Summary
Een protocol voor het uitvoeren van unilaterale 6-OHDA letsels van de mediale voorhersenen bundel bij muizen wordt beschreven. Deze methode heeft een laag sterftecijfer (13,3%) met 89% van de overlevende dieren die> 95% verlies van striatale dopamine en 90,63 ± -4,02% ipsiversive rotatie voorkeur voor de kant van de laesie.
Abstract
Het eenzijdig gelaedeerde 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-gelaedeerde ratmodel van de ziekte van Parkinson (PD) heeft bewezen van onschatbare waarde te zijn in het bevorderen van ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan Parkinson symptomen, omdat het recapituleert de veranderingen in de basale ganglia circuits en farmacologie waargenomen in Parkinson patiënten 1-4. De precieze cellulaire en moleculaire veranderingen in cortico-striatale synapsen van de uitgang trajecten in het striatum, hetgeen de belangrijkste gebied van de invoer basispeesknopen blijven ongrijpbaar en dit wordt geacht plaats waar pathologische afwijkingen onderliggende parkinsonsymptomen ontstaan 3 zijn 5.
In PD, is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de basale ganglia circuits volgende degeneratie van de Nigro-striatale pad is sterk bevorderd door de ontwikkeling van bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) muizen over-expressie groene fluorescerende eiwitten gedreven door bevordering vanrs die specifiek zijn voor de twee striatale uitgang paden (directe route: eGFP-D1, indirecte route: eGFP-D2 en EGFP-A2a) 8, waardoor ze worden bestudeerd in een isolement. Zo hebben recente studies gesuggereerd dat er pathologische veranderingen in de synaptische plasticiteit in Parkinson muizen 9,10. Echter, deze studies gebruikt jonge muizen en acute modellen van parkinsonisme. Het is onduidelijk of de veranderingen beschreven in volwassen ratten met stabiele 6-OHDA laesies komen ook voor in deze modellen. Andere groepen hebben geprobeerd om een stabiele eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA volwassen muis model van PD genereren door lesionele de mediale voorhersenen bundel (MFB), jammer genoeg, het sterftecijfer in dit onderzoek was zeer hoog, met slechts 14% het overleven van de operatie voor 21 dagen of langer 11. Meer recente studies hebben gegenereerd binnen de nigrale laesies met zowel een laag sterftecijfer> 80% verlies van dopaminerge neuronen, maar de expressie van L-DOPA geïnduceerde dyskinesieën 11,12,13,14 was variabelin deze studies. Een ander goed ingeburgerd muismodel van de PD is het MPTP-gelaedeerde muis 15. Hoewel dit model nuttig is gebleken bij de beoordeling van de potentiële neuroprotectieve agenten 16, is hij minder geschikt voor het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de symptomen van PD, omdat dit model vaak niet in slaagt te induceren motorische stoornissen, en toont een grote variabiliteit in de omvang van de laesie 17, 18 .
Hier hebben een stabiele eenzijdige 6 OHDA-gelaedeerde muismodel PD door directe toediening van 6-OHDA de MFB, die consistent veroorzaakt> 95% verlies van dopamine (gemeten met HPLC) en produceren het gedrag onevenwichtigheden waargenomen in de goed gekarakteriseerde unilaterale 6-OHDA-gelaedeerde ratmodel van PD. Deze nieuw ontwikkelde muismodel van PD zal blijken een waardevol instrument in het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen generatie van Parkinson symptomen.
Protocol
1. Huisvesting en de voorbereiding van muizen
- Zorg voor een kolonie van bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) gereden transgene muizen 8 (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB in een 12:12 h licht-donker cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. Deze muizen zijn puur FVB muizen, en Het is niet noodzakelijk deze muizen kruisen met andere stam, hetzij de fokkerij, of om het succes van de 6-OHDA laesie procedure.
- Om een Parkinson-model te genereren, worden volwassen muizen de leeftijd van postnatale dag 31-42 (P31-42) die nodig is voor 6-OHDA-laesie en sham operaties.
- Om het risico op infectie te verkleinen, te beheren Baytril (antibioticum) in het drinkwater gedurende 24 uur voorafgaand aan de operatie.
2. Bereiding van geneesmiddelen voor chirurgie
Een premedicatie van desipramine en pargyline wordt meestal toegediend aan knaagdieren voor de injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) om de selectiviteit en eff te vergrotenicacy 6-OHDA geïnduceerde laesies. De noradrenaline / 5HT heropname remmer, desipramine daalt 6-OHDA-geïnduceerde noradrenaline en 5HT uitputting 22, terwijl de monoamine oxidase remmer, pargyline verhoogt de gevoeligheid van de dopaminerge terminals naar 6-OHDA, door het verminderen van extrasynaptic uitsplitsing van de 6-hydroxydopamine 31.
- De premedicatie (desipramine hydrochloride (HCl) en pargyline HCl) kunnen in grote hoeveelheden en bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Weeg de juiste hoeveelheid desipramine HCl aan elke muis te voorzien van 25 mg / kg voor het aantal dieren dat een operatie krijgt op die dag. Het lage gewicht van de muis maakt tegen nauwkeurig leveren kleine hoeveelheden, dus desipramine hydrochloride bereiden in een concentratie van 2,5 mg / ml en toegediend aan het dier op 10 ml / kg. Het gewicht van het zout van het samengestelde moet rekening worden gehouden zodanig dat de juiste concentratie wordt bereikt. Correctie voor het gewicht van deHCl zout in desipramine hydrochloride: molecuulgewicht (Mw) van desipramine HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW van vrije base: 266,38 Correctiefactor: 302,84 / 266,38 = 1.137 Voor 10 ml van de oplossing: = 2.5mg/ml desipramine x 10.0ml x Correctiefactor = 2.5mg/ml x 10.0ml x 1,137 = 28.43mg van desipramine hydrochloride
- Weeg de juiste hoeveelheid pargyline HCl aan elke muis voorzien van 5mg/kg voor het aantal dieren waarvoor een operatie die dag. Corrigeren voor het zout van het samengestelde zoals hierboven beschreven. Het lage gewicht van de muis maakt tegen nauwkeurig leveren kleine hoeveelheden, dus pargyline hydrochloride bereiden een concentratie van 0,5 mg / ml en toedienen aan het dier op 10 ml / kg.
