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Medicine

파킨슨병의 일방적-6-OHDA lesioned 마우스 모델의 개발

doi: 10.3791/3234 Published: February 14, 2012

Summary

생쥐의 중간 forebrain 번들의 일방적 6-OHDA의 병변을 수행하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 striatal 도파민과 90.63의> 95 %의 손실을 보여주는 살아남은 동물의 89 %를 낮은 사망률 (13.3 %) ± -4.02 % 병변의 측면을 향해 ipsiversive 회전 편견을 가지고 있습니다.

Abstract

그것이 recapitulates 기저 신경 회로의 변화와 약리학가 관찰한 이후 일방적으로 lesioned 6 hyroxydopamine (6-OHDA) lesioned 파킨슨병의 쥐 모델 (PD)는 parkinsonian 증상의 기초 메커니즘에 대한 우리의 이해를 발전에 귀중한 것으로 판명되었습니다 parkinsonian 환자 1-4. 다만, 기저 신경의 주요 입력 영역입니다 striatum, 내의 출력 경로의 cortico-striatal 시냅스에서 발생하는 정확한 세포와 분자 변화는 애매 남아 있으며 이것은 parkinsonian 증상을 밑에있는 병적인 이상이 3 발생할 사이트로 여겨지고 5.

경찰서에서 nigro-striatal 경로의 기저 신경 회로를 다음과 변성 변화의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 크게 촉진에 의한 지나친 표현 녹색 형광 단백질은 세균 인공 염색체의 개발 (BAC) 생쥐하여 고급되었습니다그들은 고립에서 공부 수 있도록 8, :; : 두 striatal 출력 경로 (eGFP-D2와 eGFP-A2a 간접 경로 eGFP-D1 직접 경로)에 대한 구체적인 RS. 예를 들어, 최근의 연구 parkinsonian 마우스 9,10의 시냅스 소성의 병리 학적 변화가있다는 것을 제안했습니다. 그러나 이러한 연구는 청소년 생쥐와 parkinsonism의 급성 모델을 활용. 그것은 안정적인 6-OHDA의 병변과 성인 쥐에 설명된 변경 사항은 또한 이러한 모델에서 발생하는지 불분명하다. 다른 그룹은 중간 forebrain 번들 (MFB)을 lesioning하여 경찰의 안정 일방적-lesioned 6-OHDA 성인 마우스 모델을 생성하기 위해 시도했습니다 .. 안타깝게도,이 연구에서 사망률이 겨우 14 %가 21 수술을 이겨낸과 함께 매우 높은였다 일 이상 11. 더 많은 최근 연구에서 낮은 사망률 모두 함께 내부 nigral 병변을 올렸습니다 dopaminergic 뉴런의> 80 % 감소, L-DOPA 유도 운동 이상증 11,12,13,14 중 단 표현이 변수였다이러한 연구 인치 경찰의 또 다른 잘 확립 마우스 모델은 MPTP-lesioned 마우스 15입니다. 이 모델은 잠재 neuroprotective 요원 16 평가에서 유용하게 입증되었습니다하는 동안, 그것은이 모델은 종종 모터 적자를 유도하는 데 실패로 경찰의 메카니즘 밑에 증상을 이해하는 데 덜 적합하고, 병변 17 정도, 18의 넓은 다양성을 보여줍니다 .

여기에서 우리는 지속> 95 % striatal 도파민의 손실 (등 HPLC로 측정)뿐만 아니라 행동을 생산의 원인이 MFB,에 6-OHDA를 직접 관리하여 경찰의 안정 일방적 6-OHDA-lesioned 마우스 모델을 개발 불균형은 경찰의 잘 특성화 일방적 6-OHDA-lesioned 쥐 모델에서 관찰했다. 경찰이 새롭게 개발한 마우스 모델 parkinsonian 증상 세대의 기본 메커니즘을 이해하는 데 유용한 도구를 새삼 느끼게 될 것이다.

Protocol

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1. 주택과 생쥐의 준비

  1. 형질 전환 생쥐에게 8 (음식과 물을 무료로 이용할 수있는 12시 12분 H 빛을 어두운주기에 돌연변이 마우스 지역 리소스 센터 (MMRRC) FVB를 구동 세균 인공 염색체 (BAC)의 식민지를 유지합니다.이 쥐가 순수 FVB 마우스 있으며, 그것은 목적 번식하거나, 다른 변형들과 이들 생쥐를 건너 필요가 없습니다, 또는 6-OHDA 병변 절차의 성공을 보장하기 위해.
  2. parkinsonian 모델을 생성하기 위해서는 출생 후의 일 31-42 세 성인 쥐 (P31-42)은 6-OHDA-병변과 가짜 수술이 필요합니다.
  3. 감염의 위험을 줄이려면 수술 이전 24 시간 동안 마시는 물에 Baytril을 (항생제) 관리할 수 있습니다.

2. 수술에 대한 약물의 준비

desipramine과 pargyline의 premedication은 보통 선택성 및 EFF을 높이기 위해 6-hydroxydopamine을 주입 (6-OHDA)에 앞서 설치류로 관리합니다6-OHDA-유도 병변의 icacy. 5HT / noradrenaline 이해 억제제는 desipramine은 6-OHDA 유발 noradrenaline과 5HT 고갈 22 감소 모노 아민 산화 효소 억제제, 반면 pargyline 6-hydroxydopamine 31 extrasynaptic 분해를 줄여, 6-OHDA에 dopaminergic 단말기의 감도를 향상시킵니다.

