Summary
Se describe un
Abstract
Parásitos esquistosoma son los agentes causantes de la esquistosomiasis, una enfermedad crónica debilitante que afecta a más de 200 millones de personas a nivel mundial y ocupa el segundo lugar de la malaria entre las enfermedades parasitarias en términos de salud pública y el impacto socio-económico (1-4). Parásitos esquistosoma son gusanos trematodos con un ciclo de vida complejo intercambio entre una vida parasitaria en los ejércitos de moluscos y mamíferos, con intervención de nado libre etapas. En pocas palabras, libre cercarias infectar a un huésped mamífero, penetrando la piel con la ayuda de proteasas secretadas, tiempo durante el cual las cercarias perder sus colas, transformándose en schistosomules. El schistosomules ahora deben evadir el sistema inmune del huésped, desarrollar un intestino para la digestión de las células rojas de la sangre, y aunque la migración de los pulmones y la circulación portal en ruta hacia su destino final en el sistema porta hepática y, finalmente, las venas mesentéricas (por S. mansoni) en par de gusanos machos y hembras y aparearse, produciendo cientos de huevos cada día. Algunos de los huevos son excretados del cuerpo en el agua dulce, donde los huevos se transforman en miracidios que nadan libremente (5-10). Los miracidios infectar a especies concretas de caracol y se transforman en esporocistos madre e hija, que a su vez, producen cercarias infectantes, completando el ciclo de vida. Por desgracia, todo el ciclo de vida de esquistosomas no pueden ser cultivados in vitro, pero cercarias infecciosas se pueden transformar en schistosomules, y el schistosomules pueden ser cultivadas durante semanas para el análisis del desarrollo de esquistosoma en la vitro o el análisis de microarrays. En este protocolo, se presenta una descripción visual de la transformación de cercarias y cultivo in vitro de schistosomules. Nos despojamos de cercarias infecciosas del caracol Biomphalaria glabrata de acogida y de forma manual los transforman en schistosomules separando la cola con un emulsionante aguja de doble punta. El in vitro y técnicas de transformación de cercarias schistosomules cultura describe evitar el uso de un huésped mamífero, lo que simplifica la visualización de los esquistosomas y facilita la recolección de los parásitos para el análisis experimental. Transformación in vitro y técnicas de cultivo de los esquistosomas se han hecho durante años (11, 12), pero no existen protocolos visuales han sido desarrollados que están disponibles para toda la comunidad.
Protocol
Las medidas de seguridad:
Cercarias esquistosoma puede penetrar directamente en la piel sin las necesidades de un corte o los poros y causa la esquistosomiasis enfermedades crónicas. S. mansoni es un nivel de bioseguridad 2 organismo, por lo tanto, el equipo de protección personal y las medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con cercarias infecciosas. La mayoría de los equipos necesarios para crecer y transformar la esquistosomiasis es estándar, con algunas excepciones clave pocas indica en la tabla al final del protocolo. Todo el trabajo de cercarias se debe hacer en una habitación aislada. Schistosomules deben ser cultivadas en una campana estéril, aprobado bioseguridad. Dos capas de nitrilo o guantes de látex deben ser usados, así como una bata de laboratorio, resistente al agua un par de zapatos, pantalones sin agujeros o rasgones, y protectores a prueba de agua la manga para las muñecas y los brazos. En el caso de un derrame accidental, pulverizar inmediatamente el área contaminada con etanol al 70% o 10% de lejía, frotar vigorosamente si en su persona. Esto será suficiente para desactivar el parásito, pero todas las posibles infecciones deben ser informados y tomados en serio. Aunque schistosomules no son netamente infeccioso, las directrices institucionales varían, y debe ser consultado para determinar si BSL2 precauciones son necesarias durante las etapas de la vida no infecciosas. Desinfecte todas las superficies que entran en contacto con cualquier sustancia potencialmente infecciosos después de que el experimento se lleva a cabo y deseche los residuos en un contenedor de riesgo biológico aprobado.