Corrigeren het gewicht van het HCl-zout in pargyline hydrochloride:
MW van pargyline HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
MW van de vrije base: 159,23 Correctiefactor: 195,69 / 159,23 = 1.229
Voor 10 ml van de oplossing afgewogen: <br /> = 0,5 mg / ml pargyline x 10,0 ml x Correctiefactor
= 0,5 mg / ml x 10,0 ml x 1,229
= 6.15mg van pargyline hydrochloride - Combineer 28.43mg desipramine HCl en 6.15mg pargyline HCl in een 10 ml glazen maatcilinder, en voeg 8 ml steriele zoutoplossing (0,9%). Vortex en verhit tot 45 ° C tot het mengsel opgelost. De pH van de oplossing nu ongeveer 3, die indien toegediend aan de muizen ongemak en post-operatieve complicaties in urine en maagdarmkanaal functie veroorzaken. Voeg druppels NaOH (1 M) tot de pH 7,4. Vul het volume op 10 ml met een steriele zoutoplossing (0,9%) en vortex. Label, datum en invriezen bij ~ 80 ° C. Aangezien pargyline HCl niet oplosbaar is in zoutoplossing bij kamertemperatuur gedurende de chirurgische periode opslaan premedicatie mengsel in een waterbad op 37 ° C in de operatiekamer.
- Oplossingen van 6-OHDA moet direct voorafgaand aan operaties worden voorbereid. Het voertuig gebruikt om de 6-OHDA hydrobromide (6 te ontbinden-OHDA.Br) oplossing steriele zoutoplossing (0,9%) oplossing die ascorbinezuur (0,2%). Ascorbinezuur nodig om 6-OHDA.Br stabiliseren, aangezien zij de oxidatie van 6 OHDA.Br een inactieve vorm. Weeg 0,2 g ascorbinezuur, vervolgens aan een lege 1 L maatcilinder top tot 1 L met steriele zoutoplossing (0,9%) en roer. Label, datum, en op te slaan op ~ 80 ° C tot zij nodig zijn.
- Weeg de juiste hoeveelheid van 6-OHDA.HBr een 15,0 mg / ml oplossing voor elke muis voorzien van 3,0 microgram te maken. Sinds 6-OHDA.Br is licht en warmte gevoelig zijn blootstelling aan licht, en de plaats vóór te vermijden op het ijs te wegen.
Corrigeren het gewicht van de HBr zout in 6-OHDA.HBr:
MW van 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW van de vrije base: 170,19
Correctiefactor: 250,09 / 170,19 = 1,47
Voor 0,5 ml van de oplossing afgewogen:
= 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x Correctiefactor
= 15,0 mg / ml 6 OHDA x 0,5 x 1,47 ml
= 11.03 mg 6-OHDA.HBr - Voor de schijn-geopereerde dieren, vormen een equivalent volume van het voertuig (steriele zoutoplossing (0,9%), ascorbinezuur 0,02% pH 7,4) aan dat wat de 6-OHDA-gelaedeerde dieren zullen ontvangen, en in een 1,0 ml verpakt steriele buis in aluminiumfolie, label en plaats onmiddellijk op ijs tot gebruik.
3. Het instellen van de chirurgische apparatuur
Chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd met behulp van een autoclaaf voor to chirurgie. Tussen elke werking moet chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd in 95% ethanol gevolgd door verhitting tot 250 ° C gedurende 2 minuten. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de juiste Animal Care comites van de aangesloten instelling en het land.
- Reinig alle oppervlakken en apparatuur met isopropylalcohol voorafgaand aan het instellen van de apparatuur. Draag steriele handschoenen bij het hanteren van schone chirurgische apparatuur.
- Set-up een muis herstel kooi met papieren handdoeken op de basis. Plaats onder verhitting lamp of op een verwarmde pad.
- Stel de anesthesie trolley, ervoor te zorgen dat de zuurstof instroom is aangesloten en open, en de isofluraan reservoir volledig gevuld is. Stel de zuurstoftoevoer naar een L / min en de isofluraan met 2-4%. Idealiter er twee uitstroom poorten van de verdoving machine om de zuurstof isofluraan mengsel te leveren aan een inductie kamer en onderhoud terwijl het dier de stereotaxisch frame.
- Correct montage van de infusie apparatuur is van cruciaal belang voor het waarborgen van een succesvolle laesies, zoals ingesloten lucht of geblokkeerd naalden verlaagt het volume van 6-OHDA toegediend met de laesie site. Zet de infusie inrichting zoals in figuur 1. Draad een RN metalen moer op een zijde van de PEEK buis (RN compressie kit (aansluiting 1/16 inch)), gevolgd door de kop PEEK ferrule dan de canonieke PFA ferrule. Plaats de adereindhulzen zodat de kegel op de canonieke PFA ring zal glijden in de paring een deel van de PEEK-cup beentje. Plaats in de twee kleine hub RN koppeling (# 1), het waarborgen van de verbinding is strak. Aan de andere kant van de dubbele kleine naaf RN koppelaar invoegen 33 gauge injectienaald. Rijg de naald door een van de RN metalen moeren en draai ze vast. Zorg ervoor dat de 33 gauge naald in een 180 ° hoek ten opzichte van de dual kleine hub RN koppeling (# 1). Aan de andere kant van de buizen PEEK, draad een van de moeren RN metaal gevolgd door een ferrule PEEK, dan PFA ferrule. Plaats metalen moer eennd ferrule montage in een tweede dual kleine hub RN koppeling en draai de verbinding. Aan de andere kant van een tweede kleine dual RN hub koppeling (# 2) plaats de luer aan kleine hub RN adapter (luer adapter), en draai de verbinding.
- Vervolgens wordt de infusie apparaat moet worden gevuld (zie figuur 1). Vul de 250 ul en 1,0 pl Hamilton spuiten met steriel water, zodat er geen luchtbellen. Bevestig de 250 ul spuit met de luer adapter en druk de zuiger van de 250 ul spuit zodanig dat het water dat via de 33 meter injectienaald aan het andere uiteinde van de slang. Verder duwen water door het systeem toe tijdens het spuit 250 ul van de luer adapter, waardoor een water kraal over het uiteinde van de luer adapter. Druk de zuiger van de 1,0 ul spuit totdat er een kleine water kraal wordt uitgeworpen. Voorzichtig de 1.0 ul spuit in te voegen in de luer adapter, er zeker van zijn dat het water kraal op de 1,0 ul spuit verbindt met het water kraal aanwezig on de luer adapter, en volledig de 1,0 ul spuit in te voegen in de luer adapter. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen meer in de kleine dubbele RN hub koppeling.
- Nu het systeem wordt gebracht, kan de perfusie inrichting worden bevestigd aan de stereotaxisch frame infusiepomp. Klem de kleine dubbele RN naaf coupler met de 33 gauge injectienaald aan de manipulator arm van de stereotaxisch frame, dan klemt het 1,0 pi spuit de perfusie pomp, zodanig dat wanneer de perfusie pomp begint de spuit wordt gedrukt tegen de klem en kan niet bewegen. Programmeer de infusiepomp met een infusiesnelheid van 0,1 pl / min mogelijk te maken.
4. Eenzijdige 6-OHDA laesie chirurgie
- Dertig minuten voor operaties, wegen elk dier en registreer het gewicht. Systemische toedienen desipramine hydrochloride (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) en pargyline hydrochloride (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% steriele zoutoplossing, pH 7,4) bij 10 ml / kg door intraperitoneale injectie (ip) een muishet gebruik van een 27g naald bevestigd aan een 1 ml spuit. Bijvoorbeeld, een muis 30.0 g ontvangen 300 ul premedicatie. Verwarm de verwarmings-schijf en plaats deze onder het oor en de snijtand bar. De verwarming schijf zal de temperatuur van het dier houden tijdens chirurgie en het dier houden ideale hoogte van de oor en snijtanden staven van de stereotaxisch frame passen.
- Vijftien minuten na het toedienen van de desipramine HCl en pargyline HCl-oplossing, plaatst u de muis in een gesloten anesthesie kamer, en verdoven van het dier met behulp van isofluraan inhalatie (2-3% in O 2). Het dier is voldoende verdoofd als het vertoont geen antwoord op de achterpoot knijpen en niet knipperen reflex.
- Scheer de bovenkant van het hoofd van de muis, en breng de actuele pijnstiller lidocaïne direct op de huid met behulp van watten. Vijf minuten na lidocaïne toepassing, steriliseren van de kop van het dier met betadine oplossing.
- Plaats het dier in een stereotaxisch frame aangepast voor muizen. In de eerste plaats de dieren in de snijtand bars (snijtand bar instelling: -3,0 tot +2.0 mm) met de anesthesie masker geplaatst over het gezicht van het dier. Stel de zuurstoftoevoer naar een L / min en de isofluraan op 1,5-2%. De snij-balk moet op een niveau ten opzichte van de oorschelp, dat de top van de schedel niveau. Plaats de oorschelpen (diameter 5,0 mm). De oorschelpen zijn correct geplaatst wanneer het hoofd is volledig vlak, en kunnen niet worden verplaatst in beide richtingen.
- Knip langs de middellijn van de huid op de top van het hoofd van de muis met behulp van een scalpel, en trek de huid. Het oppervlakte van de schedel met gaas.
- Duw de zuiger van de 1,0 ul spuit en plaats de 33 gauge injectienaald in de 1 ml buis bedekt met aluminiumfolie met 6-OHDA oplossing (15 mg / ml). Langzaam terug te trekken op de zuiger van de 1,0 ul spuit terwijl de 33 gauge injectienaald ondergedompeld in de 6-OHDA oplossing (15 mg / ml).
- Maak een 1 cm incisie langs het midden van delijn van de schedel. Voortgang van de punt van de injectienaald richting bregma, doseren een kleine hoeveelheid 6-OHDA oplossing uit de 33 gauge injectienaald een kraaltje vormen. Langzaam zakken de injectienaald tip om bregma, wanneer de hiel raakt bregma stoppen met het bevorderen van de punt van de naald en noteer deze coördinaten. Trek de injectienaald 2 mm in de dorsale richting en bewegen langs de pijlnaad in een rostrale caudale richting naar lambda. Vooraf een kleine hoeveelheid 6-OHDA oplossing uit de 33 gauge injectienaald een kraaltje vormen. Langzaam zakken de injectienaald tip om Lambda, toen de kraal contacten Lambda stoppen met het bevorderen van de punt van de naald en noteer deze coördinaten. De mediale laterale (ML), en de dorsale ventrale (DV) coördinaten moeten voor bregma en Lambda, als ze niet, pas de snijtand lat voor de AP-coördinaten, en het oor bars voor de ML coördinaten. Verplaats de naald coördineert AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm ten opzichte van Bregma volgens de hersenen van muizen Atlas in stereotaxische Coördinaten 25. Trek de naald en braam een gat in de schedel met een 25 gauge naald.
- Zet de injectienaald op de bovenstaande coördinaten, en steek de naald naar DV:-5mm. Infundeer 0,2 pi 6 OHDA of voertuig eenzijdig in het middenlangsvlak voorhersenen bundel met een snelheid van 0,1 pl / min (3 ug totaal). Na voltooiing van de toediening van 6-OHDA of voertuig, laat de naald op zijn plaats voor nog eens vijf minuten om diffusie toe uit de buurt van de injectieplaats.
- Langzaam trekken de naald.
- Sluit de incisie op de hoofdhuid met drie hechtingen, en subcutaan te leveren 1 ml Ringer's lactaat (sc).
- Haal het dier uit stereotaxisch frame, en in de stabiele zijligging kooi tot het bewustzijn is hersteld.
5. Post-operatieve zorg van 6-OHDA-gelaedeerde dieren
- Plaats dieren in kooien (3 muizen / kooi) en laat gratis toegang tot voedsel en sugared water (10 mM). Zorg voor Nutra-gel en KMR (kitten melk vervanging) in voedsel containers op de vloer van de kooi aan eetlust en gastro-intestinale motiliteit te stimuleren.
- Inspecteer de muizen dagelijks na de operatie gedurende 2 weken 24. Bij elke inspectie bijzondere aandacht moet worden besteed aan de alertheid van het dier door de beoordeling van het vermogen van het dier te bewegen rond de kooi. Voedsel-en wateropname van de laatste observatie periode, alsook de aanwezigheid en de consistentie van de ontlasting moet ook in acht worden genomen. Een veel voorkomende post-operatieve complicatie is dehydratie is dit duidelijk door langzaam terugtrekken van de huid na huid knijpen. Als dit zich voordoet te leveren 1 ml Ringer's lactaat sc voor 1 week of totdat de symptomen te verbeteren. Bij mannelijke dieren kan geslachtsorganen zorgvuldig geobserveerd penis verzakking geïdentificeerd door roodheid van de penis. Als dit gebeurt toepassing mucol gel op de penis van de betreffende dier, en leveren 1 ml lactaat Ringer's oplossing v 1 weekof te verbeteren totdat de symptomen.
- Weeg de dieren dagelijks aan veranderingen in lichaamsgewicht te controleren.
- In het geval dat de injectie ip een scheurtje in het maagdarmkanaal veroorzaakt kan abdominale infecties tot gevolg. Daarom beoordelen voor de prsence van infectie van de buik, duidelijk door gezwollen opgezwollen buik. Behandel door toediening van Baytril in het drining water gedurende 3-4 dagen of totdat de symptomen te verbeteren.
6. Parkinson beoordeling
Om de mate van het letsel schatten werd gedrag heeft uitgevoerd 14-21 dagen na 6 OHDA-letsel chirurgie, wanneer de hoeveelheid dopamine maximaal is en stabiel 26.
- Na ip injectie van 0,01 ml / g 0,9% steriele zoutoplossing, plaats muizen in glazen cilinders (11 cm x 9,5 cm) en neem hun activiteit met behulp van een videocamera (CG9, Sanyo).
- Kijken naar de video, tel het aantal volledige 360 ° omwentelingen in zowel de ipsiversive en contraversive richting ten opzichte van de laesie.
- Hoe groter de voorkeur voor ipsiversive omwentelingen, des te meer van Parkinson het dier, zo berekent het aandeel van ipsiversive rotaties als een percentage van de netto (contraversive en ipsiversive) rotatie-gedrag.
7. Bepaling van dopamine gehalte HPLC
- Ten minste 21 dagen na de 6-OHDA laesie chirurgie, en na voltooiing van de gedrags-studies, offeren de muizen door de over-dosis van de anesthesie, en verwijder voorzichtig de hersenen. Behouden een snede striatum (230 urn) van elke halve bol elke muis, en onmiddellijk invriezen breken na snijden en bewaren bij -80 ° C tot bereiding van striatale monsters.
- De HPLC monster buffer (0,1 M PCA met 2 mM glutathion) voorkomt de dopamine uit het striatum monsters van breken.
Voor 100 ml monster buffer:
= 100 ml HPLC-kwaliteit H2O
= 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
= 61,5 mg glutathion (gereduceerd)
Meet de HPLC-kwaliteit H 2 O, voeg de PCA, ontbinding van de glutathion in de oplossing, meng goed en filter. Het monster buffer kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 maand. - Ontdooien striatale plakjes op ijs, dan homogeniseren in 200 pi monster buffer met een ultrasone cel disrupter (Fisher Sonic, USA). Bewaar monsters op ijs te allen tijde en homogeniseren elk monster drie keer 10 seconden elke ervoor te zorgen dat de monsters laten afkoelen tussen de homogenisering periodes.
- Gereserveerd 20 ul van elke gehomogeniseerde monster (bewaren bij -80 ° C) voor een eiwit assay.
- Centrifugeer de monsters (20.800 xg, 20 min (4 ° C, Eppendorf 58 - 04R, USA)), schenk de bovenstaande vloeistof en filtreer door een 0,2 um PVDF membraan (Pall, Cat #: 1935-28143-310) en vries in -80 ° C tot HPLC analyse. Bewaar het eiwit pellet als back-up voor het eiwit assay.
- Voorbereiding van de mobiele fase voor HPLC naar thr draaiendoorgedreven de HPLC-kolom.
Voor een L van de mobiele fase:
60 mM NaH 2 PO 4. H 2 O (monobasisch) = 8,27 g
30 mM citroenzuur = 5,7 g
0,13 mm Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) dinatriumzout uitdrogen = 48 mg
0,16 mM natrium dodecylsulfaat (SDS) = 45 mg
850 ml HPLC-kwaliteit water (Caledon, Cat #: 8801 tot 7)
15% v / v acetonitril-190 (pH 3,35) = 150 ml HPLC-kwaliteit (Caledon, Cat #: 1,401-7)
~ 2 pi 10 M NaOH (HPLC-kwaliteit in H2O)
Alle reagentia moeten ≥ 99,0% zuiver en van HPLC-kwaliteit waar mogelijk. Het water en acetonitril moet HPLC-kwaliteit zijn. Mobiele fase moet worden gebruikt binnen een week van voorbereiding. Heb gewijd, schoon glaswerk en roer bars, uitsluitend voor de bereiding van de mobiele fase (een 1 L glas maatcilinder en ten minste 2 1 L glazen kolven). Alvorens de mobiele fase zijn twee schone 1 L kolven bereid, een om de oplossing te maken en een overdragen die tijdens filtratie degassing. Laat de mobiele fase om 's nachts circuleren door de HPLC en dat de baseline is eerder plat gebruiken om te controleren. - Meet 700 ml water van HPLC-kwaliteit in een glazen maatcilinder en los de NaH 2 PO 4. H2O, citroenzuur, EDTA en SDS in. Vul het water tot 850 ml.
- Breng de pH op 3,35 met 10 M NaOH, voeg dan de acetonitril en meng de oplossing om met een teflon bekleed roerstaafje.
- Plaats een roervlo in de tweede schone, lege 1 liter kolf en vacuüm filteren van de mobiele fase in het door een 0,22 pm HVLP Millipore filter: (Cat #: SLGP033RS). Bevochtig het filter in 85:15 H 2 O / ACN voor filtratie. Zodra de mobiele volledig gefiltreerd, de mobiele fase ontgas door roeren onder vacuüm ten minste 10 minuten.
- Bereid de normen waaraan de dopamine concentratie van de striatale monsters worden gemeten. Normen worden uitgevoerd door de HPLC aan het begin en einde van elke partij van striatale monsters. A 1mg / ml voorraadoplossing van dopamine kan worden vooraf opgeslagen in 20 pi fracties bij -80 ° C. Ter voorbereiding op de stockoplossing 5 mg dopamine oplossen in 5 ml monster buffer (zie hierboven) en goed mengen. Begin bereiden normen door 5 pi van 1 mg / ml voorraadoplossing, het toevoegen van 2,5 ml monsterbuffer en mengen grondig een 2 ug / ml dopamine oplossing.
- Vier normen worden uitgevoerd door middel van de HPLC tot een concentratie curve te produceren. Voor dopamine de concentraties: 100 ng / ml, 50 ng / ml 25 ng / ml, en 12,5 ng / ml. Om genereren deze vier concentraties dopamine te 10 ul van de 2 ug / ml dopamine bereid in 7.10). en voeg deze toe tot 190 ul van het monster buffer om je een 100 ng / ml dopamine oplossing. , Bij deze uitvoeren van een 1:01 verdunning van 100 ng / ml dopamine oplossing monsterbuffer. Neem eenvoudig 100 pi van 100 ng / ml dopamine en voeg 100 ßl monster buffer mengsel 50 ng / ml dopamine produceren, dan 100pi van 50 ng / ml dopamine en voeg 100 ßl monster buffer mengsel 25 ng / ml dopamine enzovoort produceren.
- Om de HPLC-systeem (Waters 1525μ Binary pomp 717plus autosampler, symmetrie C-18 reverse-phase kolom (15 cm x 4,6 mm ID, 5 pm deeltjesgrootte) (30 ° C), elektrochemische detector (ESA Coulochem III) voorzien bereiden met een dubbele elektrode analytische cel (ESA 5011A) en wordt gecontroleerd door Breeze software (Waters)) eerste zuivering van het systeem met mobiele fase door het selecteren van de purge-protocol in de computer-software of door het volgen van instructies van de fabrikant. Deze uitwisseling alle vorige oplossing in de HPLC met verse mobiele fase.
- Stel de elektrochemische potentialen 400 mV en -300 mV voor de eerste en tweede elektroden respectievelijk. Vervolgens evenwicht het systeem draaien ten minste 2 uren en bij voorkeur een nacht met de mobiele fase bij een stroomsnelheid van 1 ml / min. Tijdens evenwicht van de cellen moet worden ingeschakeld en de basislijn reAding gecontroleerd, wanneer de waarde stabiel wordt het systeem gereed is voor gebruik. Voor het eerste uur van evenwicht laat de mobiele fase, die uit het systeem gaan in een waster container, het volgen van deze kunt u toestaan dat de mobiele fase om door de HPLC-systeem circuleren door de invoering van de afvoerslang in de mobiele fase kolf.
- Ontdooien striatale monsters op ijs, dan injecteren 20 ul van elke dopamine standaard gevolgd door 2 x 20 pi van elk monster en een verdere 20 pl van elke dopamine standaard in het evenwicht HPLC met de mobiele fase debiet van 1 ml / min.
- Gebruik HPLC systeemsoftware het gebied van de dopamine pieken door de standaarden en te analyseren. Vergelijking van de oppervlakte van de dopamine pieken in het striatum monsters standaard dopamine curve identificeert de hoeveelheid dopamine aanwezig in 20 pl van elke striatale monster. Schaal dit cijfer tot en met de totale dopamine aanwezig is in de hele striatale slice te vinden.
- Perform een standaard proteïne test op de 20 ul van striatale homogenaat dat u gereserveerd in 7.4). Dit zal de hoeveelheid eiwit in de striatale monsters mg / ml. Uit deze berekening van de hoeveelheid dopamine in het striatum monsters als een waarde in ng / mg zodat u dopamine concentraties van hersenhelften en tussen de muizen te vergelijken.
8. Representatieve resultaten
Vijftien bij eenentwintig dagen na 6 OHDA-letsel chirurgie, wanneer de hoeveelheid van celdood door het neurotoxine is completion26 bereikt, meting van spontane 360 ° rotatie na toediening van een zoutoplossing (ip) 28 kan worden gebruikt om het succes van 6 beoordelen -OHDA-gelaedeerde (figuur 2). Deze methode van gedrags-assessment is eenvoudig en snel, en voorkomt mogelijke priming effecten, veroorzaakt door dopaminerge middelen zoals amfetamine of apomorfine uitdagingen. Bovendien, spontane rotatie beoordeling is een betere predictor van dieren met <95% dopamine uitputting in vergelijking met voorbeen poot plaatsingstoets 27. Door correleren striatale dopamine niveaus van striatale monsters (opgesteld na afloop van gedrags-studies met behulp van HPLC) met een percentage van de spontane ipsiversive rotaties in elk dier, hebben we ontdekt dat dieren die 70% of meer ipsiversive rotaties naar de 6-OHDA letsel vertonen hebben verloren> 95% dopamine (figuur 3) 27. Na de gedeeltelijke 6-OHDA-geïnduceerde laesies (59,44 ± 17,20) (figuur 3) van de mediale voorhersenen bundel, was er geen rotatie-afwijking tussen ipsiversive versus contraversive kanten bij het meten van spontane rotaties (40.91 ± 8.01) (Figuur 2). Dus, zoals is gevonden na 6 OHDA toediening aan de MFB bij ratten, is het mogelijk te veroorzaken een groot verlies van dopaminerge Nigro-striatale neuronen en zoutoplossing toediening (ip) is een nauwkeurige methode voor het screenen van de mate van 6-OHDA laesie in deze dieren.
Figuur 1. Schematische weergave de montage van de injectienaald apparaat te tonen voor 6-OHDA-laesie operaties.
Figuur 2. Beoordeling van rotatie-gedrag in schijn-geopereerde en 6-OHDA gelaedeerde muizen. Spontane rotaties in de schijn-geopereerde en 6-OHDA-gelaedeerde muizen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde percentage ipsiversive rotaties ± SEM, waar de netto contraversive en ipsiversive rotaties zijn 100%. Open bars: schijn-geopereerde dieren; Grey bars: 6-OHDA-gelaedeerde dieren met> 95% dopamine verlies; Zwarte balken: dieren die 6-OHDA-laesie operatie die gedeeltelijk werden gelaedeerde heeft ondergaan. *** P <0,001 vs schijn-geopereerde dieren. One-way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkende test Dunn's (en ham-bediende: n = 17; 6-OHDA-gelaedeerde (> 95%): n = 23; gedeeltelijke 6-OHDA-laesie: n = 3).
Figuur 3. Beoordeling van striatale dopamine niveaus in schijn-geopereerde en 6-OHDA gelaedeerde muizen met behulp van HPLC. Striatale dopamine-gehalte werd bepaald in de geopereerde en niet geopereerde halfrond van schijn en 6-OHDA-gelaedeerde dieren. De gegevens worden als gemiddelde ± SEM van percentages dopamine niveaus in de ongeopereerde striatum. Open bars: schijn-geopereerde dieren; Grey bars: 6-OHDA-gelaedeerde dieren met> 95% dopamine verlies; Zwarte balken: dieren die 6-OHDA-laesie operatie die gedeeltelijk werden gelaedeerde heeft ondergaan. *** P <0,001 ** P <0,01 vergeleken met schijn-geopereerde dieren. One-way ANOVA gevolgd door meerdere vergelijkende test Dunn's (schijn-geopereerde: n = 17, 6-OHDA-gelaedeerde (> 95%): n = 23, gedeeltelijke 6-OHDA-laesie: n = 3).
EAK ">
Figuur 4. Beoordeling van tyrosine hydroxylase immunoreactiviteit in de SNC in de schijn-geopereerde en 6-OHDA gelaedeerde muizen. Als een marker van dopamine cel verlies in de substantia nigra pars compacta (SNC), verlies van tyrosine hydroxylase (TH) positieve immunohistochemisty in de geopereerde en niet geopereerde halfrond van schijn en 6-OHDA-gelaedeerde dieren werd bepaald zoals beschreven in Thiele et al.. In Press. De gegevens worden als gemiddelde ± SEM van percentages TH positieve cellen in de ongeopereerde striatum. Open bars: schijn-geopereerde dieren; Grey bars: 6-OHDA-gelaedeerde dieren met> 95% dopamine verlies; Zwarte balken: dieren die 6-OHDA-laesie operatie die gedeeltelijk werden gelaedeerde heeft ondergaan. *** P <0,001 ** P <0,01 vergeleken met schijn-geopereerde dieren. One-way ANOVA gevolgd door meerdere bedrijven Dunn'sRison test (schijn-geopereerde: n = 17, 6-OHDA-gelaedeerde (> 95%): n = 23, gedeeltelijke 6-OHDA-laesie: n = 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een methode beschreven voor het genereren van een stabiele eenzijdige 6 OHDA-gelaedeerde muismodel van de ziekte van Parkinson, die zeer reproduceerbaar, met een hoge laesie succes en een laag sterftecijfer. Het succes van de 6-OHDA laesie operatie kan gemakkelijk worden geschat door het meten van de spontane rotatie-gedrag met> 70% ipsiversive rotaties indicatie van> 95% dopamine depletie in de gelaedeerde striatum 27. Kwantificering van striatale dopamine is het meest nauwkeurige meting van de omvang van de striatale dopamine uitputting in vergelijking met quantificiation van het aantal TH-positieve cellen in de substantia nigra pars compacta, omdat het een directe meting van striatale dopamine niveau 28. Gezien het feit dat dit protocol de plaats van injectie (MFB) en de lengte van laesie ontwikkeling (21 dagen) van de goed gekarakteriseerde unilaterale 6-OHDA-gelaedeerde ratmodel van de ziekte van Parkinson 1,4 reproduceert, kan ervan worden uitgegaan eOp dit muismodel, zoals bij de rat model, recapituleert de veranderingen in de farmacologie en de hersenen circuits gezien bij patiënten met de ziekte van Parkinson. Zo biedt deze methode een middel om het genereren van een symptomatische model van de ziekte van Parkinson in transgene muizen. Gezien het feit dat transgene muizen zijn zeer krachtige tools voor zodat we de rol van moleculen en eiwitten te begrijpen in vivo op moleculair, tot de cellulaire en hele weefsel niveau, een combinatie van deze twee technieken zal zeer nuttig blijken in de verdere afbakening van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen generatie van symptomen van de ziekte van Parkinson.
Cenci heeft eerder een soortgelijke methode beschreven voor het genereren van een unilaterale 6-OHDA-gelaedeerde de muis van de ziekte van Parkinson, echter, werd dit geassocieerd met een hoog sterftecijfer, met slechts 14% van de dieren die meer dan 21 dagen na de operatie na de injectie van 6 - OHDA in de MFB 11. Er zijn verschillende poss baar verklaringen voor het ontbreken van de mortaliteit in het protocol beschreven hier. Ten eerste, de stereotaxische coördinaten gekozen in dit protocol kan de injectienaald volledig te voorkomen dat de hypothalamus. Aangezien de muis hypothalamus is zo klein is, kan schade aan deze structuur van invloed op de eten en drinken centra van de muis, waardoor het dier om gewicht te verliezen en uitdrogen en uiteindelijk sterven. In de tweede plaats protocol beschreven, dezelfde concentratie van 6-OHDA (3 mg) werd gebruikt als in de studie van Lundblad en collega 11 echter werd toegediend in een kleiner volume (0,2 ml dan 1 ml) met een infusiesnelheid rate (0.1ml/min tegenover 0.5ml/min). De kleinere volume en de langzamere infusiesnelheid te garanderen minimale schade aan de structuren rond de MFB. Tenslotte diameter van de injectienaald is aanzienlijk kleiner (0,33 vs 50 mm), die schade te beperken hersenstructuur de naald reist ventraal door de hersenen.
NHOUD "> Cenci ook beschreven een werkwijze voor het eenzijdig 6 OHDA laesies met 6 OHDA wordt geïnjecteerd in het striatum 11. Zoals beschreven na striatale injectie van 6-OHDA bij ratten, resulteert dit in een lager dopamine verlies, dat is meer variabel tussen de muizen.Een laatste feit dat moet worden gehouden is het mogelijke effect van stam van muizen. Het is goed gedocumenteerd de stam heeft een dramatisch effect op het succes van dopamine uitputting na systemische toediening van MPTP, die ook veroorzaakt selectieve celdood van de dopaminerge Nigro-striatale route 29. Een dergelijk verschil tussen soorten lijkt niet voor bij ratten na 6 OHDA toediening is het mogelijk dat het kan een factor voor het succes van 6-OHDA laesie in muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Handel (regering van Canada), University of Toronto Connaught Fonds, de Canadese Stichting voor Innovatie, NSERC, de Krembil Foundation en de Cure Parkinson's Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desipramine HCl | Sigma-Aldrich | D125 | 25mg/kg |
| pargyline HCl | Sigma-Aldrich | P8013 | 5mg/kg |
| 6-OHDA HBr | Sigma-Aldrich | H116 | 3mg / mouse |
| stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| mouse ear cups | Kopf Instruments | Model 921 Zygoma Ear Cups | |
| mouse incisor bar | Kopf Instruments | Model 923B | |
| mouse anaesthesia mask | Kopf Instruments | Model 923B | |
| priming kit (containing 250ml syringe) | Hamilton Co | PRMKIT 81120 | |
| RN compression fitting kit (1 mm) | Hamilton Co | 55750-01 | |
| PEEK tubing from RN compression fitting kit< (1/16th inch) | Hamilton Co | 55751-01 | |
| dual small hub RN Coupler | Hamilton Co | 55752-01 | |
| luer to small hub RN adaptor | Hamilton Co | 55753-01 | |
| 1ml 25S syringe model 7001KH | Hamilton Co | 80100 | |
| *33G removable needle (RN) pack of 6. . Custom 1 inch with 45<° bevel | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10035-20 | |
| Forcep | Fine Science Tools | 11608-15 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 02241315 | 2-3% |
| Suters (Vicryl 4.0) | Syneture | SS-683 | |
| Steriliser | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | PhD 22/2000 | |
| Needles (27G) | BD Biosciences | 305109 | |
| Needles (25G) | BD Biosciences | 305127 | |
| Syringes (1ml) | BD Biosciences | 309692 | |
| Anaesthesia trolley | LEI medical | M2000 | |
| Baytril | CDMV, St. hyacinthe, QC | 102207 | |
| Lidocaine | CDMV, St. hyacinthe, QC | 3914 | |
| Betadine solution | CDMV, St. hyacinthe, QC | 19955 |
References
- Costall, B., Naylor, R. J., Pycock, C. Non-specific supersensitivity of striatal dopamine receptors after 6-hydroxydopamine lesion of the nigrostriatal pathway. Eur. J. Pharmacol. 35, 276-283 (1976).
- Maneuf, Y. P., Mitchell, I. J., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. On the role of enkephalin cotransmission in the GABAergic striatal efferents to the globus pallidus. Exp. Neurol. 125, 65-71 (1994).
- Robertson, G. S., Robertson, H. A. Evidence that L-dopa-induced rotational behavior is dependent on both striatal and nigral mechanisms. J. Neurosci. 9, 3326-3331 (1989).
- Ungerstedt, U., Arbuthnott, G. W. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. 24, 485-493 (1970).
- Brotchie, J. M. Novel approaches to the symptomatic treatment of parkinsonian syndromes: alternatives and adjuncts to dopamine-replacement. Curr. Opin. Neurol. 10, 340-345 (1997).
- Besson, M. J., Graybiel, A. M., Nastuk, M. A. [3H]SCH 23390 binding to D1 dopamine receptors in the basal ganglia of the cat and primate: delineation of striosomal compartments and pallidal and nigral subdivisions. Neuroscience. 26, 101-119 (1988).
- Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons. Science. 250, 1429-1432 (1990).
- Schiffmann, S. N., Jacobs, O., Vanderhaeghen, J. J. Striatal restricted adenosine A2 receptor (RDC8) is expressed by enkephalin but not by substance P neurons: an in situ hybridization histochemistry study. J. Neurochem. 57, 1062-1067 (1991).
- Hutchison, W. D. Differential neuronal activity in segments of globus pallidus in Parkinson's disease patients. Neuroreport. 5, 1533-1537 (1994).
- Pan, H. S., Penney, J. B., Young, A. B. Gamma-aminobutyric acid and benzodiazepine receptor changes induced by unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the medial forebrain bundle. J. Neurochem. 45, 1396-1404 (1985).
- Pan, H. S., Walters, J. R. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway decreases the firing rate and alters the firing pattern of globus pallidus neurons in the rat. Synapse. 2, 650-656 (1988).
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Kreitzer, A. C., Malenka, R. C. Endocannabinoid-mediated rescue of striatal LTD and motor deficits in Parkinson's disease models. Nature. 445, 643-647 (2007).
- Shen, W., Flajolet, M., Greengard, P., Surmeier, D. J. Dichotomous dopaminergic control of striatal synaptic plasticity. Science. 321, 848-851 (2008).
- Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiol. Dis. 16, 110-123 (2004).
- Grealish, S., Mattsson, B., Draxler, P., Bjorklund, A. Characterisation of behavioural and neurodegenerative changes induced by intranigral 6-hydroxydopamine lesions in a mouse model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci. 31, 2266-2278 (2010).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Francardo, V. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to L-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 42, 327-340 (2011).
- Jakowec, M. W., Petzinger, G. M. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned model of parkinson's disease, with emphasis on mice and nonhuman primates. Comp. Med. 54, 497-513 (2004).
- Visanji, N. P., Brotchie, J. M. MPTP-Induced Models of Parkinson's Disease in Mice and Non-Human Primates. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter 5, 42-42 (2005).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav. Brain Res. 125, 109-125 (2001).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Paul, M. L., Currie, R. W., Robertson, H. A. Priming of a D1 dopamine receptor behavioural response is dissociated from striatal immediate-early gene activity. Neuroscience. 66, 347-359 (1995).
- Breese, G. R., Traylor, T. D. Effect of 6-hydroxydopamine on brain norepinephrine and dopamine evidence for selective degeneration of catecholamine neurons. J. Pharmacol Exp. Ther. 174, 413-420 (1970).
- Breese, G. R., Chase, T. N., Kopin, I. J. Metabolism of tyramine-3H and octopamine-3H by rat brain. Biochem. Pharmacol. 18, 863-869 (1969).
- Frankin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Cornell-Bell, A. H., Finkbeiner, S. M., Cooper, M. S., Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signaling. Science. 247, 470-473 (1990).
- Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav. Brain Res. 162, 1-10 (2005).
- Tan, Y., Williams, E. A., Lancia, A. J., Zahm, D. S. On the altered expression of tyrosine hydroxylase and calbindin-D 28kD immunoreactivities and viability of neurons in the ventral tegmental area of Tsai following injections of 6-hydroxydopamine in the medial forebrain bundle in the rat. Brain Res. 869, 56-68 (2000).
- Thiele, S. L. Generation of a model of L-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. J. Neurosci. Methods. 197, 193-208 (2011).
- Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of a rodent model in which to investigate the molecular and cellular mechanisms underlying the pathophysiology of L-dopa-induced dyskinesia. Adv. Neurol. 78, 53-61 (1998).
