلام هذه أنغير مغطاة بالكامل الجزء السفلي من طبق بيتري ، كما لو صب طبق مرق لوريا.
- دوامة برفق لجمع schistosomules في وسط صحن بتري. تجنب الرش.
ملاحظة : قد يكون مفيدا لإيقاف ضوء غطاء لهذه الخطوة إلى مزيد من كاف تصور schistosomules في المركز. - إيداع فورا schistosomules تتركز في الطازجة جيدا الخلية 12 لوحة الثقافة جيدا باستخدام قطارة معقمة.
- كرر 2.9 و 2.10 حتى schistosomules لم تعد موجودة في وسط الطبق (حوالي 10 مرات). إيداع كل مجموعة لاحقة في بئر جديدة.
- ملء كل بئر يصل في منتصف الطريق (~ 1،5 مل) مع وسائل الاعلام RPMI prewarmed كاملة.
- تصور على مجهر مقلوب للتحقق من وجود وعدم وجود schistosomules cercariae.
- تنمو في حاضنة schistosomules CO 2 تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
3. ممثل النتائج :
وينبغي نقل بانتظار تحويلها إلى وسائل الإعلام schistosomules الثقافة والتصور تحت مجهر مقلوب مشرق الميدان (انظر الجدول معدات للحصول على مثال) العائد صورة مشابهة إلى الشكل 1 ، الذي تحول schistosomules فقط موجودة في البئر. يمكن أن تشمل الملوثات المحتملة cercariae سليمة ، والذيول بالمذنبات قطعت ، أو غيرها من الحطام. إذا لم يتوفر مجهر مقلوب ، وسوف المجهر القياسية أو حتى على نطاق تشريح تكون كافية لتصور schistosomules. علما أن هذا الإجراء لا يحول دائما 100 ٪ من cercariae.
الشكل 1 : تحولت Schistosomulum
الشكل 2 : Cercariae والذيول المجزأة
Discussion
يمكن أن تنشأ عدة مشاكل محتملة أثناء إجراء التحويل ، إلا أن هذا البروتوكول يهدف إلى تفادي معظم هذه المشاكل. أحد الأخطار المحتملة هو انسداد الإبرة الاستحلاب ، والذي ينشأ عادة بسبب الحطام التي خلفها الحصاد في الخطوة 1.3. تأكد من السماح لجميع الجسيمات ليستقر في الخطوة 1.5 و لنقل cercariae بعناية في الخطوة 1.6 لتجنب هذه المشكلة. أيضا ، كما هو موضح من قبل ، والعمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، واستخدام معدات الحماية الشخصية (حتى دروع لحماية الوجه) ، وتجنب الضغط الزائد على المحاقن مستحسنة.
يمكن فصل بالمذنبات ذيول يمكن تصور في وسائل الإعلام ، مما يدل على الفقراء خلال فصل الخطوة 2.9. ذيول يحمل اقتراحا مثل تشنج ولها شكل متميز (انظر الشكل 2) ، ويتم تمييزها بسهولة thusly من schistosomules. يمكن إزالة ذيول بواسطة غسل schistosomules تتجاوز RPMI كاملة schistosomules السماح لتسوية. وسوف تظل عائمة ذيول ويمكن إيقاف بالمكنسة الكهربائية.
إذا cercariae سليمة موجودة في وسائل الإعلام ، لم ينفذ هذا التحول في الخطوة 2.5 بشكل صحيح. ويصور مشهدا لالمذنبات سليمة في الشكل 3B كمرجع. إذا كانت هذه المشكلة ، التأكد من أن الإبرة الاستحلاب المستخدمة هي من الحجم المناسب. أيضا ، يمكن زيادة عدد المرات التي يتم تمريرها من خلال خليط بالمذنبات الإبرة ، على الرغم من 40 مرة هو عادة أكثر بكثير مما يكفي لتقترب من 100 ٪ من قص ذيول بالمذنبات.
وكان أول وصف التحول من المذنبات في schistosomules في عام 1974 وWikel كولي (13). منذ ذلك الحين ، أنجز إعداد schistosomules باستخدام استراتيجية القص مع الإبر والمحاقن على النحو المبين في هذا البروتوكول ، أو باستخدام نهج vortexing والمنفصلين مع تدرجات لpercoll (14 ، 15) أو تحريكها كما هو موضح في هذه الورقة. موصوفة بجمال هذه التقنيات اثنين من أجل التحضير لويس schistosomules فريد (16) ولمزيد من المعلومات عن زراعة مزيد من schistosomules للنمو على المدى الطويل يمكن العثور عليها في مركز الموارد البلهارسيا المعدية ( www.schisto - resource.org ).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل ريزيرف الأموال الغربية التي قدمت إلى جامعة بدء التشغيل E. جولي. وقدمت القواقع المصابة من قبل مركز المعلومات البلهارسيا ، NIH - المعدية (NIAID العقد رقم HHSN272201000009I). كما نشكر جلالة الملك وكريس رونالد بلانتون للحصول على الدعم في تأمين القواقع المصابة والبلهارسيا لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22g x 2-7/8" Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M.
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F.
