Summary
אנו מתארים
Abstract
טפילים Schistosome הם סוכני סיבתי של schistosomiasis, מחלה כרונית מתישה המשפיעה על מעל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם ומדרגת השנייה מלריה בקרב מחלות טפיליות במונחים של בריאות הציבור חברתי כלכלי ההשפעה (1-4). טפילים Schistosome הם תולעים trematode עם מחזור חיים מורכב interchanging בין חיים טפילי ב המארחים molluscan ו יונקים עם התערבות חופשי שחייה שלבים. בקצרה, חופשי שחייה cercariae להדביק מארח יונקים ידי חודר את העור בעזרת פרוטאזות מופרש, במהלכן cercariae מאבדים את זנבותיהם, והופך schistosomules. Schistosomules חייב עכשיו להתחמק ממערכת החיסון המארח, לפתח בטן לעיכול של כדוריות דם אדומות, ולהעביר למרות הריאות ומחזור הדם הפורטל בדרכם ליעדם הסופי במערכת הפורטל הכבד, ובסופו של דבר הוורידים mesenteric (עבור ס mansoni) שם זכר ונקבה זוג תולעים ו להזדווג, ייצור מאות ביצים ביום. חלק מן הביצים מופרשים מהגוף לתוך מים מתוקים, שם הביצים בוקעות חופשי שחייה miracidia (50-10). Miracidia להדביק מינים חילזון ספציפיים להפוך sporocysts אם ובתה, אשר בתורו, לייצר cercariae זיהומיות, השלמת מחזור החיים. למרבה הצער, מחזור חיים שלם schistosome לא יכול להיות מתורבת במבחנה, אך cercariae זיהומיות ניתן להפוך schistosomules, ואת schistosomules יכול להיות מתורבת במשך שבועות לניתוח התפתחות schistosome במבחנה או ניתוח microarray. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור חזותי של טרנספורמציה cercarial ו culturing במבחנה של schistosomules. אנו לשפוך cercariae זיהומיות מן glabrata מארח חילזון Biomphalaria באופן ידני ולהפוך אותם schistosomules על ידי ניתוק זנבותיהם באמצעות emulsifying פעמיים הסתיים מחט. במבחנה cercarial שינוי וטכניקות schistosomules תרבות תיאר להימנע משימוש לארח יונקים, אשר מפשט להדמיה של schistosomes ומקל על אוסף של הטפיל לניתוח ניסיוני. בשינוי במבחנה טכניקות culturing של schistosomes נעשו במשך שנים (11, 12), אבל אין פרוטוקולים חזותי פותחו הזמינים הקהילה כולה.
Protocol
אמצעי בטיחות:
Cercariae Schistosome יכול לחדור את העור ישירות ללא לצרכים של חתך או נקבוביות, ולגרום schistosomiasis מחלה כרונית. S. mansoni הוא 2 רמת biosafety האורגניזם, ולכן מתאים ציוד מגן אישי ואמצעי בטיחות נאותה חייב להיות אחריו כאשר עובדים עם cercaria זיהומיות. רוב הציוד הדרוש לגדול ולהפוך schistosomes הוא רגיל, עם כמה יוצאים מן הכלל מפתח ציין בטבלה בסוף הפרוטוקול. כל עבודה cercarial צריך להיעשות בחדר מבודד. Schistosomules צריך להיות תרבותי ברדס סטרילי, biosafety אושרה. שתי שכבות של כפפות גומי או nitrile יש ללבוש, כמו חלוק מעבדה, זוג עמיד למים של נעליים, מכנסיים, ללא חורים או דמעות, מגיני שרוול אטום על פרק כף היד והזרועות צריכים. במקרה של דליפת מקרי, מיד לרסס שטח מזוהם עם אתנול 70% או 10% אקונומיקה, שפשוף נמרץ אם על האדם שלך. זה יהיה מספיק כדי לנטרל את הטפיל, אבל כל זיהום אפשרי צריך להיות מדווחים ברצינות. למרות schistosomules אינם מולד זיהומיות, הנחיות מוסדיים להשתנות, יש להתייעץ עם כדי לקבוע אם BSL2 אמצעי זהירות נדרשים בשלבי החיים noninfectious. לחטא את כל המשטחים אשר באים במגע עם כל חומר זיהומיות פוטנציאלי לאחר הניסוי מתבצע ולסלק פסולת במיכל Biohazard אושרה.