NOTA: la cubierta contenedores caracol 1 a 2 días antes de su vertimiento y protegerlo de la luz
1. La recolección de las cercarias caracol
- Llene un vaso limpio, libre de 500 ml de detergentes medio llena con agua destilada equilibrarse a temperatura ambiente. Si se trabaja con los caracoles huésped infectado con miracidios en fechas diferentes, utilizar un vaso para cada fecha de la infección (Esto es especialmente importante si los caracoles serán reutilizados para futuros experimentos). El tamaño del vaso también puede ser menor dependiendo de la experiencia del usuario.
- Recoge los huéspedes infectados caracol que desea arrojar y depositar con cuidado en el vaso con un pez de acuario estándar de red y las pinzas de uso general, según sea necesario.
- Colocar en un vaso de precipitados de emergencia para derrames bandeja de aproximadamente 8 a 12 pulgadas por debajo de una fuente de luz incandescente. Deje reposar durante 1-2 horas a la luz. Cercarias salir del caracol cuando se expone a la luz brillante.
- Cuidadosamente filtra los caracoles de la mezcla de cercarias. Tome las precauciones de seguridad adicionales, como una mezcla es altamente infecciosa. Recuerde, cercarias directamente pueden penetrar la piel humana!
- Vuelva a colocar la mezcla en la fuente de luz durante unos 15 minutos, permitiendo que cualquier material de desecho de partículas se asienten.
- Transferencia de cercarias en un erlenmeyer limpio usando una pipeta, evitando la suciedad en el fondo del vaso. Colocar el matraz aproximadamente a un ángulo de 45 ° sobre el hielo en la oscuridad durante 45 - 60 minutos, lo que permite cercarias para establecerse en una esquina.
- Utilice una pipeta de 50 mL para eliminar 75 a 90% del sobrenadante y depositarlo en el vaso que contiene lejía al 10% o 70% de etanol, teniendo cuidado de no dejar que las gotas de agua que contienen cercarias por goteo de la pipeta.
- Agitar el matraz Erlenmeyer que contiene cercarias suavemente para volver a suspender las cercarias en la solución. Use una pipeta para transferir la muestra a la estéril tubos de 50 ml cónicos. Coloque los tubos de nuevo en hielo durante 20 minutos en la oscuridad. Cercarias se depositarán en el fondo del tubo en la oscuridad.
2. Transformación manual de cercarias al schistosomules
Antes de empezar: Asegúrese RPMI 1640 completo (RPMI, el 5% de suero fetal bovino, 1X penicilina / estreptomicina) y calentar a 37 º C. (Es muy importante que el suero fetal bovino utilizado ha sido inactivada por incubación a 56 ° C durante 1 hora como esquistosomas pueden ser sensibles al complemento).
- En una campana de riesgo biológico, eliminar el sobrenadante a un 5 a 10 ml de solución en cada uno cónico de 50 ml con una pipeta o un dispositivo de vacío.
- Adjunte una de calibre 22 de doble punta, luer lok emulsionante aguja a una jeringa de tamaño adecuado.
- Dibujar lentamente la mezcla en la jeringa. Recoger cercarias de todos los tubos de 50 ml en una jeringa. Esté atento de goteo.
- Con cuidado, gira la jeringa sobre manera que el extremo aguja separada está para arriba. Añada otra jeringa a este lado de la aguja emulsionante.
- Pase la mezcla a través de la aguja de un total de 40 veces (20 veces de ida y vuelta) para transformar las cercarias.
- La posición de la jeringa verticalmente de manera que la mezcla está contenida en la jeringa y la parte inferior de la jeringa superior está vacía. Retire la jeringa encima y desinfección en el 70% de etanol.
- Fuerte caída de la mezcla a gota en un recipiente limpio de alta amurallada plato 100mm x 50mm pyrex o cristalizador. Desinfectar agujas y jeringas en un 70% de etanol.
- Añadir 37 ° C medio RPMI 1640 completo de manera que elparte inferior de la placa de Petri está totalmente cubierta, como si el vertido de un plato de caldo de Luria.
- Hágalo girar suavemente para recoger schistosomules en el centro de la placa de Petri. Evitar salpicaduras.
Nota: Puede ser útil para apagar la luz de campana para dar este paso para visualizar más adecuadamente la schistosomules en el centro. - Inmediatamente depósito schistosomules concentrado en un nuevo máximo de 12 y placa de cultivo celular y mediante un gotero estéril.
- Repetir 2.9 y 2.10 hasta schistosomules ya no están presentes en el centro del plato (aproximadamente 10 veces). Depósito de cada uno posterior recogida en un lugar bien fresco.
- Llene cada uno bien hasta la mitad (alrededor de 1,5 ml) precalentado con medio RPMI completo.
- Visualizar en un microscopio invertido para verificar la presencia de schistosomules y la ausencia de cercarias.
- Crecimiento de la schistosomules en una incubadora de CO 2 fijado a 37 ° C y 5% de CO 2.
3. Los resultados representativos:
Transferencia pendiente de schistosomules transformado en medios de cultivo, la visualización en una brillante invertido microscopio de campo (ver tabla de equipos para un ejemplo) debería dar una imagen similar a la Figura 1, en el que sólo schistosomules transformado están presentes en el pozo. Los contaminantes potenciales podrían incluir cercarias intacto, cortó las colas de cercarias, u otros desechos. Si no se dispone de microscopio invertido, un microscopio estándar o incluso un alcance disección será suficiente para visualizar el schistosomules. Tenga en cuenta que este procedimiento no siempre es transformar el 100% de cercarias.
Figura 1: Transformada schistosomulum
Figura 2: Ruptura de las colas y Cercariae
Discussion
Varios posibles problemas podrían surgir durante el proceso de transformación, sin embargo, este protocolo está diseñado para evitar la mayoría de estos problemas. Un peligro potencial es la obstrucción de la aguja emulsionantes, que se presenta generalmente debido a los escombros sobrantes de la cosecha en el paso 1.3. Asegúrese de permitir todas las partículas que se asientan en el paso 1.5 y la transferencia de las cercarias con cuidado en el paso 1.6 para evitar este problema. Además, como se ha descrito antes, trabajando dentro de una cabina de seguridad biológica, la utilización de equipos de protección personal (incluso protectores para la cara) y evitar una presión excesiva sobre las jeringas es aconsejable.
Las colas cercarias pueden ser visualizados en los medios de comunicación, lo cual es indicativo de la separación de los pobres durante el paso 2.9. Las colas muestran un movimiento similar al espasmo y tienen una forma distinta (ver Figura 2), y thusly se distinguen fácilmente de las schistosomules. Las colas pueden ser removidos por el lavado de la schistosomules de más de medio RPMI completo que permite la schistosomules a un acuerdo. Las colas se quedan flotando y se puede aspirar fuera.
Si cercarias intacto están presentes en los medios de comunicación, la transformación en el paso 2.5 no se ha ejecutado correctamente. Una imagen de una cercaria intacta se muestra en la Figura 3b de referencia. Si se produce este problema, asegúrese de que la aguja emulsionante que se utiliza es del tamaño adecuado. Además, el número de veces que se pasa la mezcla cercarias través de la aguja se puede aumentar, aunque el 40 veces suele ser mucho más que suficiente para alcanzar el 100% de corte de las colas de cercarias.
Transformación de la cercaria en schistosomules fue descrita por primera vez en 1974 por Colley y Wikel (13). Desde entonces, la preparación de schistosomules se ha hecho utilizando la estrategia de corte con una aguja y una jeringa como se describe en este protocolo, o utilizando un enfoque de agitación y se separa con gradientes de Percoll (14, 15) o girando como se demuestra en este trabajo. Estas dos técnicas para la preparación de schistosomules están muy bien descritas por Fred Lewis (16) y más información para el cultivo de más de schistosomules de crecimiento a largo plazo se puede encontrar en el NIAID recursos esquistosoma Center ( www.schisto-resource.org ).
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por los fondos de la Case Western Reserve University de inicio prevista para E. Jolly. Caracoles infectados fueron proporcionados por el Centro de Recursos esquistosoma, NIH-NIAID (NIAID Contrato No. HHSN272201000009I). También queremos agradecer a Chris King y Ronald Blanton de apoyo en la obtención de los caracoles infectados por esquistosomas y útil para los debates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22g x 2-7/8" Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M.
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F.