  1. premedication (desipramine 염산염 (HCL)과 pargyline HCL)을 대량으로 만들어 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. 그날 수술을 받게됩니다 동물의 수가 25 밀리그램 / kg으로 각각 마우스를 공급 desipramine HCL의 적절한 금액을 달다. 마우스의 낮은 무게는 정확하게 작은 볼륨을 전달하기 어렵습니다 않으므로 2.5 밀리그램 / ML의 농도에 desipramine 염산염을 준비하고 10 ML / kg에서 동물에 투여. 화합물의 소금 구성 요소의 무게는 올바른 농도가 달성되는 그러한를 설명할 수 있어야합니다. 의 무게에 대한 보정염산염 desipramine의 HCL 소금 : desipramine HCL의 분자량 (MW) : 302.84 MW HCL : 무료 기지 36.46 MW : 266.38 보정 요소 : 302.84 / 266.38 = 1.137 솔루션의 10 ML 들면 다음과 같습니다 = 2.5mg/ml desipramine X 10.0ml X 보정 계수 = 2.5mg/ml X 10.0ml X 1.137 desipramine 염산염의 = 28.43mg
  2. 그날 수술을받는 동물들의 수를 5mg/kg 각 마우스를 공급 pargyline HCL의 적절한 금액을 달다. 위에서 설명한대로 화합물의 소금 구성 요소에 대한 정답이다. 마우스의 낮은 무게는 정확하게 작은 볼륨을 전달하기 어렵습니다 않으므로 0.5 밀리그램 / ML의 농도에 pargyline 하이드로 클로라이드를 준비하고 10 ML / kg에있는 동물들을 관리할 수 있습니다.
    pargyline 염산염의 HCL 소금의 무게에 대한 정확한 :
    pargyline HCL의 MW : 195.69 MW HCL : 36.46
    무료 기지 MW : 159.23 보정 요소 : 195.69 / 159.23 = 1.229
    솔루션의 10 ML 밖으로 무게 내용 : <BR /> = 0.5 밀리그램 / ML pargyline X 10.0 ML X 보정​​ 계수
    = 0.5 MG / ML X 10.0 ML X 1.229
    pargyline 염산염의 = 6.15mg
  3. 10 ML 유리로 28.43mg desipramine HCL 및 6.15mg pargyline HCL을 결합하는 것은 실린더 졸업 및 8 ML 멸균 식염수 (0.9 %)를 추가합니다. 혼합물이 녹아있다 ° C까지 45 ~ 소용돌이와 열. 솔루션의 산도는 이제 생쥐에 투여하는 경우 것이 비뇨기와 위장관 기능과 관련된 불편 및 수술 합병증의 원인이됩니다, 3 주위에있을 것입니다. 산도가 7.4까지 NaOH (1M)의 방울을 추가합니다. 멸균 식염수 (0.9 %), 그리고 소용돌이와 10ml로 볼륨을 이동. ~ 80 ° C.에 레이블, 날짜 및 동결 pargyline HCL은 실내 온도에서 염분 용해 없다는 것을 감안할 때, 수술 기간 내내, ° C 수술실에서 37으로 가열 물을 욕조에 premedication 혼합물을 저장합니다.
  4. 6-OHDA의 솔루션은 즉시 수술에 대한 사전 준비를해야합니다. 차량은 6-OHDA 브롬화 수 소산​​ (6 분해하는 데 사용- OHDA.Br) 솔루션은 멸균 식염수 (0.9 %) 솔루션을 포함하는 아스코르비 산 (0.2 %)입니다. 그것이 비활성 형태로 6 - OHDA.Br의 산화를 방지로 아스코르비 산은 6 OHDA.Br을 안정화하는 데 필요합니다. 빈 1 패 추가 후, 아스코르비 산의 0.2 g을 무게 눈금 실린더, 멸균 식염수 1 개 L (0.9 %)까지 상단과 저어. 필수 ° C까지 ~ 80시 레이블, 날짜 및 상점.
  5. 3.0 μg 각 마우스를 공급할 15.0 밀리그램 / ML 솔루션을 만들기 위해 6 OHDA.HBr의 적절한 금액을 달다. 6 OHDA.Br은 빛과 열을이기 때문에 민감한 무게하기 전에 얼음 빛, 그리고 장소에 대한 노출을 피하십시오.
    6 OHDA.HBr에 HBR 소금의 무게에 대한 정확한 :
    6 OHDA.HBr의 MW : 250.09 MW HBR : 무료 기지의 79.9 MW : 170.19
    보정 요소 : 250.09 / 170.19 = 1.47
    솔루션의 0.5 ML 밖으로 무게 들면 :
    = 15.0 MG / ML 6-OHDA X 0.5 ML X 보정​​ 계수
    = 15.0 MG / ML 6-OHDA X 0.5 ML X 1.47
    6 OHDA.HBr의 = 11.03 밀리그램
  6. 가짜로 작동하는 동물의 경우 차량의 상당 부피 (멸균 식염수 (0.9 %), 아스코르비 산 0.02 %의 산도 7.4) 6-OHDA-lesioned 동물들이 받게되는 것이로 메이크업, 그리고 싼 1.0 ML 멸균 튜브에 장소 즉시 사용할 때까지 얼음 주석 호일, 라벨 및 곳이죠.

3. 외과 장치 설정하기

외과 도구 압력솥 사전 t를 사용하여 소독을해야합니다O 수술. 각 작업 사이에 수술 도구는 250 가열 다음에 95 % 에탄올로 소독을해야합니다 2 분을 ° C에서. 모든 실험은 부속 기관 및 국가의 해당 동물 관리위원회의 지침에 따라서 수행되어야합니다.

  1. 이전 장비를 설정하고 이소 프로필 알코올로 모든 표면과 장비를 청소합니다. 깨끗한 수술 장비를 다룰 때 멸균 장갑을 착용한다.
  2. 설정 기준에 종이 타올과 마우스 복구 케이지. 가열 램프 미만 또는 온수 패드 위에 장소.
  3. 산소 유입이 연결된 개방적이고, isoflurane 저수지가 완전히 가득 차있다는 보장, 마취의 트롤리를 설정합니다. 1 L / 분, 그리고 2-4%로 isoflurane에 산소 흐름을 설정합니다. 이상 적으로는 동물 stereotaxic 프레임에있는 동안 유도 실로 산소 isoflurane 혼합물을 제공할뿐만 아니라, 유지 보수하기 위해 마취 기계에서 두 유출 포트가있을 것입니다.
  4. 공동주입 장치의 조립은 성공적인 병변을 확보에 중요 갇힌 공기 또는 차단 바늘로 병변 사이트에서 생긴 6-OHDA의 볼륨을 감소 rrect. 그림 1에서 보여주는대로 주입 장치를 조립. 픽 튜빙 한쪽 고정 나사 하나 RN 금속 너트가 (RN 압축 키트 (피팅 16분의 1 인치)) 후, 픽 컵 물미, 정식 PFA 물미으로 따라갔다. 동양 ferrules 이렇게 정식 PFA 물미에 원추가 픽 컵 물미의 짝짓기 부분에 살짝 것입니다. 연결을 보장하는 듀얼 작은 허브 RN 커플러 (# 1)로 장소가 꽉이다. 이중 소형 허브 RN 커플러의 다른 쪽 끝을에서 33 게이지 주사 바늘을 삽입합니다. RN 금속 너트와 조여 중 하나를 통해 바늘에 실을 꿰다. 33 게이지 바늘은 듀얼 작은 허브 RN 커플러 (# 1)에 180 ° 각도로한지 확인하십시오. 픽 튜빙, 스레드에서는 Peek 물미 다음 RN 금속 너트 중 하나의 다른 쪽 끝을에서 다음, PFA는 물미. 금속 너트를 삽입차 두 번째 듀얼 작은 허브 RN 커플러로 어셈블리를 물미하고 연결을 조입니다. 초 소형 듀얼 RN 허브 커플러 (# 2)의 다른 쪽 끝에있는 작은 허브 RN 어댑터 (luer 어댑터)에 luer를 삽입하고, 연결을 조입니다.
  5. 다음 주입 장치는 (그림 1 참조) 중이오해야합니다. 기포가없는 보장 멸균 물을 250 μl와 1.0 μl 해밀턴 주사기를 채우십시오. luer 어댑터에 250 μl 주사기를 첨부와 물이 튜브의 다른 쪽 끝을에 33 게이지 주사 바늘을 통해 출시되는 등 250 μl 주사기의 플런저를 우울하게. luer 어댑터의 끝에 작은 물이 구슬 떠나, luer 어댑터의 250 μl 주사기를 꺼내는 동안 시스템을 통해 물을 밀어 계속합니다. 작은 물이 구슬을 꺼낼 때까지 1.0 μl 주사기의 플런저를 낮춰. 조심스럽게 luer 어댑터로 1.0 μl 주사기를 삽입, 1.0 μl 주사기에 구슬 물이 물이 구슬 현재 O와 연결하는지N luer 어댑터, 그리고 완전히 luer 어댑터로 1.0 μl 주사기를 삽입합니다. 소형 듀얼 RN 허브 커플러에는 거품을 보장 없습니다.
  6. 이제 시스템이 준비가 끝났다 즉, 관류 장치는 stereotaxic 프레임 및 주입 펌프를 확보할 수 있습니다. stereotaxic 프레임의 조작하는 사람 암에 부착된 33 게이지 주사 바늘로 작은 듀얼 RN 허브 커플러를 고정 후, 관류 펌프로 관류 펌프가 시작되면 주사기가 클램프에 대해 누를 것이 그러한 1.0 μl 주사기 클램프 못해 로 이동합니다. 프로그램 주입 펌프를 0.1 μl / 분의 주입 속도를 허용합니다.

4. 일방적인 6-OHDA 병변 수술

  1. 이전 작업에 30 분, 각 동물 무게와 무게를 기록합니다. Systemically 쥐 한마리에 10 내부 복막 주사 (IP)에 의해 ML / kg에서 desipramine 하이드로 클로라이드 (2.5 밀리그램 / ML, 시그마 알드리치)와 pargyline 하이드로 클로라이드 (0.5 밀리그램 / ML, 시그마 알드리치) (0.9 % 멸균 식염수, 산도 7.4)을 관리1ml 주사기에 부착된 27g 바늘을 사용합니다. 예를 들어, 30.0 g의 마우스 premedication 300 μl를받을 것이다. 가열 디스크를 워밍업 귀에와 앞니 표시줄 아래에 넣으십시오. 가열 디스크는 수술하는 동안 동물의 온도를 유지하고 stereotaxic 프레임의 귀와 앞니 바에 맞게 이상적인 높이로 동물을 유지하는 데 도움이 될 것입니다.
  2. desipramine HCL 및 pargyline HCL 솔루션의 관리에 따라 15 분, 닫힌 마취 챔버에 마우스를 배치하고, isoflurane 흡입 (O 2의 2-3%)를 사용하여 동물을 마취시키다. 그것이 뒷다리 다리 핀치없이 눈 깜짝할 반사에 대한 응답을 보여줍 없을 때 동물은 충분히 anesthetised입니다.
  3. 마우스의 머리의 정상을 면도하고, 탈지면을 사용하여 피부에 직접 lidocaine 국소 진통제를 적용합니다. lidocaine 응용 프로그램에 다음과 같은 다섯 분, betadine 솔루션 동물의 머리를 소독.
  4. 생쥐에 대한 적응 stereotaxic 프레임에 동물을 놓으십시오. 동물의 얼굴 위에 놓여 마취 마스크 : 첫째 앞니 바 (-3.0로 2.0 mm 앞니 표시줄 설정)에 동물을 배치하십시오. 1 L / 분, 그리고 1.5-2 %로 isoflurane에 산소 흐름을 조정합니다. 앞니 표시줄 두개골의 맨은 수준임을 등 귀 컵에 상대적인 수준에 있어야합니다. 귀 컵 (직경 5.0 mm)를 삽입합니다. 이어 컵은 머리가 완전히 평평 때 제대로 삽입되고 있고, 어느 방향으로 이동할 수 없습니다.
  5. 메스 블레이드를 사용하여 마우스의 머리 위에 피부의 중간선을 따라 절단하고 피부를 접​​어야합니다. 거즈를 사용하여 두개골의 표면을 건조합니다.
  6. 1.0 μl 주사기의 플런저를 밀어 및 6-OHDA 솔루션 (15 밀리그램 / ML)이 포함된 주석 포일로 덮여 하나 ML 튜브에 33 게이지 주사 바늘을 넣습니다. 6-OHDA 용액 (15 밀리그램 / ML)에 포장되어 33 게이지 주사 바늘을 유지하면서 1.0 μl 주사기의 플런저를 천천히 다시 그립니다.
  7. 중반 따라 1cm의 절개를 만듭니다두개골의 라인. Bregma쪽으로 주입 바늘 끝을 향상 작은 비드를 형성하기 위해 33 게이지 주사 바늘의 6-OHDA 솔루션의 작은 금액을 분배. 천천히 Bregma, 비드 처리 Bregma는 바늘의 팁을 발전 중단하고이 좌표를 기록할 때.에 주사 바늘 팁을 낮추 주사 바늘이 지느러미 방향으로 음, 그리고 람다 향한 주동이의 꼬리 방향으로 화살 봉합을 따라 이동을 접어야합니다. 작은 비드를 형성하기 위해 33 게이지 주사 바늘의 6-OHDA 솔루션의 소량을 부활시켰습니다. 천천히 비드 연락처 람다는 바늘의 팁을 발전 중단하고이 좌표를 기록 람다에 주사 바늘 끝부분을 낮춥니다. 그렇지 않은 경우 중간 (ML) 측면, 그리고 지느러미 복부 (DV) 좌표가 Bregma 및 람다이 동일해야 AP 좌표와 ML 좌표에 대한 귀 바에 대해 적절하게 앞니 막대를 조정합니다. -1.2 mm, ML : Breg에 상대적으로 -1.1 mm로 바늘을 이동 AP는 좌표25 좌표 Stereotaxic에서 마우스 뇌 아틀라스에 따라 mA. 바늘을 접어야하고 버는 25 게이지 바늘을 사용하여 두개골에 구멍.
  8. 좌표 위에 주사 바늘을 반환하고, DV로 바늘을 삽입 :-5mm. 0.1 μl / 분 (3 μg 합계)의 비율로 일방적으로 중간 forebrain 번들로 6-OHDA 또는 차량의 0.2 μl을 불어 넣다. 6-OHDA 또는 차량의 관리가 완료되면 주사 사이트에서 확산 버릴 수 있도록 추가로 5 분 위치에 바늘을 두십시오.
  9. 천천히 바늘을 접어야합니다.
  10. 세 봉합을 사용하여 두피에 절개를 닫고 (SC) subcutaneously Lactated 울리는의 솔루션 1ml를 제공합니다.
  11. 의식이 회복되기 전까지 복구 안의 stereotaxic 프레임, 장소에서 동물을 제거합니다.

5. 6-OHDA-lesioned 동물의 수술 치료

  1. 장소 케이지의 동물 (3 생쥐 / 케이지)와 식품 및 sugare 무료로 액세스를 허용d 개 물 (10 ㎜). 식욕과 위장의 운동성을 자극하는 새장 바닥에 식품 용기에 Nutra-겔과 KMR (새끼 고양이 우유 교체)를 제공합니다.
  2. 이주 24 수술 후 일상 생쥐를 검사합니다. 각 검사에서 특별한주의가 새장 주위를 이동하려면 동물의 능력을 평가하여 동물의 경계에 납부하여야한다. 음식과 물의 섭취 마지막 전망대 시대뿐만 아니라 대변의 존재 및 일관성도 관찰해야합니다. 일반적인 수술 합병증이 피부 아래의 피부 핀치의 느린 철회에 의해 분명하다 탈수있다. 이것이 관찰되는 경우 1 주일 Lactated 울리는의 솔루션 SC의 1ml을 전달하거나 증상 개선까지. 수컷 동물의 경우 성기가 조심스럽게 음경의 빨갛게 식별 음경 탈출증에 대한 관찰해야합니다. 이것이 영향을받는 동물의 성기에 mucol 젤을 적용, 1 주일 동안 Lactated 울리는의 솔루션 SC 1 ML을 제공 발생하는 경우또는 증상까지 향상시킵니다.
  3. 체중의 변화를 모니터링 매일 동물을 달다.
  4. IP 주사는 위장 시스템에 작은 균열을 일으키고 경우에, 복부 감염이 발생할 수 있습니다. 따라서 부풀어 불어 복부에 의해 분명 복부의 감염 prsence를위한 평가. 3-4일 대한 drining 물에 Baytril를 투여하여 치료 또는 증상 개선까지.

6. Parkinsonian 평가

병변의 범위를 추정하기 위해 행동 평가는 도파민 고갈의 양을 26 최대한의 안정되면, 6-OHDA-병변 수술 다음 14-21일 수행되었다.

  1. 0.01 ML / G 0.9 % 멸균 식염수의 IP 주입 따라, 장소 유리 실린더의 생쥐 (11cm X 9.5 ㎝)하고 videocamera (CG9, 산요)를 사용하여 자신의 활동을 기록합니다.
  2. 동영상 감상, ipsiversive 및 contrav 모두에서 만들어진 완전한 360 ° 회전 수를 세어병변에 대한 상대 ersive 방향.
  3. ipsiversive 회전 향한 큰 편견, 더 parkinsonian 동물, 따라서 네트의 비율 (contraversive 및 ipsiversive) 회전 동작 등 ipsiversive 회전의 비율을 계산.

7. HPLC에 의한 striatal 도파민 함량의 결정

  1. 6-OHDA 병변 수술에 따라 최소 21 일 및 행동 연구 완료되면 마취의 과다 복용에 의해 생쥐를 희생하고, 신중하게 두뇌를 제거합니다. 각 마우스의 각 반구에서 striatum 한 조각 (230 μm의)을 유지하고, -80에서 sectioning 및 매장 ° C를 striatal 시료의 준비까지 직후 동결을 투둑거리구요.
  2. HPLC 샘플 버퍼 (2 MM 글루타티온와 0.1 M PCA)을 무너 뜨에서 striatal 샘플에서 추출한 도파민을 방지한다.
    샘플 버퍼의 100 ML의 경우 :
    = 100 ML HPLC 급 H 2 O
    = 0.862 ML PCA (70 %) (Sigm)
    = 61.5 MG 글루타티온 (감소)
    HPLC 등급 H 2 O를 측정, PCA를 추가, 솔루션 글루타티온를 해산, 글쎄 및 필터 섞는다. 샘플 버퍼는 최대 1 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 얼음 striatal 조각 해동 후 초음파 세포 장애 (피셔 소닉, 미국)을 사용하여 200 μl 샘플 버퍼에 homogenise. 항상 얼음에 샘플을 유지하고 각 샘플 10 달러 초 샘플을 균질화 기간 사이에 아래로 냉각하는 허용하는 것을 보장 각각 세 번 homogenise.
  4. 단백질 분석을 위해 각 균질 시료 20 μl를 (-80시 매장 ° C)에 별도로 설정합니다.
  5. 샘플 (20,800 XG, 20 분 (4 ° C, Eppendorf 58 - 04R, 미국)) 원심 후 제거 0.2 μm의 PVDF 멤브레인 (막, 고양이 # : 1935-28143-310)를 통해 뜨는 및 필터 및 동결시 HPLC 분석 시까지 -80 ° C에서. 백업 단백질 분석을위한 단백질로 펠렛을 유지합니다.
  6. thr를 실행할 수있는 HPLC 용 모바일 단계의 준비HPLC 칼럼 ough.
    모바일 단계 1 패 들면 :
    60 MM 아뇨 2 PO 4. H 2 O (일염기의) = 8.27 g
    30 MM 시트르산 = 5.7 g
    0.13 MM Ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 나트륨 소금 = 48 밀리그램을 탈수
    0.16 밀리미터 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) = 45 밀리그램
    850 ML HPLC 급 물 (Caledon, 고양이 # : 8801-7)
    15% V / V Acetonitrile-190 (산도 3.35) = 150 ML HPLC 등급 (Caledon, 고양이 # : 1401-7)
    10 M NaOH 중 ~ 2 μl (HPLC 등급 H2O에서)
    모든 시약은 가능한 한 ≥ 99.0 % 순수하고 HPLC 등급이어야합니다. 물과 acetonitrile는 HPLC 등급이어야합니다. 모바일 단계는 준비 후 일주일 이내에 사용해야합니다. 헌신적인 깨끗한 유리 제품을 가지고 전적으로 모바일 위상 (1 패 유리 측정 실린더와 최소한 2 1 패 유리 flasks)의 준비를 위해 막대를 저어. 모바일 단계를 준비​​ 전까지 두 깨끗한 한 패의 flasks 준비했습니다에 솔루션을 만들기 위해 하나 하나는 여과 및 degassi 동안에 그 파일을 전송하는 방법NG. 모바일 단계는 하룻밤 HPLC를 통해 순환과 기준선 사용하기 전에 평평한지 확인하도록 허용합니다.
  7. 유리 측정 실린더로 HPLC 급 물 700 ML을 측정하고 해산 2 PO 4. H 2 O, 구연산 산성, 그 안에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 SDS 아냐.에게 850 ML에 물을 이동.
  8. 10 M NaOH를 사용하여 3.35로 산도를 조정 후 acetonitrile을 추가하고 테플론 코팅 볶음 막대를 사용하여 솔루션을 섞는다.
  9. 두 번째 깨끗하고 빈 1 L 플라스크, 진공 0.22 μm의 HVLP Millipore 필터를 통해로 모바일 단계 필터에 저어 막대를 넣고 : (CAT # : SLGP033RS). 여과 전 85:15 H 2 O / ACN에서 필터를 젖었어. 일단 휴대가 완전히 가스를 제거하다는 적어도 10 분 동안 진공하에 그것을 교반하여 모바일 단계 필터링합니다.
  10. striatal 샘플의 도파민 농도가 측정되는 대한 표준을 준비합니다. 기준은 striatal 샘플의 각 일괄 처리의 시작과 끝에 HPLC를 통해 실행됩니다. 일MG / ML 도파민의 주식 솔루션은 사전에 만들어 -80 20 μl aliquots에 저장할 수 있습니다 ° C. 주식 솔루션 5 ML 샘플 버퍼에 5 MG의 도파민을 분해 (위 참조)와 철저하게 그것을 섞어 준비합니다. 1 MG / ML 주식 용액 5 μl를 복용 2.5 ML 샘플 버퍼에 추가하고 2 μg / ML 도파민 솔루션을 얻기 위해 철저하게 그것을 혼합하여 표준을 준비하기 시작합니다.
  11. 네 개의 표준 농도 곡선을 생산하기 위해 HPLC를 통해 실행됩니다. 도파민의 경우 농도입니다 : 100 NG / ML, 50 NG / ML, 25 NG / ML 및 12.5 NG / ML. 생성하기 위해서는 도파민의이 네 농도가 7.10에서 준비 2 μg / ML 도파민 솔루션) 10 μl 가져가라. 그리고 당신에게 100 NG / ML 도파민 솔루션을 제공하는 샘플 버퍼의 190 μl에 추가합니다. 이것은 100 NG / 샘플 버퍼와 ML 도파민 솔루션의 1:1 직렬 희석을 수행하는 다음. 간단히 100 NG / ML 도파민의 100 μl를 타고 샘플 버퍼와 50 ML / NG 도파민을 생산하는 혼합 100 μl를 추가한 후 100을 받아50 ML / NG 도파민의 μl 및 샘플 버퍼와 혼합하므로 25 NG / ML 도파민과를 생산하기 위해 100 μl를 추가합니다.
  12. HPLC 시스템 (워터스 1525μ 이진 펌프, 717plus autosampler, 대칭 C-18 리버스 상 열 (15cm X 4.6 밀리미터 ID, 5 μm의 입자 크기) (30 ° C) 완비 전기 화학 검출기 (ESA Coulochem III) 준비하기 이중 전극 분석 셀 (ESA 5011A)와 및 브리즈 소프트웨어 (워터스)) 1 정화의 컴퓨터 소프트웨어의 정화 프로토콜을 선택하거나 제조 업체의 지침에 따라 모바일 위상과 시스템에 의해 제어. 신선한 모바일 위상과 HPLC 시스템에서 이러한 교류는 이전의 모든 솔루션입니다.
  13. 전기 400 MV에서 잠재력 각각 첫 번째와 두 번째 전극에 대해 -300 MV를 설정합니다. 그 후 최소한 2 시간 동안 그것을 실행하고 1 ML / 분의 유량에서 모바일 위상과 이상적으로 하룻밤에 의해 시스템을 평형. 평균 동안 세포가 켜져과 기준을 다시해야합니다판독 시스템이 사용할 준비가 안정되면 ading는 모니터. 평균의 첫 한 시간 동안 종료는 시스템이 당신 모바일 단계는 모바일 위상 플라스크에 아웃렛 호스를 넣어 HPLC 시스템을 통해 recirculate 수 있습니다 다음, 낭비자 컨테이너로 이동하는 모바일 기하자.
  14. 얼음 striatal 샘플을 해동 후 1 ML / 분의 모바일 상류 속도 equilibrated HPLC 시스템으로 각 샘플의 2 X 20 μl와 각 도파민 수준의 추가 20 μl 다음 각 도파민 표준의 20 μl를 주입.
  15. 표준과 샘플에 의해 생산되는 도파민 봉우리의 영역을 분석하는 HPLC 시스템 소프트웨어를 사용합니다. 표준 도파민 농도 곡선에 striatal 샘플에있는 도파민 봉우리의 면적을 비교하면 각 striatal 시료 20 μl에 도파민 선물의 양을 확인합니다. 전체 striatal 슬라이스의 전체 도파민 선물을 찾기 위해이 그림을 확장할.
  16. 피가) 7.4에서 별도로 설정하는 것이 striatal homogenate의 20 μl의 표준 단백질 분석을 erform. 이것은 MG / ML에 striatal 샘플의 단백질 존재의 양을 측정합니다. 이것에서 당신 반구 사이와 생쥐 사이의 도파민 농도를 비교할 수 있도록 NG / MG의 값으로 striatal 샘플에 도파민의 양을 계산합니다.

8. 대표 결과

식염수 (IP) 28의 행정에 따라 neurotoxin에 의한 세포 죽음의 금액 completion26에 도달한 6-OHDA-병변 수술 다음 열 다섯에 이십일일, 자발 360 측정 ° 회전은 6의 성공 여부를 파악하기 위해 사용될 수 있습니다 (그림 2)-OHDA-lesioned. 행동 평가의이 방법은 간단하고 빠른, 그리고 같은 암페타민 또는 apomorphine의 어려움 등 dopaminergic 대리인에 의한 잠재적인 마중물 효과를 방지합니다. 또한, 자발 순환 평가는 더 predi입니다<95 %의 도파민 고갈과 동물의 ctor는 forelimb의 발자국 배치 고사 27 비교했다. 각 동물의 자발 ipsiversive 회전의 비율로 striatal 샘플 (HPLC를 사용하여 행동 연구 완료되면 준비)에서 striatal 도파민 수준을 연관함으로써, 70 % 또는 6-OHDA 병변에 대한 자세한 ipsiversive 회전을 전시 동물들이 잃어버린 것으로 나타났습니다> 95% striatal 도파민 (그림 3) 27. 자발적인 회전을 (40.91 ± 8.01) (그림 2) 측정할 때 중간 forebrain 번들의 일부 6-OHDA 유발 병변 (59.44 ± 17.20) (그림 3)에 따라 전혀 회전 편견은 ipsiversive 대 contraversive의 양쪽 사이에 없었습니다. 따라서, 같은가 쥐의 MFB 6-OHDA 행정 따라 발견되었습니다, 그것이 dopaminergic nigro-striatal 뉴런의 깊은 손실 및 염분 관리를 일으킬 수 있습니다 (IP) 6-OH의 범위를 심사한위한 정확한 방법입니다이 동물의 검찰 병변.

그림 1

그림 1. 도식 다이어그램은 6-OHDA-병변 수술을위한 주사 바늘 장치의 조립을 설명합니다.

그림 2

그림 2. 가짜로 작동하는 6-OHDA lesioned 생쥐의 회전 동작에 대한 평가. 가짜로 작동하는 6-OHDA-lesioned 생쥐의 자발적인 회전. 데이터는 평균 백분율 ipsiversive 돌리기 ± 그물 contraversive 및 ipsiversive의 회전이 100 %입니다 SEM으로 표시됩니다. 오픈 바 : 가짜로 작동하는 동물, 그레이 바 :> 95 % 도파민의 손실과 6-OHDA-lesioned 동물, 블랙 바 : 부분적으로 lesioned되었다 6-OHDA-병변 수술을 받았습니다 동물. P *** 체하다로 작동하는 동물에 비해 <0.001. 편도 ANOVA는 던의 다중 비교 검사 (S 뒤에 햄 - 운​​영 : N = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%) : N = 23; 부분 6-OHDA-병변 : N = 3).

그림 3

그림 3. HPLC를 사용하여 가짜로 작동에서 striatal 도파민 수준과 6-OHDA lesioned 생쥐들의 평가. Striatal 도파민의 내용은 사기와 6-OHDA-lesioned 동물의 운항 및 unoperated 반구에서 산출된 것입니다. 데이터는 평균 ± 백분율 unoperated striatum에서 striatal 도파민 수준을 SEM으로 표시됩니다. 오픈 바 : 가짜로 작동하는 동물, 그레이 바 :> 95 % 도파민의 손실과 6-OHDA-lesioned 동물, 블랙 바 : 부분적으로 lesioned되었다 6-OHDA-병변 수술을 받았습니다 동물. *** P <0.001, ** P <0.01이 사기로 작동하는 동물에 비해. 편도 ANOVA는 던의 다중 비교 검사 다음 (가짜로 작동 : N = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%) : N = 23 부분 6 OHDA-병변 : N = 3).

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그림 4

그림 4. 사기로 작동하는 6-OHDA lesioned 생쥐의 SNc의 티로신 hydroxylase의 immunoreactivity의 평가. Thiele 외 설명에 따라 도파민 세포 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)의 분실, 사기 및 6-OHDA-lesioned 동물의 운항 및 unoperated 반구에있는 티로신 hydroxylase의 손실 (TH) 양성 immunohistochemisty의 마커로서 결정되었다. 키를 누릅니다. 데이터는 평균 ± 백분율 unoperated striatum에서 TH 양성 세포의 SEM으로 표시됩니다. 오픈 바 : 가짜로 작동하는 동물, 그레이 바 :> 95 % 도파민의 손실과 6-OHDA-lesioned 동물, 블랙 바 : 부분적으로 lesioned되었다 6-OHDA-병변 수술을 받았습니다 동물. *** P <0.001, ** P <0.01이 사기로 작동하는 동물에 비해. 편도 ANOVA는 던의 여러 안돼요 뒤에rison 검사 (가짜로 작동 : N = 17, 6-OHDA-lesioned (> 95%) : N = 23 부분 6 OHDA-병변 : N = 3).

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Discussion

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이 프로토콜은 높은 병변 성공률과 낮은 사망률로, 극단적으로 재현할 수있다 파킨슨병의 안정 일방적 6-OHDA-lesioned 마우스 모델의 생성을위한 방법을 설명합니다. 6-OHDA 병변 수술의 성공은 쉽게 lesioned striatum 27> 95 %의 도파민 고갈 지표> 70 % ipsiversive의 회전과 함께 자발적인 회전 동작의 측정에 의해 추정 할 수 있습니다. 그것이 striatal 도파민 레벨 28 직접 측정을 제공으로 striatal 도파민 수준의 부량은 substantia nigra 갈 거예요 compacta의 번호 TH-양성 세포의 quantificiation에 비해 striatal 도파민 고갈의 범위에 가장 정확한 측정이다. 이 프로토콜은 파킨슨병의 1,4의 잘 특성화 일방적 6-OHDA-lesioned 쥐 모델의 주입의 사이트 (MFB)과 병변의 개발 기간 (21 일) 재현 것을 감안할 때, 그것은 일을 추정하실 수 있습니다이 마우스 모델에서와 같은 쥐 모델, recapitulates는 약리학과 뇌 회로의 변화는 파킨슨 환자에서 관찰. 따라서이 방법은 형질 전환 생쥐에서 파킨슨병의 증상 모델을 생성하는 방법을 제공합니다. 형질 전환 생쥐 우리가이 두 기술을 결합, 세포 및 전체 조직 수준까지, 분자에서 생체내에 분자와 단백질의 역할을 이해할 수 있도록위한 매우 강력한 도구임을 감안할 때하면 더욱 분자 및 세포 메커니즘을 delineating에 매우 유용합니다 파킨슨병의 증상 밑에있는 세대.

Cenci 이전에 파킨슨병의 일방적 6-OHDA-lesioned 마우스를 생성을 위해 유사한 방법을 설명하고있다 그러나, 이것은 6 개 이상 21일 포스트 수술 다음 주사를 살아남은 동물의 겨우 14 %로, 높은 사망률과 관련되었다 - MFB 11에 OHDA. 여러 포스가 있습니다 프로토콜의 사망률의 부족에 대한 관계 였는데 설명은 여기에 설명했다. 첫째,이 프로토콜에서 선택한 stereotaxic 좌표는 주사 바늘이 완전히 시상 하부를 피할 수 있습니다. 마우스 시상 하부 너무 작은이기 때문에,이 구조에 손상이 체중과 탈수가 될 수있는 동물을 일으키는, 마우스 먹고 마시 센터에 영향을, 그리고 궁극적으로 죽을 수도 있습니다. 둘째, 여기에 설명된 프로토콜에 6-OHDA (3mg)의 동일한 농도가 Lundblad 및 동료 11 시까지 연구로 이용되었다, 그러나 그것은 느린 주입으로 작은 볼륨 (0.2ml가 1ml에 비해)으로 시행되었다 요금 (0.1ml/min은 0.5ml/min에 비해). 볼륨 작고 느린 주입 속도는 MFB 주변 구조물에 최소한의 피해를 보장합니다. 마지막으로 주사 바늘의 직경은 훨씬 작습니다 (0.33 대 50mm), 바늘은 두뇌를 통해 ventrally 여행으로 뇌 구조의 손상을 최소화됩니다.

의 낮은 수준의 ontent "> Cenci 또한 6-OHDA가 striatum 11로 주입 있기 때문에 일방적인 6-OHDA-병변을 생성하기위한 다른 방법을 설명하고있다. 쥐에게 6-OHDA의 striatal 주입 따라 설명되고 있듯이,이 결과 생쥐 사이에 더 많은 변수입니다 도파민 손실.

고려되어야합니다 마지막 고려 사항은 생쥐의 변형의 잠재적인 효과입니다. 이곳은 변형도 dopaminergic nigro-striatal 경로 29 선택적 세포 사망의 원인이 MPTP의 체계적 관리에 따라 도파민 고갈의 성공에 극적인 영향을 문서화되었습니다. 종 사이의 이러한 차이는 6-OHDA 관리를 수행 쥐에서 발생하는 것 같지 않지만, 그것이 생쥐에서 6 OHDA 병변의 성공을 결정하는 요인이 될 수도 있습니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

이 작품은 외교 계열과 국제 무역 (캐나다 정부), 토론토 Connaught 펀드, 혁신, NSERC, Krembil 재단과 치료 파킨슨병 Trust와 캐나다 재단의 대학에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
desipramine HCl Sigma-Aldrich D125 25mg/kg
pargyline HCl Sigma-Aldrich P8013 5mg/kg
6-OHDA HBr Sigma-Aldrich H116 3mg / mouse
stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 900
mouse ear cups Kopf Instruments Model 921 Zygoma Ear Cups
mouse incisor bar Kopf Instruments Model 923B
mouse anaesthesia mask Kopf Instruments Model 923B
priming kit (containing 250ml syringe) Hamilton Co PRMKIT 81120
RN compression fitting kit (1 mm) Hamilton Co 55750-01
PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) Hamilton Co 55751-01
dual small hub RN Coupler Hamilton Co 55752-01
luer to small hub RN adaptor Hamilton Co 55753-01
1ml 25S syringe model 7001KH Hamilton Co 80100
*33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel Hamilton Co 7803-05
Scissors Fine Science Tools 14084-08
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10035-20
Forcep Fine Science Tools 11608-15
Hemostats Fine Science Tools 13004-14
Isoflurane Abbott Laboratories 02241315 2-3%
Suters (Vicryl 4.0) Syneture SS-683
Steriliser Fine Science Tools 18000-45
Infusion Pump Harvard Apparatus PhD 22/2000
Needles (27G) BD Biosciences 305109
Needles (25G) BD Biosciences 305127
Syringes (1ml) BD Biosciences 309692
Anaesthesia trolley LEI medical M2000
Baytril CDMV, St. hyacinthe, QC 102207
Lidocaine CDMV, St. hyacinthe, QC 3914
Betadine solution CDMV, St. hyacinthe, QC 19955

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References

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파킨슨병의 일방적-6-OHDA lesioned 마우스 모델의 개발
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Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (60), e3234, doi:10.3791/3234 (2012).More

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (60), e3234, doi:10.3791/3234 (2012).

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