הערה: חילזון כיסוי מארח פחי 1-2 ימים לפני שפיכת ולהגן מפני אור
1. מסיק cercariae מהמחשב המארח חילזון
- ממלאים כוס נקייה, 500ml ללא דטרגנטים מלא באמצע עם מים מזוקקים equilibrated לטמפרטורת החדר. אם עובדים עם חלזונות מארח נגוע miracidia בתאריכים שונים, השתמש כוס נפרדת עבור כל תאריך זיהום (הדבר חשוב במיוחד אם חלזונות יהיה לעשות בה שימוש חוזר עבור ניסויים בעתיד). גודל הכוס יכול גם להיות קטן בהתאם החוויה של המשתמש.
- איסוף המארחים חילזון נגוע אתה רוצה לשפוך בזהירות להפקיד אותם בכוס באמצעות הדגים באקווריום סטנדרטי נטו מלקחיים למטרות כלליות לפי הצורך.
- כוס מניחים על מגש לשפוך חירום כ 8-12 ס"מ מתחת למקור ליבון קל. בואו לעמוד על 1-2 שעות תחת האור. Cercariae יציאה המארח חילזון בעת חשיפה לאור בהיר.
- בזהירות לסנן חלזונות מתערובת cercariae. קח אמצעי בטיחות נוספים, כמו תערובת היא מדבקת מאוד. זכור, cercariae יכולים לחדור ישירות לעור אנושי!
- החלף תערובת תחת מקור אור למשך כ 15 דקות, מה שמאפשר לכל עניין פסולת החלקיקים להתיישב.
- העברת cercariae לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי באמצעות pipet, הימנעות פסולת בתחתית הכוס. מניחים את הבקבוק על כ זווית של ° 45 על הקרח בחושך במשך 45-60 דקות, המאפשר cercariae להתיישב לפינה אחת.
- השתמש pipet 50 מ"ל להסיר 75-90% מכלל supernatant לבין הפקדת אותה כוס אקונומיקה המכיל 10% או 70% אתנול, נזהרת שלא לתת טיפות מים המכילים לטפטף cercariae מ pipet.
- מערבולת את הבקבוק המכיל Erlenmeyer cercariae בעדינות resuspend cercariae בתמיסה. השתמש pipet להעביר את המדגם ל -50 מ"ל סטרילי צינורות חרוטי. המקום צינורות שוב על קרח למשך 20 דקות בחושך. Cercariae יישב כלפי התחתון של הצינור בחושך.
2. שינוי ידני של cercariae כדי schistosomules
לפני שתתחיל: ודא RPMI 1640 מלאה (RPMI, 5% בסרום שור עוברית, 1X פן / סטרפטוקוקוס) וחם על 37 ° C. (זה חיוני כי בסרום שור העובר בשימוש כבר מומת על ידי דגירה של 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כמו schistosomes יכולים להיות רגישים כדי להשלים).
- במנדף Biohazard, להסיר supernatant עד 5 מ"ל עד 10 מתוך פתרון בכל חרוטי 50 מ"ל באמצעות pipettor או מכשיר ואקום.
- צרף מד 22 פעמיים הסתיים, luer Lok emulsifying המחט במזרק בגודל מתאים.
- לאט לאט לשאוב תערובת לתוך המזרק. איסוף cercariae מכל 50 צינורות מ"ל מזרק. היו קשובים שומן.
- בזהירות להפוך מזרק על כך שסוף מחט פנויות תלוי. צרף עוד המזרק בצד הזה של המחט emulsifying.
- לעבור את התערובת דרך המחט בסך הכל 40 פעמים (20 פעמים הלוך ושוב) להפוך את cercariae.
- מקמו את במאונך כגון מזרקים כי תערובת הכלול מזרק התחתונה את המזרק העליון ריק. הסר את המזרק העליון לחטא ב 70% אתנול.
- תערובת הפקדה טיפה אחר טיפה לתוך נקי גבוה צלחת חומה 100mm x 50mm פיירקס או צלחת גיבוש. לחטא מחט המזרק אתנול 70%.
- הוסף 37 ° C 1640 RPMI התקשורת להשלים כזהתחתית הצלחת פטרי מכוסה לחלוטין, כאילו שופך צלחת מרק לוריא.
- מערבולת בעדינות כדי לאסוף schistosomules במרכז צלחת פטרי. הימנע התזה.
הערה: זה יכול להיות שימושי כדי לכבות את האור מכסה המנוע של שלב זה בצורה נכונה יותר לדמיין את schistosomules במרכז. - מיד להפקיד schistosomules מרוכז לתוך צלחת תא טרי 12 גם בתרבות גם באמצעות טפטפת סטרילית.
- חזור על 2.9 ו - 2.10 עד schistosomules אינם מציגים במרכז צלחת (כ 10 פעמים). הפקדה כל אוסף הבאים בבאר טריים.
- מלא כל טוב באמצע הדרך (~ 1.5 מ"ל) עם prewarmed התקשורת RPMI להשלים.
