Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل 'Peroxidative' و 'مؤكسد' Footprinting الهيدروكسيل

Published: October 17, 2011 doi: 10.3791/3244
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2
1Department of Chemistry, Hunter College, 2Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول توضح كيفية قياس المغنيسيوم (II) التي تعتمد على تشكيل بنية الحمض النووي الريبي العالي من قبل اثنين من أساليب footprinting الهيدروكسيل.

Abstract

جزيئات الحمض النووي الريبي تلعب دورا أساسيا في علم الأحياء. بالإضافة إلى نقل المعلومات الوراثية ، يمكن أن الحمض النووي الريبي أضعاف في هياكل التعليم العالي دورا فريدا الوفاء بيولوجية محددة على النحو الموثق ، منظم أو المحفز. معلومات حول تكوين الاتصال العالي ضروري لفهم وظيفة من جزيئات الحمض النووي الريبي. جذور الهيدروكسيل (OH •) هي تحقيقات فريد هيكل الأحماض النووية بسبب التفاعلات عالية وحجم صغير. 1 عندما تستخدم على النحو التحقيق footprinting ، جذور الهيدروكسيل خريطة سطح المذيب يمكن الوصول إليها في العمود الفقري phosphodiester من الحمض النووي الريبي (1) و2 مع غرامة مثل القرار النوكليوتيدات واحد. ويمكن استخدام footprinting الهيدروكسيل لتحديد النيوكليوتيدات داخل سطح التماس بين الجزيئات ، مثل الحمض النووي في البروتين (1) والجيش الملكي النيبالي المجمعات البروتين. ويمكن تحديد التوازن 3 و 4 التحولات الحركية من خلال إجراء footprinting الهيدروكسيل كدالة لsolutiعلى المتغير أو الوقت ، على التوالي. ومن السمات الرئيسية لfootprinting هو أن تقتصر على التعرض لجنة التحقيق (على سبيل المثال ، "واحد من الزلزال حركية') في نتائج موحدة لأخذ العينات من كل من البوليمر النوكليوتيدات 5

في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نستخدم المجال P4 - P6 من ribozyme رباعية لتوضيح RNA إعداد وتصميم عينة من الأيسوثرم (II) بوساطة المغنيسيوم للطي. نحن تصف استخدام معروفة الهيدروكسيل بروتوكول footprinting جذرية تتطلب H 2 O 2 (نحن نسمي هذا "peroxidative' البروتوكول) ، وقيمة ، ولكن ليس معروفا على نطاق واسع ، وهذا البديل يا المنحل يستخدم بشكل طبيعي 2 (نحن نسمي هذا "لل التأكسدي 'البروتوكول). ويقدم لمحة عامة عن تقليص البيانات وتحويلها وإجراءات التحليل.

Protocol

1. إعداد الكواشف Footprinting

  1. يعد رد فعل 10X العازلة التي تحتوي على 100 ملي كاكوديلات الصوديوم ، EDTA 1 مم ، و 1 بوكل M. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تصفية العازلة باستخدام خلات 0.2 ميكرومتر جهاز تصفية (Nalgene). ملاحظة : لا RNA الماصة مباشرة في المخزن 10X.
  2. تحضير مزيج تفاعل المعايرة لكل رد فعل على النحو المبين في الجدول 1. وينبغي أن حجم المزيج المعايرة (1X العازلة والمغنيسيوم (II) في التركيز المطلوب) أن 90 ميكرولتر ، قبل ان يضيف 10μl من الحمض النووي الريبي في المخزن 1X.
  3. إعداد الهضم T1 ريبونوكلياز العازلة التي تحتوي على اليوريا 6.63M ، 20mM سيترات الصوديوم ، EDTA 1MM ، 0.25 ميكروغرام / الحمض الريبي النووي النقال ميكرولتر ، 0.025 ٪ cyanol الزيلين ، والأزرق برومفينول 0.025 ٪. ويمكن تخزين هذه العازلة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. يتطلب رد فعل فنتون المحاليل المائية الطازجة من الحديد 250 ملم (NH 4) 2 (SO 4) 2 ، 250 ملم EDTA ، و 500 ملي L - الصوديوم أسكوربات. لاحظ التركيزات في الفصل 10.5 هي الأمثل للتجارب التوازن في العازلة مثل كاكوديلات الصوديوم التي لا كنس الجذور ومتنوعة تركيز أيون ثنائي التكافؤ.
  5. كواشف للتفاعل peroxidative (1.5.1) ، والأكسدة footprinting (1.5.2).
    1. رد فعل فنتون peroxidative تتطلب حلولا المائية الطازجة من 100 حل الحديد EDTA ملم ، و 50 ملي لتر أسكوربات الصوديوم ، و 1.5 ٪ H 2 O 2. يتم تحضير محلول EDTA الحديد عن طريق خلط الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 مع EDTA قد تتجاوز 1.1 مرة أكثر من EDTA الحديد.
    2. قبل الشروع في رد فعل الانقسام الأكسدة (3.4.2) ، وخلق مزيج تفاعل فينتون من خلال الجمع بين 2 ميكرولتر من الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 ملم) ، 2.2 ميكرولتر من EDTA (250 ملم) ، 62.5 ميكرولتر L - أسكوربات الصوديوم (500 ملم) ، و 22.5 ميكرولتر العازلة رد فعل 10x و135.5 ميكرولتر من H 2 O للوصول الى النهائي في تركيزات footprinting خليط التفاعل (3.4.2) 0.10 مم ، 0.11 ، 6.61 ملم و، على التوالي.

2. RNA التحضير لتجربة Footprinting

  1. يمكن أن تنتج عن طريق الحمض النووي الريبي القياسي في نسخ الحمض النووي في المختبر من القوالب 6 أو ، إذا كان أقصر من 50 النيوكليوتيدات ، يمكن شراؤها (على سبيل المثال في تكنولوجيا الحمض النووي المتكاملة ، www.idtdna.com). اتبع الإجراءات الموصى نظافة المختبر للحفاظ على سلامة عينة من الحمض النووي الريبي خلال التجارب footprinting 7
  2. نزع الفسفات 8 من الحمض النووي الريبي كتب في المختبر من الضروري قبل وضع العلامات ف 32 من نهاية 5 'من الحمض النووي الريبي. 10 بمول من الحمض النووي الريبي وصفت من قبل نهاية kinasing 9 الحل ينبغي أن يكون غائما بعد التعطيل الناجح للالفوسفاتيز.
  3. تنقية المسمى بالإشعاع باستخدام الحمض النووي الريبي تغيير طبيعة هلام إستشراد. واستعاد الجيش الملكي النيبالي من قبل اثنين من قلع هلام اللاحقة باستخدام خلات الصوديوم 0.3 م (الرقم الهيدروجيني 5.5). وعجلت RNA عن طريق خلط 0.5 مل محلول مائي مع 1 مل من الإيثانول واللاحقةالحضانة لمدة 1 دقيقة على الثلج الجاف. تدور العينة في 4 درجات مئوية ، 12500 دورة في الدقيقة ل0.5 ساعة. تجاهل طاف بيليه وغسل RNA مع الايثانول 70 ٪. إزالة طاف بعد الطرد المركزي الاضافية والجافة بيليه في فراغ.
  4. حل 32 ف عينات الحمض النووي الريبي المسمى في 330 من المجاهدين 1X 30 ميكرولتر Buffer.Pipet من الحل RNA في أنبوب التفاعل ، ويعجل مع الإيثانول والحمض النووي الريبي الجافة في فراغ ، الحفاظ على هذا الأنبوب لتوليد إشارة سلم (الخطوة 3.5). تفسد الحل عن طريق تسخين الحمض النووي الريبي مخزنة في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تبريد عينات لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإعطاء تدور سريعة لاسقاط المكثفات على أغطية من الأنابيب مرة أخرى إلى الحل.

3. في تجربة Footprinting

  1. المشط الكهربائي يحدد الحد الأقصى لعدد نقاط البيانات في هلام التحليلية. نستخدم مشط 30 أيضا. تحتل سلم مرجع 2 الآبار واحد للرقابة على uncleaved. إعداد رد فعل أنابيب 27. والمغنيسيوم النهائي (الثاني) concentratiوينبغي إضافات متباعدة بشكل متساو على مقياس لوغاريتمي الممتدة من حيث الحجم في جميع أنحاء منتصف المعايرة.
  2. بشكل منفصل ، واحتضان والحمض النووي الريبي (II) حلول المغنيسيوم عند 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. مزيج 10 ميكروليتر من محلول الحمض النووي الريبي مع 90 ميكرولتر من المبلغ المقابل من المغنيسيوم (الثاني) في 1X العازلة للوصول إلى الحجم النهائي من 100 ميكروليتر. احتضان الحلول لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
  3. السماح للحلول يوازن عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حين تحدث للطي.
  4. Peroxidative (3.4.1) أو الأكسدة (3.4.2) الهيدروكسيل footprinting رد فعل جذري.
    1. بدء رد فعل عن طريق وضع قطرات peroxidative من 2 ميكروليتر الحديد EDTA (100 ملم) ، 2 ميكروليتر L - الصوديوم أسكوربات (50 ملم) و 2 ميكرولتر H 2 O 2 (1.5 ٪) مفصولة عن بعضها البعض في الداخل أعلى من رد الفعل أنبوب يحتوي على الحمض النووي الريبي حل وبدء تفاعل footprinting عن طريق خلط قوية. وقف رد الفعل بعد مرور 15 ثانية وذلك بإضافة 300 ميكروليتر الايثانول المطلق الباردة. بدوره أنابيب 3-5 مرات. يعجل ، وغسل وتجفيف بيليه كما في الخطوة 2.4.
    2. بدء التأكسدي footprintingreaction الهيدروكسيل بإضافة 5 ميكروليتر من مزيج الطازجة رد فعل فنتون (1.6). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية. إضافة 300 ميكروليتر من الايثانول المطلق الباردة لإخماد التفاعل والاختلاط من خلال تحويل أنابيب 3-5 مرات. يعجل ، وغسل وتجفيف بيليه كما هو مبين في الخطوة 2.4.
  5. إنشاء مرجع ريبونوكلياز T1 هضم العينة وفقا للاجراءات المتبعة 10 باستخدام الحل أعد في الخطوة 1.3.
  6. هو معلق حل الكريات RNA في 8 ميكروليتر الثاني هلام صبغ التحميل (AMBION) والحمض النووي الريبي تأكيد باستخدام عداد جيجر.
  7. يعد تغيير طبيعة وتسلسل بولي أكريلاميد 8 ٪ هلام وفقا لبروتوكولات القياسية. عينات تحميل 11 بينهم اثنان من المراجع والسيطرة على. منفصلة شظايا الحمض النووي الريبي في 60 واط -- 75 واط لمدة 2.5 ساعة. فضح هلام المجففة إلى شاشة الفوسفور التخزين بين عشية وضحاها. مسح الفوسفور الشاشة مع نظام التصوير لتصوير الإشعاع الذاتي filmless ، على سبيل المثال. العاصفة 865 (جنرال إلكتريك للرعاية الصحية) أو إعصار (GE للرعاية الصحية). هلام نقل ملف الصورة إلى الكمبيوتر.

4. تحليل البيانات

  1. يتم تحديد التفاعلات الهيدروكسيل كل النوكليوتيدات عن طريق قياس كثافة كل فرقة على هلام التحليلية. تحميل ، تثبيت ، وفتح الصفا ، وسيلة سهلة لاستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر لتركيب فرقة واحدة وتقدير. 12 ، 13 اتبع تعليمات دليل المستخدم. لفترة وجيزة ، تحميل تسلسل الحمض النووي الريبي و. TXT الملف تليها صورة هلام و. هلام الملف. ضبط شدة الفرقة ، وتحديد الممرات ، واختيار حارة مرساة ، وتنفيذ التوافق هلام. احالة العصابات لالنيوكليوتيدات يحدث في اشارة الى سلم ريبونوكلياز الهضم T1. قياس التكاملات الفرقة واستخدام ميزة التطبيع / colorplot لتطبيع وتعيين بقايا ثابتة محتملة. حفظ الإخراج كملف TXT.
  2. SAFA نواتج جدول بيانات يحتوي على الأعمدة التي تمثل حارات على الجل والصفوف التي تمثل فيtegrated كثافة عصابة من عصابات فردية المقابلة لتفتيت الحمض النووي الريبي. أولا ، وتحديد مواقع الحماية التي تعرض تغيرا ملحوظا في الوصول المذيب بمقارنة ملف الحماية المستمدة من نموذج رقم (II) المغنيسيوم مع ملف تركيز نقطة النهاية (II) المغنيسيوم (50 ملم في مثالنا). انخفاض القيمة ، والمزيد من الحماية للالنوكليوتيدات هو ضد هجوم من جذور الهيدروكسيل ، والعكس بالعكس.
  3. إنشاء الأيسوثرم للطي من التكاملات الفرقة تطبيع للفرد أو مجموعة من النيوكليوتيدات في مقابل تركيز (II) المغنيسيوم. يتم تحجيم بشكل فردي الأيسوثرم لتشبع كسور بواسطة فاي = L + (U -- L) • Y حيث و يدل على كثافة متكاملة من الفرقة (ق) التي يجري تحليلها ، L و U تمثل الحدود الدنيا والعليا للانتقال و Y هو تشبع كسور (14). البيانات تستخدم تناسب ل غير الخطيةبرنامج التحليل شرق مربع (ونحن نستخدم إما المنشأ (OriginLab) أو GraphPad (GraphPad البرمجيات ، وشركة).) إلى المعادلة هيل (1) ،
    المعادلة 1
    حيث K d هو التوازن التفكك المستمر ، [م] يتوافق مع تركيز المتغير الذي يتوسط في رد فعل للطي ، والمغنيسيوم (الثاني) في هذا المثال ، و n هو معامل H هيل. هذا الإجراء جداول الانتقال إلى تشبع كسور ، ويحدد منتصفه ، ويوفر اختبار ما إذا كان من الظواهر الانتقالية السيني. وترد الأيسوثرم المستمدة من المواد الهلامية التسلسل (الشكل 3A) التي تم تحليلها بواسطة SAFA (الشكل 3B) وتناسب كما هو موضح أعلاه في الشكل 3C. وقد ولدت الأيسوثرم تشبع كسور هو مبين في الشكل (3) عن طريق التوسع في جدول القيم التي تم إنشاؤها بواسطة SAFA ضد الحدود الأنسب العلوي والسفلي (U و L) باستخدام جزء المعادلة = القيمة / (U -- L) -- L / (U -- L).

5. ممثل النتائج :

الشكل 3 يبين نتائج ممثلة من P4 - P6 RNA • التجارب footprinting أوهايو. صورة هلام (يسار) يشير إلى أن تشطر الخلفية) هو الحد الأدنى (حارة اليمين) ، ب) الاحالة النوكليوتيدات واحد هو ممكن بسبب نطاقات محددة جيدا في حارة T1 (T1 ريبونوكلياز يشق في كل مجموعة) ، وج) الهيدروكسيل بفعل تفتت الحمض النووي الريبي هو أعلى بكثير من الخلفية. ويتبع عملية الانتقال من منخفضة إلى المغنيسيوم عالية (II) مع تناقص كثافة متكاملة عصابة من الأفراد والجماعات من العصابات تشير تشكيل بنية الحمض النووي الريبي العالي. واحد أو مجموعة من النوكليوتيدات المتجاورة التي تشطر تغييرات متزامنة ويشار اليها باعتبارها "حماية". • توسط في الحماية OH سمة من المغنيسيوم (II) قابلة للطي من الحمض النووي الريبي P4 - P6 تتوافق بشكل وثيق الى المناطق التي يتعذر الوصول إليها مذيب للجزيء لوحظ في التركيب البلوري والخمسين. 15

مطوية جزيئات الحمض النووي الريبي ج وقد an بدرجات متفاوتة جدا (أي ، كيف قريبة من خلفية انخفاض كثافة الفرقة) لحماية الاتصال العالي التي لم ترتبط ظاهرة واضحة أو الهيكلية الحيوية. وبالتالي ، فإن بعض جزيئات الحمض النووي الريبي تظهر التحولات الهيكلية واضحة المعالم ، كما هو موضح في الشكل رقم 3 ، والبعض لا. وكميا شدة الفرقة وتطبيع عن طريق التحليل SAFA 12 (الشكل 3B). الإخراج هو "الحرارية" مؤامرة تصور درجة من الحماية ضد النسبية • أوهايو. الانتقال يصف تغيير اللون عند الوصول بالإضافة إلى ذلك (II) المغنيسيوم. الأبيض ليظهر حمراء أو زرقاء النيوكليوتيدات أكثر يسرا أو محمية أكثر من ذلك ، على التوالي. ويتبع كل درجة التظليل مع القيمة العددية التي يمكن رسم منحنى كما الحماية (الشكل 3C) وتحليلها من خلال نموذج ملزم مثل هيل المعادلة (1). التوازن التفكك المستمر مع حماية 153-155 تابعة لمرتين تقريبا من أن القيمة المقابلة للحماية 163-164.

ontent "> الشكل 1
الشكل 1. إنتاج الهيدروكسيل وP4 - P6 لطي الحمض النووي الريبي. أ) الحديد (II) يحفز على توليد جذور الهيدروكسيل من بيروكسيد الهيدروجين. أسكوربات يقلل من الحديد (III) مرة أخرى إلى الحديد الحديدية. ب) وفي غياب المغنيسيوم (الثاني) ، لم يتم تشكيل هيكل P4 - P6 التعليم العالي ، مما يسمح لاختراق جذور الهيدروكسيل ويلتصق جميع المناصب العمود الفقري للوصول. إضافة المغنيسيوم (ثانيا) من يبادر للطي P4 - P6 ، مما يسمح فقط العمود الفقري المشقوق المذيبات الوصول إليها من قبل جذور الهيدروكسيل.

الشكل 2
الشكل 2. مخطط لتجربة footprinting الهيدروكسيل. A Dephophorylation) و 32 ف 5' نهاية الوسم من الحمض النووي الريبي. ب) تنقية 32 ف المسماة الحمض النووي الريبي على هلام بولي أكريلاميد تغيير طبيعة. ج) الختان من الفرقة RNA ، بعد استخراج الحمض النووي الريبي ، وهطول الأمطار الايثانول. D) وPrefoldingللطي من الحمض النووي الريبي. E) إضافة طازجة أعدت خليط التفاعل فنتون لتوليد جذور الهيدروكسيل. F) فصل جزء عن طريق تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي بولي أكريلاميد هلام إستشراد. G) الكميات من شظايا الحمض النووي الريبي من قبل البرامج صفا.

الشكل 3
الشكل 3. تحليل شظايا الحمض النووي الريبي بعد peroxidative footprinting رد فعل فنتون. (أ) والحمض النووي الريبي تتعرض لجذور الهيدروكسيل ، وحلت منتجات الانقسام تغيير طبيعة استخدام هلام إستشراد بولي أكريلاميد (PAGE). وتظهر الصورة المنتجات تشطر peroxidative مع تركيز متزايد من المغنيسيوم (II). وصفت المرجعية ومراقبة الممرات. هذا الملف هو صورة مدخلات للبرنامج الذي SAFA quantitates حجم كل الفرقة. (ب) إن "الحرارية" المؤامرة التي تولدها صفا. (C) ويتم تحليل البيانات ومتكاملة من القيم المتعلقة كثافة الفرقة لإخراج عدد من النوكليوتيدات SAFA من نموذج ملزم مثل equati هيلعلى (1). وقد تم اختيار مناطق الحماية وفقا للزيادة في الكثافة الفرقة كجزء لا يتجزأ من وظيفة (الثاني) تركيز المغنيسيوم. د K هو (II) المغنيسيوم الذي يتم التركيز مطوية نصف RNA في الموقع الذي يجري رصدها. معامل هيل ، ن ه ، هو مقياس لميل المنحنى الذي يعطي معلومات عن cooperativity ملزمة ويوفر أقل تقدير لعدد المشاركين في أيونات المغنيسيوم لطي هذا الموقع بالذات.

الجدول 1
الجدول 1. أحجام الممثل لتوليد عينات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على المغنيسيوم المختلفة (II) التركيزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

footprinting الهيدروكسيل هو أداة قيمة لتقييم المذيب مساحة يمكن الوصول إليها من الأحماض النووية. يمكن أن يتبع تشكيل النوعي والكمي لهيكل التعليم العالي 14 بوصفها وظيفة من المعلمات مثل نوع وتركيز أيون ، ودرجة الحموضة ، درجة الحرارة ، والبروتينات ملزمة أو قابلة للطي العوامل المشتركة. تركيبة قوية لبروتوكول مستقيم إلى الأمام ، وغير مكلفة وسهولة الحصول الناتجة المذيبات والمعلومات القابلة للطي على مستوى واحد النوكليوتيدات يجعل هذا الأسلوب جذابة جدا. عادة يتم تنفيذ footprinting OH • رد فعل به وأضاف H 2 O 2 ، وبروتوكول نشير إلى أنه "peroxidative' (الشكل 1A). ويستخدم حل البديل الطبيعي ('التأكسدي') بروتوكول 17 أن نسلط الضوء O 2 لإنتاج كميات صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين من خلال ردود الفعل
المعادلة 2

كلا الأسلوبين جنرال الكتريكnerate عن طريق أكسدة الحديد (II) على الحديد (III) بواسطة H 2 O 2 (الشكل 1A) OH •. تفضيل شخصي يبدو لتحديد البروتوكول الذي يستخدم من قبل أعضاء مختبرنا لرسم الخرائط الهيكلية وتجارب المعايرة التوازن. ردود الفعل footprinting peroxidative الاكسدة ويستغرق حوالي 30 دقيقة و 1 على التوالي. ويقابل هذا العيب بواسطة بروتوكول التأكسدي يجري أبسط قليلا (أقل من واحد يتم إضافة كاشف) و "هشاشة" على ملامح الفرقة الكهربي الأكسدة. في حين أن هذه الملاحظة تشير إلى أقل تجانس في المنتجات • تشطر OH ، لم تختبر هذه الفرضية. نوصي باستخدام بروتوكول الأكسدة لتحليل عدد كبير من العينات footprinting (> 15) أو العينات التي تحتوي على H 2 O 2 المكونات الحساسة.

استخدام EDTA معقدة مشحونة سلبا من الحديد (II) (الشكل 1A) يمنع الجمعيات من الحديد (II) مع العمود الفقري للفوسفات المشحونة سلبا النوويحمض يمكن 1 مجانا الحديد (II) ربط الحمض النووي والحمض النووي الريبي ويكون بمثابة و / أو مرسب يمكن تحفيز التحلل من العمود الفقري الحمض النووي الريبي.

تركيزات قدم من الكواشف فنتون مثالية لRNA P4 - P6 يلتصق في ظل ظروف حركية واحدة ضربها اللازمة لfootprinting في المخزن المؤقت المشار إليه. حركية ضرب واحد ضمان المشقوق جزيء الحمض النووي الريبي مرة واحدة فقط في المتوسط ​​(18). إذا تم استخدام كمية مفرطة من كاشف فنتون ، والمنتجات RNA يمكن أن تنشأ من حالة الانقسام أكثر من واحد. هذا التحيز نحو تفتيت توزيع المنتجات أقصر الانقسام. يجب أن تعدل مدى الانقسام الجذري بحيث يتم المشقوق ~ 20 ٪ من الحمض النووي الريبي في نهاية المسمى و~ 80 ٪ من الحمض النووي الريبي في نهاية المسمى لا تزال سليمة. يجب استخدام الجرعة والاستجابة التجارب لتحديد المناسب الحديد (II) / H 2 O 2 تركيزات لتحقيق واحد من الزلزال حركية وفقا للشروط حل لدراسة محقق (19).

من تعصبويمكن استخدام خرائط إيف الوصول المذيبات تم الحصول عليها من تحليلات • footprinting OH حدها لوصف بنية الحمض النووي الريبي ، وهياكل وسيطة قابلة للطي وتشكلت خلال التجارب للطي التوازن. ويمكن الجمع بين هذه البيانات مع النتائج من تقنيات معالجة التغيرات العالمية في التشكل 7 و 20 و / أو دراسات footprinting الأنزيمية والكيميائية 21 التي تم إنشاؤها في ظل ظروف مماثلة. ويمكن تطوير خشن الحبيبات نماذج من الهياكل باستخدام الحمض النووي الريبي 22 الهيدروكسيل الكيميائية جذرية ومتكاملة وملامح footprinting الأنزيمية والقيود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة RO1 - GM085130 والمؤسسة الوطنية للعلوم MCB0929394. نشكر الدكتور ماريون شميت لضيافتها وعلى السماح لنا الفيلم في مختبرها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name Company Cat#
Sodium Cacodylate(Caution! Toxic) Sigma-Aldrich C4945-25g
EDTA (0.5 M) Ambion AM9260G
DEPC treated water Ambion AM9915G
Sodium Acetate (3 M) Ambion AM9740
MgCl2 (1 M) Ambion AM9530G
Urea Ambion AM9902
Sodium Citrate Sigma-Aldrich W302600
tRNA Sigma-Aldrich R-7876
Sodium-L-ascorbate Sigma-Aldrich A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O Sigma-Aldrich F1543-500g
RNase T1 Fermentas EN0541
Hydrogen Peroxide (30%) Sigma-Aldrich 349887

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tullius, T. D., Dombroski, B. A. Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).
  2. Celander, D. W., Cech, T. R. Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms. Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).
  3. Celander, D. W., Cech, T. R. Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule. Science. 251, 401-407 (1991).
  4. Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting. Science. 279, 1940-1943 (1998).
  5. Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts. Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).
  6. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).
  7. Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting. Methods. 49, 142-147 (2009).
  8. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).
  9. Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes. Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).
  10. Knapp, G. Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure. Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).
  11. Slatko, B. E., Albright, L. M. Denaturing gel electrophoresis for sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).
  12. Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 11, 344-354 (2005).
  13. Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA. Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).
  14. Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme. Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).
  15. Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing. Science. 273, 1678-1685 (1996).
  16. Petri, V., Brenowitz, M. Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).
  17. Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations. J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).
  18. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).
  19. Shcherbakova, I., Mitra, S. Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure. Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).
  20. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
  21. McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly. Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).
  22. Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters. RNA. 15, 189-199 (2009).

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 56 ، الهيدروكسيل ، footprinting ، RNA ، فنتون ، التوازن
التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل 'Peroxidative' و 'مؤكسد' Footprinting الهيدروكسيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bachu, R., Padlan, F. S.,… More

Bachu, R., Padlan, F. S., Rouhanifard, S., Brenowitz, M., Schlatterer, J. C. Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting. J. Vis. Exp. (56), e3244, doi:10.3791/3244 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter