Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تطوير نموذج من جانب واحد lesioned الفأر 6 OHDA من مرض باركنسون

Published: February 14, 2012 doi: 10.3791/3234
Automatic Translation
1, 1, 1
1Centre for Neurobiology of Stress, Dept Biological Sciences, University of Toronto at Scarborough

Summary

يوصف بروتوكول للأداء من جانب واحد 6 OHDA الآفات من حزمة الدماغ الأمامي وسطي في الفئران. هذا الأسلوب لديه معدل وفيات منخفضة (13.3٪) مع 89٪ من الحيوانات على قيد الحياة يظهر> فقدان 95٪ من الدوبامين الجسم المخطط و90،63 -4،02٪ ± التحيز التناوب ipsiversive نحو الجانب من الآفة.

Abstract

أثبت lesioned من جانب واحد 6 hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned نموذج الفئران من مرض الشلل الرعاش (PD) أنها لا تقدر بثمن في تعزيز فهمنا للآليات التي تقوم عليها أعراض الشلل الارتعاشي، لأنه يلخص التغيرات التي طرأت على الدوائر العقد القاعدية والصيدلة التي لوحظت في مرضى الشلل الارتعاشي 1-4. ومع ذلك، فإن التغييرات الدقيقة الخلوية والجزيئية التي تحدث في القشرة الجسم المخطط نقاط الاشتباك العصبي للمسارات الانتاج في المخطط، والذي هو منطقة مدخلا رئيسيا من العقد القاعدية لا تزال بعيدة المنال، ويعتقد أن هذا الموقع حيث التشوهات المرضية الكامنة وراء أعراض باركنسونية تنشأ 3 (5).

في المشتريات، وفهم الآليات الكامنة وراء التغيرات في العقد القاعدية انحطاط الدوائر التالية من المسار nigro-الجسم المخطط قد تقدمت بشكل كبير من خلال تطوير كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) الفئران الإفراط في التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء مدفوعا تعزيز8، مما يسمح لهم درس في العزلة:؛: مسارات محددة للناتج اثنين الجسم المخطط (eGFP-D2 وeGFP A2A-طريقا غير مباشر eGFP-D1 طريق مباشر) روبية. على سبيل المثال، واشارت دراسات حديثة أن هناك تغيرات باثولوجية في اللدونة متشابك في الفئران باركنسونية 9،10. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات تستخدم الفئران الأحداث، ونماذج من الشلل الرعاش الحاد. ومن غير الواضح ما إذا كانت التغييرات وصفها في الفئران البالغين مع آفات 6 OHDA مستقر تحدث أيضا في هذه النماذج. وقد حاولت جماعات أخرى لتوليد مستقرة من جانب واحد lesioned فأر بالغ 6-PD OHDA نموذج من قبل lesioning حزمة الدماغ المقدم الإنسية (MFB)، للأسف، كان معدل وفيات الأطفال في هذه الدراسة عالية جدا، مع 14٪ فقط على قيد الحياة لعملية جراحية لمدة 21 أيام أو أكثر 11. الدراسات الحديثة قد ولدت داخل nigral الآفات مع كل من معدل وفيات منخفض وكان> فقدان 80٪ من الخلايا العصبية الدوبامين، وحرية التعبير ولكن من خلل الحركة التي يسببها لام دوبا 11،12،13،14 متغيرفي هذه الدراسات. آخر نموذج الفأر راسخة من PD هو الفأر MPTP lesioned-15. في حين أثبت هذا النموذج مفيدة في تقييم وكلاء اعصاب محتمل 16، هو أقل ملاءمة لفهم الآليات التي يقوم عليها أعراض من المشتريات، وهذا النموذج غالبا ما يفشل للحث على العجز الحركي، ويظهر تفاوت كبير في مدى انتشار آفة 17 و 18 .

هنا وضعنا مستقر من جانب واحد الفأر نموذج 6-OHDA lesioned من المشتريات من قبل الادارة مباشرة من OHDA-6 في MFB، والذي يسبب باستمرار> فقدان 95٪ من الجسم المخطط الدوبامين (مقاسا HPLC)، فضلا عن إنتاج السلوكية لاحظ الخلل في توصيفه جيدا من جانب واحد نموذج الفئران 6-OHDA lesioned من المشتريات. وهذا نموذج الفأر وضعت حديثا من PD تثبت أداة قيمة لفهم الآليات التي يقوم عليها جيل من أعراض الشلل الارتعاشي.

Protocol

1. الإسكان وإعداد من الفئران

  1. الحفاظ على مستعمرة من الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) مدفوعة الفئران المعدلة وراثيا 8 (المسخ للمصادر والفأر مركز (MMRRC) FVB في دورة 12:12 ضوء الظلام ساعة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. هذه الفئران هي الفئران FVB نقي، و ليس من الضروري أن تعبر هذه الفئران مع أي سلالة أخرى، إما لأغراض التربية، أو لضمان نجاح العملية آفة 6 OHDA.
  2. من أجل توليد نموذج باركنسونية، يطلب من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 31-42 يوما بعد الولادة (P31-42) لعملية جراحية-6-OHDA الآفة والشام.
  3. للحد من مخاطر العدوى، وإدارة Baytril (المضادات الحيوية) في مياه الشرب لمدة 24 ساعة قبل الجراحة.

2. إعداد الأدوية لعملية جراحية

تدار عادة تخدير من ديسيبرامين وبارغيلين إلى القوارض قبل الحقن من hydroxydopamine-6 ​​(6-OHDA) لزيادة الانتقائية وEFFicacy من 6 OHDA الناجم عن الآفات. المانع امتصاص النورادرينالين / 5HT، ديسيبرامين يقلل 6 OHDA التي يسببها والنورادرينالين 5HT نضوب 22، في حين ان مثبطات أوكسيديز، بارغيلين يعزز حساسية من المحطات الدوبامين إلى OHDA-6، عن طريق الحد من انهيار extrasynaptic من hydroxydopamine-6 ​​31.

  1. يمكن إجراء تخدير (هيدروكلوريد ديسيبرامين (HCL) وحمض الهيدروكلوريك بارغيلين) بكميات كبيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها. تزن خارج القدر المناسب من حمض الهيدروكلوريك ديسيبرامين لتزويد كل الفأر مع 25 ملغ / كغ بالنسبة لعدد الحيوانات التي ستتلقى عملية جراحية في ذلك اليوم. انخفاض الوزن من الماوس يجعل من تحدي لتسليم كميات صغيرة بدقة، وتعد بالتالي هيدروكلوريد ديسيبرامين بتركيز 2.5 ملغ / مل، وتدار على هذا الحيوان في 10 مل / كجم. ويجب أخذها في الاعتبار وزن المكون من الملح المجمع لمثل هذه أن يتحقق التركيز الصحيح. تصحيح للوزنحمض الهيدروكلوريك الملح في ديسيبرامين هيدروكلوريد: الوزن الجزيئي (MW) من حمض الهيدروكلوريك ديسيبرامين: 302.84 ميجاوات حمض الهيدروكلوريك: 36.46 ميجاوات من قاعدة الحرية: 266،38 عامل تصحيح: 302.84 / 266.38 = 1.137 للحصول على 10 مل من محلول: = 2.5mg/ml ديسيبرامين 10.0ml X X تصحيح عامل = 2.5mg/ml X 10.0ml X 1.137 = 28.43mg من هيدروكلوريد ديسيبرامين
  2. تزن خارج القدر المناسب من حمض الهيدروكلوريك بارغيلين لتزويد كل الفأر مع 5mg/kg لعدد من الحيوانات تلقي عملية جراحية في ذلك اليوم. تصحيح لمكون ملح مركب على النحو المبين أعلاه. انخفاض الوزن من الماوس يجعل من تحدي لتسليم كميات صغيرة بدقة، وتعد بالتالي هيدروكلوريد بارغيلين بتركيز 0.5 ملغ / مل، وإدارة للحيوان في 10 مل / كجم.
    الصحيح للوزن الملح حمض الهيدروكلوريك في هيدروكلوريد بارغيلين:
    ميغاواط من حمض الهيدروكلوريك بارغيلين: 195.69 ميجاوات حمض الهيدروكلوريك: 36.46
    ميغاواط من قاعدة الحرية: 159،23 عامل تصحيح: 195،69 / 159،23 = 1،229
    لمدة 10 مل من محلول تزن خارج: <ر /> = 0.5 ملغ / مل بارغيلين X 10.0 X تصحيح مل عامل
    = 0.5 ملغ / مل X 10.0 X 1.229 مل
    = 6.15mg من هيدروكلوريد بارغيلين
  3. الجمع بين حمض الهيدروكلوريك 28.43mg ديسيبرامين و6.15mg حمض الهيدروكلوريك بارغيلين في زجاجة 10 مل تخرج اسطوانة، وإضافة 8 ملحي معقم مل (0.9٪). دوامة والحرارة إلى 45 درجة مئوية حتى يذوب الخليط. والرقم الهيدروجيني من الحل الآن أن تكون في حدود 3، والتي إذا ما تم إعطاؤها للفئران سوف يسبب عدم الراحة ومضاعفات ما بعد الجراحة البولية والجهاز الهضمي التي تنطوي على وظيفة الجهاز. إضافة قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (1M) حتى درجة الحموضة 7.4. أعلى ما يصل إلى حجم 10ML مع ملحي معقم (0.9٪)، ودوامة. التسمية، وتاريخ وتجميد في ~ 80 درجة مئوية. نظرا إلى أن بارغيلين حمض الهيدروكلوريك ليست قابلة للذوبان في المياه المالحة في درجة حرارة الغرفة، طوال فترة الجراحة، وتخزين خليط تخدير في حمام الماء الساخن إلى 37 درجة مئوية في غرفة العمليات.
  4. يجب أن يكون مستعدا للحلول OHDA-6 مباشرة قبل العمليات الجراحية. السيارة المستخدمة في حل 6 OHDA هيدروبروميد (6-OHDA.Br) الحل هو ملحي معقم (0.9٪) حامض الاسكوربيك حل التي تحتوي على (0.2٪). وهناك حاجة لتحقيق الاستقرار في حامض الاسكوربيك 6 OHDA.Br، كما أنه يمنع أكسدة OHDA.Br-6 في شكل غير نشط. تزن 0.2 غرام من حمض الاسكوربيك، ثم إضافة إلى L 1 فارغ تخرج اسطوانة، وأعلى ما يصل الى 1 لتر مع ملحي معقم (0.9٪) واثارة. التسمية، تاريخ، ومخزن في ~ 80 درجة مئوية حتى المطلوبة.
  5. تزن خارج القدر المناسب من OHDA.HBr-6 لتقديم 15.0 ملغ / مل حل لتزويد كل فأر مع 3.0 ميكروغرام. منذ 6 OHDA.Br هو الضوء والحرارة الحساسة تجنب التعرض للضوء، ومكان على الجليد قبل وزنها.
    الصحيح للوزن الملح HBR في OHDA.HBr-6:
    ميغاواط من OHDA.HBr-6: 250.09 ميجاوات HBR: 79.9 ميغاواط من قاعدة الحرية: 170.19
    معامل التصحيح: 250،09 / 170،19 = 1،47
    ل0.5 مل من محلول وزن المغادرة:
    = 15.0 ملغم / لتر 6 OHDA × 0.5 تصحيح X مل عامل
    = 15.0 ملغم / لتر 6-X OHDA 0.5 مل X 1.47
    = 11.03 ملغ من OHDA.HBr-6
  6. لالشام التي تديرها الحيوانات، وتشكل وحدة تخزين ما يعادل مركبة (ملحي معقم (0.9٪)، حمض الاسكوربيك 0.02٪ الحموضة 7.4) لتلك التي ستحصل على الحيوانات 6-OHDA lesioned، والمكان في أنبوب 1.0 مل العقيمة ملفوفة في التسمية والقصدير، واحباط ومكان على الفور على الجليد حتى الاستخدام.

3. إنشاء جهاز جراحي

يجب تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام تي الأوتوكلاف قبلس لعملية جراحية. بين كل عملية، لا بد من تعقيم الأدوات الجراحية في الايثانول 95٪ يليه التسخين إلى 250 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. يجب إجراء جميع التجارب وفقا لمبادئ توجيهية للجان رعاية الحيوان المناسب لهذه المؤسسة التابعة لها والقطري.

  1. تنظيف جميع الأسطح والمعدات مع ايزوبروبيل قبل إنشاء هذا الجهاز. ارتداء القفازات المعقمة عند التعامل مع المعدات الجراحية النظيفة.
  2. مجموعة المتابعة الفأر قفص الانتعاش مع المناشف الورقية على قاعدة. مكان تحت مصباح التدفئة أو على رأس وسادة ساخنة.
  3. إعداد عربة تخدير، وضمان أن يتم توصيل تدفق الأكسجين ومفتوحة، وخزان مليء isoflurane تماما. ضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر / دقيقة، وisoflurane إلى 2-4٪. من الناحية المثالية سيكون هناك منافذ تدفق اثنين من آلة مخدر لتقديم مزيج الأكسجين isoflurane إلى غرفة الاستقراء، وكذلك للصيانة في حين أن الحيوان هو في إطار التجسيمي.
  4. شاركrrect تجميع جهاز التسريب هو أمر حاسم لضمان نجاح الآفات، والهواء المحبوس أو الإبر سدت يقلل من حجم OHDA-6 التي غرست في موقع الآفة. تجميع جهاز التسريب كما هو موضح في الشكل 1. خيوط من معدن RN 1 الجوز على جانب واحد من أنابيب PEEK (RN ضغط مجموعة (تركيب 1/16 بوصة ال))، تليها الطويق كأس نظرة خاطفة، ثم الكنسي PFA الطويق. توجيه الحلقات بحيث المخروط على الطويق PFA الكنسي تنزلق إلى التزاوج جزء من كأس PEEK الطويق. في مكان صغير مزدوج مقرنة RN محور (# 1)، وضمان الاتصال هو ضيق. على الطرف الآخر من ثنائي صغير مقرنة RN محور إدراج حقن إبرة قياس 33. الخيط الإبرة من خلال واحدة من المكسرات وتشديد معدن RN. ضمان إبرة قياس 33 هو بزاوية 180 درجة للثنائي صغير محور RN مقرنة (# 1). على الطرف الآخر من الخيط نظرة خاطفة، وأنابيب واحد من المكسرات معدن RN تليها الطويق نظرة خاطفة، ثم PFA الطويق. إدراج الجوز معدنيالثانية الطويق الجمعية الى مزدوج صغير 2 مقرنة RN محور وتشديد الاتصال. على الطرف الآخر من صغير مزدوج 2 مقرنة محور RN (# 2) إدراج luer إلى محول صغير RN محور (محول luer)، وتشديد الاتصال.
  5. ويجب أن تستعد المقبل جهاز ضخ (انظر الشكل 1). ملء ميكرولتر 250 و 1،0 ميكروليتر المحاقن هاميلتون مع الماء المعقم، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء. تعلق المحقنة 250 ميكروليتر إلى محول luer وكساد الغطاس من الحقنة 250 ميكروليتر من هذا القبيل أن يتم تحرير المياه من خلال حقن إبرة قياس 33 على الطرف الآخر من الأنبوب. مواصلة دفع المياه من خلال نظام في حين سحب الحقنة 250 ميكروليتر من محول luer، وترك المياه الصغيرة حبة في نهاية محول luer. كساد الغطاس من الحقنة 1،0 ميكروليتر حتى يتم إخراج صغيرة حبة المياه. إدراج بعناية الحقنة 1،0 ميكروليتر في محول luer، التأكد من أن المياه حبة على حقنة 1،0 ميكروليتر يربط مع س المياه الحالية حبةن محول luer، وإدراج تماما الحقنة 1،0 ميكروليتر في محول luer. ضمان عدم وجود فقاعات في صغير مزدوج مقرنة محور RN.
  6. الآن بعد أن وتستعد للنظام، يمكن تأمين جهاز نضح إلى الإطار التجسيمي ومضخة التسريب. المشبك صغير مزدوج مقرنة محور RN مع إبرة قياس حقن 33 التابعة لسلاح مناور من الإطار التجسيمي، المشبك ثم الحقنة 1،0 ميكروليتر للمضخة نضح، بحيث عندما مضخة نضح يبدأ الضغط على حقنة ضد المشبك و لا يمكن تحرك. برنامج مضخة التسريب على السماح لمعدل ضخ 0،1 ميكروليتر / دقيقة.

4. من جانب واحد لعملية جراحية آفة 6 OHDA

  1. ثلاثين دقيقة قبل العمليات، وزن كل حيوان وتسجيل الوزن. إدارة جهازيا هيدروكلوريد ديسيبرامين (2.5 ملغ / مل، سيغما الدريتش) وبارغيلين هيدروكلوريد (0.5 ملغ / مل، سيغما الدريتش) (0.9٪ ملحي معقم، ودرجة الحموضة 7.4) في 10 مل / كجم من داخل البريتوني حقن (IP) إلى واحد الماوسباستخدام إبرة 27G تعلق على حقنة 1ml. على سبيل المثال، فإن ماوس ز 30.0 تلقي 300 ميكرولتر من تخدير. الاحماء القرص التدفئة ووضع هذا تحت الأذن وشريط القاطعة. وسوف القرص التدفئة تساعد على الحفاظ على درجة حرارة الحيوان خلال عملية جراحية والحفاظ على الحيوانية في ارتفاع مثالي لتناسب القضبان الأذن والقاطعة للإطار التجسيمي.
  2. خمس عشرة دقيقة بعد إدارة ديسيبرامين حمض الهيدروكلوريك وحمض الهيدروكلوريك بارغيلين حل، ضع الماوس في غرفة التخدير مغلقة، وanesthetise الحيوان باستخدام استنشاق isoflurane (2-3٪ في O 2). هذا الحيوان هو anesthetised بما فيه الكفاية عندما لا يظهر أي استجابة لقرصة الساق الخلفية وليس رد الفعل وميض.
  3. حلق رأس رئيس الماوس،، وتطبيق مسكن موضعي يدوكائين مباشرة على الجلد باستخدام القطن والصوف. خمس دقائق بعد تطبيق يدوكائين، تعقيم رئيس حيوان مع حل betadine.
  4. وضع الحيوان في إطار التجسيمي تكييفها للفئران. وضع أولا للحيوان في الحانات القاطعة (القاطعة وضع شريط: -3.0 إلى +2.0 ملم) مع قناع التخدير وضعت على وجهه من الحيوان. ضبط تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر / دقيقة، وisoflurane إلى 1،5-2٪. يجب أن يكون شريط القاطعة على المستوى النسبي للكؤوس الأذن مثل أن الجزء العلوي من الجمجمة ومستوى. تضاف أكواب الأذن (قطرها 5.0 مم). وقد تم إدراج كؤوس الأذن بشكل صحيح عند الرأس فارغة تماما، و لا يمكن نقله في أي من الاتجاهين.
  5. قطع على طول خط الوسط من الجلد على اعلى الرأس من الفأرة باستخدام شفرة مشرط، وسحب الجلد. تجف على سطح الجمجمة باستخدام الشاش.
  6. دفع المكبس إلى أسفل من الحقنة 1،0 ميكروليتر، ووضع حقن قياس 33 إبرة في أنبوب 1 مل المشمولة في القصدير الرقيقة التي تحتوي على 6-OHDA حل (15 ملغ / مل). التراجع ببطء على الغواص من الحقنة 1،0 ميكروليتر مع الحفاظ على حقن إبرة قياس 33 منغمسين في حل 6 OHDA (15 ملغ / مل).
  7. إنشاء شق 1 سم على طول منتصفخط من الجمجمة. تقدم غيض من إبرة حقن نحو Bregma، موزعة على كمية صغيرة من 6 OHDA حل من حقن إبرة قياس 33 إلى تشكيل حبة صغيرة. خفض ببطء غيض إبرة حقن لBregma، عندما حبة اللمسات Bregma توقف المضي قدما في رأس الإبرة وتسجيل هذه الإحداثيات. التراجع عن حقن إبرة 2 مم في الاتجاه ظهري، والتحرك على طول الدرز السهمي في اتجاه الذيلية منقاري نحو امدا. دفع مبلغ صغير من 6 OHDA حل من إبرة قياس 33 حقن لتشكيل حبة صغيرة. خفض ببطء غيض إبرة حقن لامبدا، عندما الاتصالات حبة امدا وقف التقدم في رأس الإبرة وتسجيل هذه الإحداثيات. الجانبي الأنسي (ML)، وظهري بطني (DV) الإحداثيات يجب أن تكون مطابقة لBregma وامدا، إذا لم تكن كذلك، ضبط شريط قاطعة وفقا لذلك لإحداثيات أ ب، وأشرطة الأذن لإحداثيات ML. تحريك الإبرة إلى تنسق ا ف ب: -1.2 مم، ML: -1.1 ملم بالنسبة لBregأماه وفقا للماوس أطلس الدماغ في التجسيمي تنسق 25. سحب الإبرة، ولدغ ثقب في الجمجمة باستخدام إبرة قياس 25.
  8. إعادة حقن إبرة إلى ما سبق تنسق، ويدخل الإبرة إلى DV: 5mm. ضخ 0،2 ميكرولتر من OHDA-6 أو مركبة من جانب واحد في حزمة الدماغ المقدم بمعدل متوسط ​​قدره 0.1 ميكروليتر / دقيقة (3 مجموع ميكروغرام). عند الانتهاء من إقامة OHDA-6 أو مركبة، وترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى للسماح للنشر بعيدا عن موقع الحقن.
  9. التراجع ببطء الإبرة.
  10. إغلاق شق في فروة الرأس باستخدام ثلاثة خياطة الجروح، وتقديم 1ml من حل قارع الأجراس في Lactated تحت الجلد (SC).
  11. إزالة الحيوان من إطار التجسيمي، والمكان في القفص حتى يتم استرداد استعاد وعيه.

5. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية من 6 OHDA-lesioned الحيوانات

  1. مكان الحيوانات في أقفاص (3 الفئران / قفص)، وتسمح بحرية الوصول إلى المواد الغذائية وsugareد المياه (10 ملم). تقدم نوترا جل وKMR (هريرة استبدال الحليب) في حاويات المواد الغذائية على أرضية القفص لتحفيز الشهية والحركة المعوية.
  2. فحص الفئران يوميا بعد الجراحة لمدة 2 24 أسبوعا. وينبغي على كل عملية تفتيش إيلاء اهتمام خاص إلى اليقظة من هذا الحيوان من خلال تقييم قدرة الحيوانات على التحرك في القفص. وينبغي أيضا تناول الطعام والماء من فترة الملاحظة الأخيرة، فضلا عن وجود وتماسك البراز يتعين مراعاتها. ألف مشترك بعد العملية المضاعفات هو جفاف هذا واضح من قبل التراجع البطيء للجلد قرصة الجلد التالية. إذا لاحظت هذا من تقديم 1ml Lactated SC حل رينغر لمدة 1 أسبوع أو حتى تحسين الأعراض. في حالة الحيوانات الذكور، ويجب أن تكون الأعضاء التناسلية لاحظ بعناية لتدلي القضيب التي حددها احمرار في القضيب. إذا كان هذا يحدث تطبيق هلام mucol إلى القضيب من الحيوان المتضررة، وتقديم 1 مل من Lactated SC حل رينغر لمدة 1 أسبوعأو حتى أعراض التحسن.
  3. وزن الحيوان يوميا لرصد التغيرات في وزن الجسم.
  4. في الحالة التي يكون فيها حقن الملكية الفكرية أدى إلى تمزق صغير في الجهاز الهضمي، قد يؤدي إلى إصابة في البطن. لذلك، وتقييم لprsence من إصابة في البطن، واضح من قبل بطن منتفخ منتفخة. علاج من قبل إدارة Baytril في الماء drining لمدة 3-4 أيام أو حتى تحسين الأعراض.

6. باركنسونية تقييم

لتقدير مدى انتشار الآفة، تم إجراء تقييم السلوكية 14-21 يوما بعد جراحة-6-OHDA الآفة، عندما كمية من نضوب الدوبامين هو الحد الأقصى ومستقرة 26.

  1. بعد حقن الملكية الفكرية من 0،01 المالحة مل / ز معقم بنسبة 0.9٪، والفئران في مكان اسطوانات زجاج (11 سم x 9.5 سم) وتسجيل نشاطهم باستخدام videocamera (CG9، سانيو).
  2. مشاهدة شريط الفيديو، حساب عدد دورات كاملة 360 درجة المحرز في ipsiversive على حد سواء وcontravاتجاه ersive بالنسبة للآفة.
  3. كلما زاد وانحياز واشنطن تناوب ipsiversive، والمزيد من باركنسونية الحيوان، وبالتالي احتساب نسبة دوران ipsiversive كنسبة مئوية من صافي (معاكس التدوير وipsiversive) السلوك التناوب.

7. تحديد محتوى الدوبامين الجسم المخطط من قبل HPLC

  1. 21 يوما على الأقل بعد الجراحة آفة 6 OHDA، وعند الانتهاء من الدراسات السلوكية، وتضحية من الفئران جرعة من بين أكثر من التخدير، وإزالة بعناية الدماغ. الإبقاء على شريحة واحدة من المخطط (230 ميكرون) من كل نصف الكرة الأرضية في كل فأر، والمفاجئة تجميد فورا بعد باجتزاء ومخزن في -80 درجة مئوية حتى إعداد عينات الجسم المخطط.
  2. المخزن المؤقت عينة HPLC (0.1 M الشراكة والتعاون مع الجلوتاثيون ملم 2) يمنع الدوبامين المستخرج من عينات الجسم المخطط من الانهيار.
    ل100 مل من عينة العازلة:
    = 100 مل HPLC الصف H 2 O
    = 0.862 مل PCA (70٪) (Sigmأ)
    = 61.5 ملغ الجلوتاثيون (خفض)
    قياس خارج الصف HPLC H 2 O، إضافة اتفاقية الشراكة والتعاون، حل الجلوتاثيون في الحل، وتخلط جيدا والتصفية. ويمكن تخزين المخزن المؤقت عينة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  3. ذوبان الجليد شرائح الجسم المخطط على الجليد، ثم homogenise في 200 عينة العازلة ميكروليتر باستخدام ديسروبتر خلية بالموجات فوق الصوتية (فيشر صوتي، الولايات المتحدة الأمريكية). الحفاظ على العينات على الجليد في جميع الأوقات وhomogenise كل عينة ثلاث مرات لمدة 10 ثانية كل ضمان السماح للعينات لتهدئة بين فترات التجانس.
  4. تخصيص 20 ميكرولتر من كل عينة متجانسة (مخزن في -80 درجة مئوية) لفحص البروتين.
  5. منبذة العينات (20800 XG و 20 دقيقة (4 درجات مئوية، إيبندورف 58 - 04R، الولايات المتحدة الأمريكية))، ثم إزالة طاف ومرشح من خلال غشاء ميكرومتر PVDF 0.2 (بال، القط #: 1935-28143-310) وتجميد في -80 درجة مئوية حتى تحليل HPLC. الإبقاء على بيليه بروتين باعتبارها لاحتياطية لفحص البروتين.
  6. التحضير للمرحلة متنقلة لHPLC لتشغيل عبتيough العمود هبلك.
    ل1 لتر من الطور المتحرك:
    60 ملم ناه 2 PO 4. H 2 O (أحادى) = 8،27 ز
    حامض الستريك 30 مم = 5.7 ز
    0.13 حامض Ethylenediaminetetraacetic ملم (EDTA) ملح الصوديوم يذوى = 48 ملغ
    دوديسيل كبريتات الصوديوم 0،16 ملم (SDS) = 45 ملغ
    850 مل ماء الصف HPLC (كاليدون، القط #: 8801-7)
    15٪ V / V-190 الأسيتونيتريل (درجة الحموضة 3.35) = 150 مل HPLC الصف (كاليدون، القط #: 1401-7)
    ~ 2 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 10 (H2O في الصف HPLC)
    وينبغي أن تكون جميع الكواشف ≥ 99.0٪ من هبلك نقية ودرجة كلما كان ذلك ممكنا. يجب أن تكون المياه والأسيتونيتريل HPLC الصف. يجب استخدام الطور المتحرك خلال أسبوع واحد من الإعداد. وقد كرست، والأواني الزجاجية النظيفة ويحرك القضبان فقط لإعداد المرحلة المتنقلة (كوب L 1 أسطوانة قياس وعلى الأقل 2 1 قوارير الزجاج L). قبل إعداد الطور المتحرك واثنين من قوارير نظيفة L 1 أعدت، واحدة لجعل الحل في واحد من نقله إلى خلال الترشيح وdegassiنغ. السماح للمرحلة المحمول إلى تعميمها من خلال HPLC بين عشية وضحاها، وتأكد من أن الأساس هو مسطح قبل استخدامها.
  7. قياس من أصل 700 مل من الماء إلى درجة HPLC اسطوانة زجاج قياس وحل. ناه 2 PO 4. H 2 O، حمض الليمون، EDTA والحزب الديمقراطي الصربي في ذلك أعلى ما يصل الماء إلى 850 مل.
  8. ضبط درجة الحموضة إلى 3،35 باستخدام 10 M هيدروكسيد الصوديوم، ثم تضاف الأسيتونيتريل وتخلط الحل باستخدام شريط تفلون ضجة المغلفة.
  9. وضع بقضيب في المجموعة الثانية، فارغة نظيفة قارورة 1 لتر وفراغ تصفية الطور المتحرك في ذلك من خلال مرشح 0.22 ميكرون ميليبور HVLP: (القط #: SLGP033RS). يتبولون لمرشح في O 85:15 2 H / ACN قبل الترشيح. مرة واحدة يتم تصفية بالكامل المحمول، وديغا الطور المتحرك خلال إثارة تحت فراغ لا يقل عن 10 دقيقة.
  10. إعداد المعايير التي سيتم على أساسها قياس تركيز الدوبامين في الجسم المخطط العينات. وتدار من خلال المعايير HPLC في بداية ونهاية كل دفعة من عينات الجسم المخطط. A 1يمكن ملغ / مل يتم حل الأوراق المالية من الدوبامين مقدما وتخزينها في 20 aliquots ميكرولتر في -80 درجة مئوية. لتحضير محلول المخزون حل الدوبامين 5 ملغ في 5 العازلة عينة مل (انظر أعلاه) ويخلط جيدا. البدء في إعداد المعايير من خلال اتخاذ 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الأوراق المالية، وإضافته إلى 2.5 مل العازلة العينة وخلطها جيدا للحصول على ميكروغرام / 2 مل من محلول الدوبامين.
  11. يتم تشغيل أربعة معايير من خلال HPLC لإنتاج منحنى تركيز. لتركيز الدوبامين هي: 100 نانوغرام / مل، 50 نانوغرام / مل، 25 نانوغرام / مل، و 12.5 نانوغرام / مل. من أجل توليد هذه التركيزات أربعة من الدوبامين تستغرق 10 ميكرولتر من حل الدوبامين 2 ميكروغرام / مل أعد 7.10). وإضافته إلى 190 ميكروليتر من عينة عازلة لأعطيك نانوغرام / 100 مل حل الدوبامين. بعد هذا إجراء تخفيف 01:01 التسلسلي للنانوغرام / 100 مل حل الدوبامين مع عينة العازلة. بكل بساطة 100 ميكروليتر من 100 نانوغرام / مل الدوبامين وإضافة 100 ميكروليتر من عينة العازلة ومزيج لإنتاج 50 نانوغرام / مل الدوبامين، ثم تأخذ 100ميكرولتر من الدوبامين نانوغرام / مل 50 و إضافة 100 ميكروليتر من عينة العازلة ومزيج لانتاج 25 نانوغرام / مل الدوبامين وهلم جرا.
  12. لإعداد نظام HPLC، (مضخة مياه ثنائي 1525μ، 717plus الاوتوماتيكى، التناظر C-18 عكس المرحلة العمود (15 سم x 4.6 ملم رقم، 5 ميكرون حجم الجسيمات) (30 درجة مئوية)، الكهروكيميائية للكشف عن (وكالة الفضاء الأوروبية Coulochem الثالث) مجهزة مع خلية ثنائي القطب التحليلية (ESA 5011A) والتي تسيطر عليها البرمجيات النسيم (مياه)) تطهير النظام أولا مع الطور المتحرك من خلال تحديد بروتوكول تطهير في برامج الحاسب الآلي أو عن طريق اتباع إرشادات الشركة المصنعة. هذه التبادلات كل حل السابقة في نظام HPLC مع الطور المتحرك الطازجة.
  13. تعيين إمكانات الكهروكيميائية في 400 بالسيارات و-300 بالسيارات لأقطاب الأولى والثانية على التوالي. بعد هذا، تتوازن النظام عن طريق تشغيل لمدة لا تقل عن 2 ساعة، وبين عشية وضحاها بشكل مثالي مع الطور المتحرك في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة. وينبغي أن تتحول خلال موازنة الخلايا على وإعادة خط الأساسading مراقبة، وعندما تصبح القراءة مستقر النظام جاهز للاستخدام. في الساعة الاولى من موازنة السماح للمرحلة النقالة التي يخرج من نظام الخوض في وعاء المبذر، وبعد ذلك يمكنك السماح للمرحلة إعادة توزيع النقالة من خلال نظام HPLC من خلال وضع خرطوم منفذ في قارورة مرحلة الجوالة.
  14. ذوبان الجليد عينات الجسم المخطط على الجليد، ثم حقن 20 ميكرولتر من كل مستوى الدوبامين تليها 2 ميكرولتر 20 × من كل عينة، وكذلك 20 ميكرولتر من كل مستوى الدوبامين في النظام HPLC معايرتها مع معدل تدفق مرحلة الجوالة في 1 مل / دقيقة.
  15. استخدام البرنامج لتحليل منظومة HPLC المنطقة من قمم الدوبامين التي تنتجها المعايير والعينات. وبمقارنة منطقة من قمم الدوبامين الموجودة في العينات الجسم المخطط إلى منحنى تركيز الدوبامين معيار تحديد كمية الدوبامين في 20 الحالي ميكرولتر من كل عينة الجسم المخطط. توسيع نطاق هذا الرقم يصل الى العثور على مجموع الحالي الدوبامين في الجسم المخطط على شريحة كاملة.
  16. فerform مقايسة بروتين القياسية على ميكرولتر 20 من جناسة الجسم المخطط الذي يوضع جانبا في 7.4). وهذا قياس كمية البروتين موجود في عينات الجسم المخطط في ملغم / لتر. من هذا حساب كمية الدوبامين في الجسم المخطط عينات كقيمة في نانوغرام / مغ مما يسمح لك لمقارنة تركيزات الدوبامين بين نصفي الكرة الأرضية وبين الفئران.

8. ممثل النتائج

ويمكن استخدام خمس عشرة إلى 21 يوما بعد عملية جراحية-6-OHDA الآفة، عندما كمية من موت الخلايا الناجم عن عصبي وصلت completion26، والقياس من 360 درجة تناوب عفوية بعد إقامة 28 (IP) ملحي لتقييم النجاح من 6 -OHDA-lesioned (الشكل 2). هذه الطريقة في التقييم السلوكي بسيط وسريع، والابتعاد عن التأثيرات المحتملة فتيلة الناجمة عن عوامل الدوبامين مثل الأمفيتامين أو التحديات آبومورفين. وعلاوة على ذلك، عفوية تقييم التناوب هو أفضل predictor من الحيوانات مع <نضوب الدوبامين 95٪ مقارنة مع مخلب forelimb اختبار تحديد المستوى 27. بواسطة ربط مستويات الدوبامين الجسم المخطط من عينات الجسم المخطط (المعد عند الانتهاء من الدراسات السلوكية باستخدام HPLC) مع النسبة المئوية للتناوب ipsiversive عفوي في كل حيوان، وجدنا أن الحيوانات التي يحمل 70٪ أو أكثر ipsiversive تناوب نحو الآفة 6 OHDA فقدوا> الجسم المخطط الدوبامين 95٪ (الشكل 3) 27. بعد الآفات 6 OHDA الناجم عن جزئية (59.44 ± 17.20) (الشكل 3) من حزمة الدماغ الأمامي وسطي، لم يكن هناك انحياز التناوب بين الجانبين ipsiversive مقابل معاكس التدوير عند قياس التناوب العفوي (40.91 ± 8.01) (الشكل 2). وبالتالي، لم يتم العثور على النحو التالي 6 OHDA الإدارة إلى MFB في الفئران، فمن الممكن أن يتسبب في فقدان عميق للعصبونات الجسم المخطط nigro-الدوبامين، وإدارة المياه المالحة (IP) هو طريقة دقيقة لفحص مدى OH-6DA آفة في هذه الحيوانات.

الشكل 1

الشكل 1. رسم تخطيطي لإظهار تجميع جهاز حقن إبرة لمدة 6-OHDA-آفة العمليات الجراحية.

الشكل 2

الشكل 2. تقييم سلوك التناوب في الشام التي تديرها و 6-OHDA الفئران lesioned. عفوية التناوب في الفئران الشام التي تديرها و 6-OHDA lesioned. وتعرض البيانات كما يعني نسبة التناوب ipsiversive ± SEM، حيث صافي معاكس التدوير وتناوب ipsiversive هي 100٪. الحانات المفتوحة: الشام التي تديرها الحيوانات؛ القضبان الرمادية: 6-OHDA-lesioned مع الحيوانات> فقدان الدوبامين 95٪؛ قضبان الأسود: الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية-6-OHDA الآفة التي تم lesioned جزئيا. *** P <0.001 بالمقارنة مع الشام التي تديرها الحيوانات. ثم في اتجاه واحد أنوفا بواسطة اختبار دان مقارنة متعددة (S لحم الخنزير التي تديرها: ن = 17؛ 6-OHDA lesioned (> 95٪): ن = 23؛ الجزئي 6-OHDA آفة: ن = 3).

الشكل (3)

الشكل 3. تقييم مستويات الدوبامين في الجسم المخطط الشام التي تديرها و 6-OHDA الفئران lesioned باستخدام HPLC. تم تحديد محتوى الجسم المخطط الدوبامين في نصف الكرة الأرضية التي تعمل وunoperated من الشام والحيوانات-6-OHDA lesioned. وتعرض البيانات كنسبة مئوية يعني ± SEM من مستويات الدوبامين في الجسم المخطط المخطط unoperated. الحانات المفتوحة: الشام التي تديرها الحيوانات؛ القضبان الرمادية: 6-OHDA-lesioned مع الحيوانات> فقدان الدوبامين 95٪؛ قضبان الأسود: الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية-6-OHDA الآفة التي تم lesioned جزئيا. *** P <0.001 **، P <0.01 مقارنة مع الشام التي تديرها الحيوانات. في اتجاه واحد أنوفا يليها اختبار دان مقارنة متعددة (الشام التي تديرها: ن = 17، 6-OHDA lesioned (> 95٪): ن = 23، جزئي 6-OHDA آفة: ن = 3).

eak ">

الشكل 4

الشكل 4. تقييم تفاعلية مناعية هيدروكسيلاز التيروزين في المجلس الوطني الأعلى في الشام التي تديرها و 6-OHDA الفئران lesioned. كعلامة من فقدان الخلية الدوبامين في المكتنزة substantia بارس أسود (SNC)، وفقدان هيدروكسيلاز التيروزين (TH) immunohistochemisty إيجابي في نصف الكرة الأرضية التي تعمل وunoperated من الشام والحيوانات-6-OHDA lesioned كان مصمما على النحو المبين في ثييل وآخرون. في الصحافة. وتعرض البيانات كنسبة مئوية يعني ± SEM من الخلايا إيجابية TH في المخطط unoperated. الحانات المفتوحة: الشام التي تديرها الحيوانات؛ القضبان الرمادية: 6-OHDA-lesioned مع الحيوانات> فقدان الدوبامين 95٪؛ قضبان الأسود: الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية-6-OHDA الآفة التي تم lesioned جزئيا. *** P <0.001 **، P <0.01 مقارنة مع الشام التي تديرها الحيوانات. ثم في اتجاه واحد أنوفا بواسطة المقارنة دان متعددةrison اختبار (الشام التي تديرها: ن = 17، 6-OHDA lesioned (> 95٪): ن = 23، جزئي 6-OHDA آفة: ن = 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول وصفا لطريقة لتوليد مستقرة من جانب واحد الفأر نموذج 6-OHDA lesioned من مرض باركنسون، والذي هو تكرار للغاية، مع نسبة نجاح عالية الآفة، ومعدل وفيات منخفض. ويمكن لنجاح عملية جراحية آفة 6 OHDA يقدر بسهولة عن طريق قياس السلوك العفوي مع التناوب> تناوب ipsiversive 70٪ يدل على> نضوب الدوبامين 95٪ في المخطط lesioned 27. الكمي لمستويات الدوبامين الجسم المخطط هو قياس أكثر دقة لمدى نضوب الدوبامين الجسم المخطط مقارنة quantificiation للخلايا TH-إيجابي في عدد المكتنزة substantia بارس أسود، كما أنه يوفر القياس المباشر لمستويات الدوبامين الجسم المخطط 28. نظرا إلى أن هذا البروتوكول يستنسخ موقع الحقن (MFB) وطول تنمية آفة (21 يوما) من جانب واحد يتميز أيضا نموذج الفئران 6-OHDA lesioned من 1،4 مرض باركنسون، يمكن افتراض أن الفي هذا النموذج من الفئران، كما هو الحال مع نموذج الفئران، يجمل لاحظ التغيرات في الصيدلة ودوائر الدماغ في المرضى الذين يعانون من مرض الشلل الرعاش. وهكذا، وهذه الطريقة توفر وسيلة لتوليد نموذج من أعراض مرض باركنسون في الفئران المعدلة وراثيا. وبالنظر إلى أن الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات قوية للغاية على إتاحة الفرصة لنا لفهم دور الجزيئات والبروتينات في الجسم الحي في الجزيئية، وصولا إلى مستوى الأنسجة الخلوية وكامل، والجمع بين هاتين التقنيتين أن تكون مفيدة للغاية في تحديد مزيد من الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء جيل من أعراض مرض الشلل الرعاش.

Cenci وقد وصفت سابقا طريقة مماثلة لتوليد من جانب واحد 6 OHDA-lesioned فأر من مرض باركنسون، ولكن، وارتبط ذلك مع ارتفاع معدل الوفيات، مع 14٪ فقط من الحيوانات على قيد الحياة أكثر من 21 عملية جراحية آخر أيام حقن التالية 6 - OHDA في MFB 11. هناك عدة POSS ووصف التفسيرات ible لعدم وجود وفيات في بروتوكول هنا. أولا، التجسيمي تنسق اختيارها في هذا البروتوكول يسمح للإبرة حقن لتجنب تماما ما تحت المهاد. منذ ما تحت المهاد فأر صغير جدا، قد أي ضرر لهذه البنية تؤثر على مراكز الأكل والشرب من الفأرة، مما تسبب في الحيوانات لانقاص وزنه وأصبح المجففة، ويموت في نهاية المطاف. ثانيا، في البروتوكول وصفها هنا، واستخدمت نفس التركيز من OHDA-6 (3mg) كما في الدراسة التي Lundblad وزملاؤه 11، بيد أنها أدركت ذلك في أصغر حجم (0.2ml مقارنة 1ml) مع أبطأ التسريب معدل (0.1ml/min مقارنة 0.5ml/min). معدل ضخ اصغر حجما وأبطأ ضمان الحد الأدنى من الضرر للهياكل المحيطة MFB. أخيرا القطر من إبرة الحقن هو أصغر بكثير (0.33 مقابل 50mm)، والتي من شأنها أن تقلل الأضرار التي لحقت بنية الدماغ كما الإبرة يسافر البطني من خلال الدماغ.

ontent "> Cenci وقد وصفت أيضا طريقة أخرى لتوليد من جانب واحد 6 OHDA، آفات، مع حقنها 6 OHDA في المخطط 11. وكما وصفت بعد حقن الجسم المخطط من OHDA-6 في الفئران، وهذا يؤدي إلى انخفاض مستوى خسارة الدوبامين، التي هي أكثر المتغير بين الفئران.

وهناك اعتبار أخير التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار هو تأثير محتمل لسلالة من الفئران. فقد تم توثيق جيد لسلالة له تأثير كبير على نجاح نضوب الدوبامين بعد إدارة النظامية من MPTP، والذي يسبب موت الخلية أيضا انتقائي من مسار الجسم المخطط الدوبامين nigro-29. في حين أن هذا الفرق بين الأنواع لا يبدو أن تحدث في الفئران بعد 6 OHDA إدارة، فمن الممكن أنه قد يكون عاملا في تحديد مدى نجاح 6 OHDA آفة في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل وزارة الشؤون الخارجية والتجارة الدولية (حكومة كندا)، وجامعة تورنتو كونوت الصندوق، ومؤسسة الكندي للابتكار، NSERC، ومؤسسة Krembil وتثق به لعلاج الشلل الرعاش.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
desipramine HCl Sigma-Aldrich D125 25mg/kg
pargyline HCl Sigma-Aldrich P8013 5mg/kg
6-OHDA HBr Sigma-Aldrich H116 3mg / mouse
stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 900
mouse ear cups Kopf Instruments Model 921 Zygoma Ear Cups
mouse incisor bar Kopf Instruments Model 923B
mouse anaesthesia mask Kopf Instruments Model 923B
priming kit (containing 250ml syringe) Hamilton Co PRMKIT 81120
RN compression fitting kit (1 mm) Hamilton Co 55750-01
PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) Hamilton Co 55751-01
dual small hub RN Coupler Hamilton Co 55752-01
luer to small hub RN adaptor Hamilton Co 55753-01
1ml 25S syringe model 7001KH Hamilton Co 80100
*33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel Hamilton Co 7803-05
Scissors Fine Science Tools 14084-08
Scalpel Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blades Fine Science Tools 10035-20
Forcep Fine Science Tools 11608-15
Hemostats Fine Science Tools 13004-14
Isoflurane Abbott Laboratories 02241315 2-3%
Suters (Vicryl 4.0) Syneture SS-683
Steriliser Fine Science Tools 18000-45
Infusion Pump Harvard Apparatus PhD 22/2000
Needles (27G) BD Biosciences 305109
Needles (25G) BD Biosciences 305127
Syringes (1ml) BD Biosciences 309692
Anaesthesia trolley LEI medical M2000
Baytril CDMV, St. hyacinthe, QC 102207
Lidocaine CDMV, St. hyacinthe, QC 3914
Betadine solution CDMV, St. hyacinthe, QC 19955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
  2. Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
  3. Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
  4. Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
  5. Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
  6. Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
  7. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
  8. Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
  9. Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
  10. Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
  11. Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
  12. Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  13. Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
  14. Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
  15. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
  16. Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
  17. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  18. Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
  19. Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
  20. Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
  21. Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
  22. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  23. Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
  24. Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
  25. Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
  26. Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
  27. Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
  28. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
  29. Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
  30. Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
  31. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).

Tags

الطب، العدد 60، الماوس، 6-OHDA ومرض باركنسون، وسطي حزمة الدماغ المقدم، من جانب واحد
تطوير نموذج من جانب واحد lesioned الفأر 6 OHDA من مرض باركنسون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J.… More

Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (60), e3234, doi:10.3791/3234 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter