Cercarial Transformation och In vitro Odling av Schistosoma mansoni Schistosomules

Summary

Vi beskriver ett

Abstract

Schistosome parasiter är de smittämnen bilharzia, en kroniskt funktionsnedsättande sjukdom som drabbar över 200 miljoner människor i världen och tvåa i malaria bland parasitsjukdomar i termer av hälsa och socio-ekonomiska effekter (1-4). Schistosome parasiter är trematode maskar med en komplex livscykel utbyta mellan ett parasitiskt liv i blötdjur och däggdjur värdar med mellanliggande frisimmande steg. Kortfattat, frisimmande cercariae infektera ett däggdjur värd genom att tränga in i huden med hjälp av utsöndras proteaser, under vilken tid cercariae förlorar sina svansar, förvandlas till schistosomules. Den schistosomules måste nu undvika värdens immunsystem, utveckla en intuitiv för rötning av röda blodkroppar, och migrera även om lungorna och portalen cirkulation på väg till slutdestinationen i levern portalen systemet och så småningom mesenteriala vener (för S. mansoni) där manliga och kvinnliga maskar par och parar sig, producera hundratals ägg per dag. Några av äggen utsöndras från kroppen i sötvatten, där äggen kläcks till frisimmande miracidia (5-10). Den miracidia infektera specifika snigelarter och förvandlas till mor och dotter sporocysts, vilket i sin tur producerar smittsam cercariae, slutföra livscykel. Tyvärr kan hela schistosome livscykeln inte odlas in vitro, men infektiösa cercariae kan förvandlas till schistosomules och schistosomules kan odlas i veckor för analys av schistosome utveckling in vitro eller microarray analys. I detta protokoll ger vi en visuell beskrivning av cercarial omvandling och in vitro-odling av schistosomules. Vi skjul smittsamma cercariae från snigel värd Biomphalaria glabrata och manuellt omvandla dem till schistosomules genom att lossa sin svans med en emulgerande dubbelkanyl. In vitro cercarial omvandling och schistosomules tekniker kultur beskrivs undvika användning av ett däggdjur värd, vilket underlättar visualisering av schistosomes och underlättar insamling av parasiten för experimentell analys. In vitro transformation och tekniker odling av schistosomes har gjorts i flera år (11, 12), men inga visuella protokoll har utvecklats som är tillgängliga för hela samhället.

Protocol

Säkerhetsåtgärder:

Schistosome cercariae direkt kan penetrera huden utan behov av en klippa eller porer, och orsaka den kroniska sjukdomen bilharzia. S. mansoni är en biosäkerhetsnivå 2 organismen, därför lämplig personlig skyddsutrustning och lämpliga säkerhetsåtgärder måste följas när man arbetar med infektiösa cercaria. Det mesta av den utrustning som krävs för att växa och omvandla schistosomes är standard, med några viktiga undantag som anges i tabellen i slutet av protokollet. Alla cercarial arbete bör ske på ett isolerat rum. Schistosomules bör odlas i ett sterilt, godkänd biosäkerhet huva. Två lager av nitril eller latex handskar bör användas, liksom en labbrock, en vattentät par skor, byxor med inga hål eller revor, och vattentät skydd hylsa för dina handleder och armar. I händelse av ett oavsiktligt utsläpp, omedelbart spraya kontaminerat område med 70% etanol eller 10% blekmedel, gnugga energiskt om på din person. Detta kommer att vara tillräckligt för att inaktivera parasiten, men alla möjliga infektioner bör rapporteras och tas på allvar. Även schistosomules är inte medfött smittsamma, institutionella riktlinjer varierar, och bör konsulteras för att avgöra om BSL2 försiktighetsåtgärder krävs vid icke smittsamma levnadsstadier. Desinficera alla ytor som kommer i kontakt med potentiellt smittsamma ämnen efter experimentet utförs och kasta avfall i en godkänd behållare för biologiskt behållare.

OBS: Täck snigel värd fack 1 till 2 dagar före utsöndring och skydda mot ljus

1. Skörd cercariae från snigel värd

1. Fyll en ren, 500ml bägare fria från tvättmedel till hälften full med destillerat vatten återfå rumstemperatur. Om att arbeta med värden sniglar infekterade med miracidia på olika datum, använd en separat bägare för varje infektion datum (Detta är särskilt viktigt om sniglarna kommer att återanvändas för framtida experiment). Storleken på bägaren kan också vara mindre beroende på erfarenheterna av användaren.
2. Samla infekterad snigel värdar du vill kasta och försiktigt placera dem i bägaren med en vanlig akvariefisk netto och allmän pincett syfte som behövs.
3. Placera bägaren på en akut spill bricka cirka 8 till 12 inches under ljuskällan är en glödlampa. Låt stå i 1-2 timmar i ljuset. Cercariae avsluta snigeln värd när den utsätts för starkt ljus.
4. Försiktigt filtrera bort sniglar från cercariae blandningen. Vidta extra säkerhetsåtgärder, som blandningen är mycket smittsamt. Kom ihåg att cercariae direkt tränga igenom mänsklig hud!
5. Byt blandning som ljuskälla i ca 15 minuter, så att alla partiklar avfall ärendet att lösa.
6. Överför cercariae i en ren Erlenmeyerkolv med hjälp av en pipett undvika skräp på botten av bägaren. Placera kolven vid ca 45 ° vinkel på is i mörker i 45 - 60 minuter, vilket gör att cercariae att bosätta sig i ett hörn.
7. Använd en 50 ml pipett för att ta bort 75 till 90% av supernatanten och placera det i bägaren innehållande 10% blekmedel eller 70% etanol och var noga med att inte låta vattendroppar som innehåller cercariae droppa från pipett.
8. Snurra Erlenmeyerkolven innehåller cercariae försiktigt resuspendera cercariae i lösning. Använd en pipett för att suga till steril 50 ml koniska rör. Placera rören igen på isen i 20 minuter i mörker. Cercariae kommer att avgöra mot botten av röret i mörker.

2. Manuell förändring av cercariae till schistosomules

Innan du börjar: Gör RPMI 1640 komplett (RPMI, 5% fetalt bovinserum, 1X Penna / STREP) och värm till 37 ° C. (Det är viktigt att fostrets bovint serum som används har inaktiverats genom inkubering ett 56 ° C under 1 timme som schistosomes kan vara känsliga för att komplettera).

1. I en biohazard huva, avlägsna supernatanten ner till 5 till 10 ml av lösningen i varje 50 ml konisk med en pipett eller vakuum-enhet.
2. Fäst en 22 gauge tvåsocklad, Luer Lok emulgering nålen till en lämplig storlek spruta.
3. Långsamt drar blandningen i sprutan. Samla cercariae från alla 50 ml rör i en spruta. Var uppmärksam på dropp.
4. Vänd försiktigt spruta över så att lös nål slut är uppe. Bifoga en annan sprutan till den här sidan av emulgerande nålen.
5. Passera blandningen genom nålen totalt 40 gånger (20 gånger fram och tillbaka) för att omvandla cercariae.
6. Placera sprutor vertikalt så att blandningen är i botten sprutan och toppen sprutan är tom. Ta upp sprutan och desinfektion i 70% etanol.
7. Deposition blandningen droppvis i en ren höga väggar 100mm x 50mm Pyrex maträtt eller kristalliserande maträtt. Desinficera nål och spruta i 70% etanol.
8. Lägg till 37 ° C RPMI 1640 komplett material så attbotten av petriskålen är helt täckt, som om att hälla en Luria buljong tallrik.
9. Rotera flaskan försiktigt för att samla schistosomules i mitten av petriskål. Undvik stänk.
   Obs: Det kan vara lämpligt att stänga huven ljus för detta steg för att mer adekvat visualisera schistosomules i centrum.
10. Omedelbart insättning koncentrerad schistosomules i en ny 12-och cellodling plattan väl med en steril pipett.
11. Upprepa 2,9 och 2,10 tills schistosomules inte längre befinner sig i mitten av skålen (cirka 10 gånger). Insättning varje efterföljande samling i en färsk väl.
12. Fyll varje brunn upp halvvägs (~ 1,5 ml) med uppvärmd RPMI komplett media.
13. Visualisera på ett inverterat mikroskop för att kontrollera förekomsten av schistosomules och frånvaro av cercariae.
14. Växa schistosomules i en CO _2-inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO _2.

3. Representativa resultat:

I väntan på överföring av omvandlas schistosomules till kulturmedia visualisering i en inverterad ljus-fält mikroskop (se utrustning tabell för ett exempel) ska ge en bild som liknar figur 1, där endast omvandlas schistosomules finns i brunnen. Potentiella föroreningar kan omfatta intakt cercariae, avhuggna cercarial svansar, eller annat skräp. Om ingen inverterat mikroskop finns tillgänglig kommer en standard mikroskop eller ens en dissektion utrymme vara tillräckligt för att visualisera schistosomules. Observera att detta förfarande inte alltid omvandla 100% av cercariae.

Figur 1: Transformed Schistosomulum

Figur 2: Cercariae och Severed Tails

Discussion

Flera potentiella problem kan uppstå under omvandlingen förfarande, dock är detta protokoll syftar till att undvika de flesta av dessa problem. En potentiell fara är igensättning av emulgering nål, som oftast uppstår på grund av skräp kvar från skörden i steg 1,3. Var noga med att alla partiklar att bosätta sig i steg 1,5 och överföra cercariae försiktigt i steg 1,6 för att undvika detta problem. Även, som beskrivits tidigare, arbeta inuti en biologisk säkerhetsbänk, användning av personlig skyddsutrustning (även ansiktsskydd) och undvikande av alltför stora tryck på sprutor rekommenderas.

Fristående cercarial svansar kan visualiseras i media, vilket tyder på dålig separation under steg 2,9. Den svansar uppvisar en spasm-liknande rörelse och har en tydlig form (se figur 2), och thusly är lätt att skilja från schistosomules. Den svansar kan tas bort genom att tvätta schistosomules över RPMI kompletta låta schistosomules att lösa. Den svansar förblir flytande och kan dammsugas upp.

Om intakt cercariae finns i media, var förvandlingen i steg 2,5 inte utförs på rätt sätt. En bild av en intakt cercaria visas i Figur 3b som referens. Om detta problem uppstår, försäkra att de emulgerande nålen som används är av rätt storlek. Dessutom kan många gånger cercarial blandningen leds genom nålen ökas, men 40 gånger är vanligtvis mycket mer än tillräckligt för att närma sig 100% klippning av cercarial svansar.

Omvandling av cercaria i schistosomules beskrevs första gången 1974 av Colley och Wikel (13). Sedan dess har förberedelserna schistosomules skett antingen med klippning strategi med en nål och spruta som beskrivs i detta protokoll, eller använda en vortexa strategi och separeras med gradienter av Percoll (14, 15) eller virvlande vilket framgår i detta dokument. Dessa två tekniker för att förbereda schistosomules är vackert beskrivs av Fred Lewis (16) och mer information för vidare odling av schistosomules för långsiktig tillväxt kan hittas på NIAID Schistosome Resource Center ( www.schisto-resource.org ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22g x 2-7/8" Emulsifying needle	Fisher Scientific	14-825-17G
RPMI 1640 Medium 1X (500ml)	Invitrogen	11835030
Fetal Bovine Serum (FBS) heat inactivated	Invitrogen	10082139
Penicillin/Streptomycin (100X)	Invitrogen	15070063
Crystallizing Dish (100mm)	Fisher Scientific	08-741D
General Purpose Tweezers	Fisher Scientific	10-316C
Petco Aquarium net for brine shrimp	Petco	SKU:1190954