- דמיינו על מיקרוסקופ הפוך לאמת את הנוכחות של schistosomules והיעדר cercariae.
- לגדל את schistosomules ב CO 2 באינקובטור מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2.
3. נציג תוצאות:
העברת בהמתנה של schistosomules הופכת התקשורת לתרבות, ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוכה (ראו טבלה ציוד למשל) אמור להניב תמונה דומה באיור 1, שבו רק schistosomules הפך נמצאים הבאר. מזהמים פוטנציאליים יכול לכלול cercariae שלם, זנבות cercarial ניתק, או פסולת אחרת. אם לא מיקרוסקופ הפוכה זמין, מיקרוסקופ רגיל או אפילו היקף דיסקציה יהיה מספיק כדי להמחיש את schistosomules. שים לב כי נוהל זה אינו תמיד להפוך 100% cercariae.
איור 1: Schistosomulum שינו
איור 2: Cercariae וזנבות הכרות
Discussion
בעיות פוטנציאליות כמה יכול להיווצר במהלך הליך השינוי, אולם בפרוטוקול זה נועד למנוע את רוב הבעיות הללו. אחת סכנה פוטנציאלית היא סתימת המחט emulsifying, אשר בדרך כלל עולה בשל פסולת שנשאר מן קצירת בשלב 1.3. הקפידו לאפשר לכל חומר חלקיקי להתיישב צעד 1.5 ולהעביר את cercariae בזהירות בשלב 1.6 כדי למנוע בעיה זו. כמו כן, כפי שתואר קודם לכן, עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שימוש בציוד מגן אישי (גם מגן פנים) והימנעות של לחץ מוגזם על המזרקים רצוי.
זנבות cercarial משפחתי ניתן דמיינו בכלי התקשורת, אשר מעיד על ההפרדה עניים במהלך שלב 2.9. זנבות התערוכה תנועה התכווצות דמויי יש צורה ברורה (ראו תרשים 2), thusly וניתן להבחין בקלות schistosomules. זנבות ניתן להסיר על ידי שטיפת schistosomules עודף של RPMI שלם המאפשר schistosomules להתיישב. זנבות יישאר צף והוא יכול להיות שאב משם.
אם cercariae שלם נוכחים בתקשורת, השינוי בשלב 2.5 לא בוצעה כראוי. תמונה של cercaria שלם מתואר באיור 3b לעיון. אם בעיה זו מתרחשת, להבטיח את המחט emulsifying בשימוש הוא בגודל הנכון. כמו כן, מספר פעמים את התערובת cercarial עובר דרך המחט ניתן להגדיל, אם כי 40 פעמים הוא בדרך כלל הרבה יותר מאשר מספיק כדי להתקרב הגז 100% של זנבות cercarial.
טרנספורמציה של cercaria לתוך schistosomules תוארה לראשונה על ידי קולי ו Wikel (13) בשנת 1974. מאז, הכנת schistosomules נעשה שימוש או אסטרטגיה הגז עם מחט ומזרק כמתואר בפרוטוקול זה, או באמצעות גישה vortexing ומופרד עם מילויים של percoll (14, 15) או מתערבל כפי שמודגם במאמר זה. אלה שתי טכניקות schistosomules הכנת מתוארים להפליא על ידי פרד לואיס (16) ומידע נוסף עבור culturing schistosomules נוספת של צמיחה לטווח ארוך ניתן למצוא משאבים NIAID מרכז Schistosome ( www.schisto-resource.org ).
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי Case Western Reserve University קרנות ההפעלה הניתן E. העליז. חלזונות אינפקטד סופקו על ידי מרכז משאבים Schistosome, NIH-NIAID (NIAID חוזה מס 'HHSN272201000009I). אנו מודים גם כריס המלך רונלד בלנטון תמיכה באבטחת חלזונות schistosome נגוע לדיונים מועילים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22g x 2-7/8" Emulsifying needle | Fisher Scientific | 14-825-17G | |
| RPMI 1640 Medium 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated | Invitrogen | 10082139 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Crystallizing Dish (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| General Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net for brine shrimp | Petco | SKU:1190954 |
References
- Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M.
- Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).
- Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis. Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).
- King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis. Lancet. 365, 1561-159 (2005).
- Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology. 124, 153-167 (2002).
- Grabe, K., Haas, W. Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration. Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).
- Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni. J Parasitol. 58, 476-480 (1972).
- Saladin, K. S. Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes. J Parasitol. 68, 120-124 (1982).
- Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum. Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).
- Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes. PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing. J Parasitol. 67, 179-185 (1981).
- Yoshino, T. P. &, Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J Parasitol. 81, 714-722 (1995).
- Colley, D. G., Wikel, S. K. Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules. Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).
- Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll. Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).
- Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules. Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).
- Lewis, F.
