Longitudinal Evaluering af Mouse Hind Limb knogletab Efter Rygmarvsskader med Roman, In vivo, Metodologi

Summary

En langsgående undersøgelse af knogletab i lårben og tibiae af voksne mus blev udført efter rygmarvsskade bruge sekventielle lav-dosis x-ray-scanninger. Tibia knogletab blev opdaget i hele undersøgelsen, mens knogletab i lårbenet ikke blev opdaget før 40 dage efter skaden.

Abstract

Rygmarvsskade (SCI) er ofte ledsaget af osteoporose i sublesional regioner af bækken og underekstremiteter, hvilket fører til en højere frekvens af frakturer ^1. Da disse frakturer ofte optræder i regioner, der har mistet normal sensorisk funktion, patienten er i større risiko for brud-afhængige patologier, herunder dødsfald. SCI-afhængige tab i både knoglemineraltæthed (BMD, gram / ​​cm ²⁾ og knoglemineralindhold (BMC, gram) er blevet tilskrevet mekanisk ude af brug ^2, afvigende neuronal signalering ³ og hormonelle forandringer ^4. Brugen af gnavere modeller af SCI-induceret osteoporose kan give uvurderlig information om de mekanismer, der ligger til grund for udvikling af osteoporose efter SCI samt et testmiljø for generering af nye behandlingsformer ^5-7 (og revideret i ^8). Musemodeller for SCI er af stor interesse, da de tillader en reduktionistisk tilgang til mekanisme-based vurdering ved brug af null og transgene mus. Mens sådanne modeller har leveret vigtige data, er der stadig et behov for minimalt invasiv, pålidelige, reproducerbare, og kvantificerbare metoder i fastlæggelsen af ​​omfanget af knogletab efter SCI, især over tid og inden for samme kohorte af forsøgsdyr, for at forbedre diagnose , behandlingsmetoder, og / eller forebyggelse af SCI-induceret osteoporose.

En ideel metode til måling af knogletætheden i gnavere ville tillade flere, sekventiel (over tid) engagementer med lave niveauer af røntgenstråling. Denne undersøgelse beskriver brugen af ​​en ny hel-dyr scanner, den IVIS Lumina XR (Caliper instrumenter), der kan bruges til at give lav-energi (1-3 milligray (mGy)) med høj opløsning og høj forstørrelse X-ray billeder af musen bag lemmer knogler over tid efter SCI. Væsentlige knogletæthed tab blev set i tibiae af mus med 10 dage efter spinal transection sammenlignet med uskadt, alder-matchede kontrol (naive) mus (13% reduktion, p <0,0005). Tab af knogletætheden i distale femur var også påvises ved dag 10 post-SCI, mens et tab af tæthed i den proksimale femur ikke blev opdaget før 40 dage efter skaden (7% fald, p <0,05). SCI-afhængige tab af mus lårben tæthed blev bekræftet post-mortem ved brug af Dual-energy X-ray absorptiometri (DXA), den nuværende "gold standard" for knogletæthed målinger. Vi registrerer en 12% tab af BMC i lårben af ​​mus ved 40 dage efter SCI bruger IVIS Lumina XR. Denne forbedring i forhold til et tidligere rapporteret BMC tab på 13,5% i Picard og kolleger, der bruges DXA analyse på musen lårben post mortem 30 dage efter SCI ^9. Vores resultater tyder på, at IVIS Lumina XR giver en roman, high-resolution/high-magnification metode til at udføre langsigtet, langsgående målinger af bageste legemsdel knogletætheden i mus følgende SCI.

Protocol

1. Mus spinal transection model

1. Voksne, mandlige, C57BL6 mus (ca. 20-25 g) er bedøvet ved hjælp af en kombination af ketamin (200 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Alle kirurgiske procedurer er udført i et institutionelt, IACUC-godkendt kirurgisk suite under sterile forhold.
2. Når dybt bedøvede, er pelsen af ​​ryggen trimmes ved hjælp af elektriske klippere. Den barberede ryg er først skrubbes med en jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol.
3. Forud for den første indsnit, er det område af ryggen at være snit first infiltreret med en lokal bedøvelse (Marcaine) i en koncentration på (0,25%, <1ml/kg) for at minimere post-operative smerter.
4. Ved hjælp af en lille saks, er en lille åbning i huden på omkring L2-området. Denne åbning er udvidet med det samme sæt af sakse, der strækker sig langs den T2-området. Kanterne af huden derefter holdes fra hinanden ved brug af bulldog klemmer.
5. Micro-saks bruges så tilat rydde muskelvæv fra ryggens spinale lamina på thorax-niveau 8 (T8). T8 kan identificeres som beskrevet i Kuh og Wrathall (1998) ^10. Kort fortalt, kan T13 kan identificeres ved sin ryg spinosus proces. Brug et par # 5 Dumont pincet, kan ribben kan palperes / identificeres og tælles tilbage til T8. Når ryddet, ben Rongeurs bruges til at udføre en dorsal laminektomi ved T8.
6. Fuld Spinal Transection Læsionssynligheden: Når rygmarven er udsat på T8, et ekstra sæt steriliseret mikro-saks bruges til at skille de rygmarven i planet vinkelret på den lange akse af ledningen under et kirurgisk mikroskop. Vi bruger # 5 Dumont pincet til forsigtigt at løfte den ene pol af rygmarven at bekræfte fuldstændigheden af ​​læsion.
7. Efter spinal transection, et lille stykke af sterile gelfoam, dyppet i sterilt saltvand (0,9%) er omhyggeligt placeret ind i læsionen hulrum til fremme hæmostase.
8. En ekstra stykke gelfoam er derefter placeret over den eksponerede spin-al ledningen. Huden er derefter lukkes med steril, rustfrit stål kirurgiske hæfteklammer. Emner bliver derefter tilbage til deres hjem bure, placeret på et stykke køkkenrulle for at forhindre aspiration af strøelse og varmede med en varmepude i en periode på cirka 12 timer. Emner er også udstyret med Hydrogel packs (ClearH2O) og mad pellets på gulvet i deres bure i den tidlige fode igen. Tilskadekomne fag er i stand til at få adgang til mad / vand i deres hjem bure gang inddrives fra anæstesi.
9. Alle tilskadekomne personer modtager to gange daglig manuel blære evakueringer (på omkring 12 timers intervaller) ved hjælp af en ændring af den manuelle metode CREDE for varigheden af ​​undersøgelsen (40 dage).
10. Tilskadekomne mus er også forsynet med to gange daglig intraperitoneal injektioner med 0,9% saltvand i tre dage (0,5 cc) for at hjælpe opretholde væskebalancen, og to gange daglige injektioner af opiat buprenorphin (0,05 mg / kg) til at styre post-operative smerter i en periode på 5 dage. Hvis dyrene udviser tegn of smerter efter de initiale 5 dages periode, ville de modtage yderligere buprenorphin (0,05 mg / kg) dagligt indtil tegn på smerte (nedsat mobilitet, foroverbøjet statur, manglende groom, vokalisering, når de håndteres) er forsvundet.

2. Longitudinal vurdering af knogletæthed bruge IVIS Lumina XR på den samme kohorte af spinally-transected mus

1. Begynder Dag 10 post-SCI og fortsatte med 10 dages mellemrum indtil dag 40, vi vurderet til højre og venstre lårben og tibiae i levende, bedøvede patienter (transection SCI og uskadt alder-matchede kontroller).
2. På dagen for scanningen, blev forsøgspersonerne overført i deres hjem bure fra institutionens vivarium område til det rum, hvor Caliper IVIS Lumina XR har til huse. Alle emner bliver derefter bedøvet ved hjælp af samme Ketamin / xylazin cocktail tidligere har været anvendt i leveringen af ​​SCI. Denne cocktail sikrer en tilstand af anæstesi i en periode på 1 til 1,5 timer, tilstrækkeligt til, at varigheden af ​​scannING procedure.
3. Investigator initialiserer Lumina XR enheden og gør det muligt for interne kamera til at nå operative temperatur (-90 ° C) (~ 10 minutter).
4. Når bedøvede, er emnet (transection eller kontrol) forsigtigt placeret på dyret platform inden for Lumina XR. En høj forstørrelse linse er indsat i enheden til at tillade fokus på både lårbenet og tibial regioner (Synsfelt 2.4X2.4cm med høj forstørrelse objektiv). Hvis motivet er forkert placeret uden for synsfeltet, bliver døren åbnet og emnet placeres et andet sted, indtil venstre eller højre bagben lemmer er centreret (Se figur 2a for korrekt placering af den bageste legemsdel).
5. Når placeret korrekt, kan X-ray-funktionen blive henrettet. Foretag et valg fra Energy drop-down listen egnet til foderbrug (Living emne, 35 Kv 100uA, filtreret X-Rays)
6. Når dyret er i den rigtige position, skal du aktivere X-ray feature ved check-mærkning X-Ray ikontrolpanel. anskaffe X-ray billede. Sørg for, at hele lårben og skinneben er synlige (se figur 2b). Rå billeddata gemmes automatisk på harddisken. Repræsentant. TIFF-filer gemmes også. Musen er derefter tilbage til sit hjem bur og lov til at komme under investigator observation. Processen gentages så med den næste musen.
   Note: The Living Billede softwaren viser forvandlet X-ray billeder som standard. For at vise rå X-ray billeder, skal du fjerne fluebenet ud for X-Ray Absorption i korrektioner / Filtreringsværktøjer. Når X-ray data er blevet korrigeret for absorption, kan du vurdere relative knogletæthed ved at sammenligne signal intensiteter for måling ROIs. Den ROI intensiteten stiger med stigende væv tæthed.

3. Billede analyse af IVIS X-ray scanner

1. Åbn softwaren ved at dobbeltklikke på den levende billedikonet.
2. Load en X-ray billede ved at klikke på OK. The Living Billede browser viser de markerede data sammen med bruger-id, mærkningen oplysninger, og kamera konfigurationsoplysninger. For at åbne data, skal du gøre et af følgende: Dobbeltklik på data rækken, Højreklik på data navnet, og vælg Indlæs i genvejsmenuen, Vælg de data rækken og klik på Indlæs, eller Dobbeltklik på miniaturebilledet. Billedet og Tool Palette vises. Åbn data er markeret med grønt i browseren.
3. Klik på ROI-værktøjer i værktøjskassen. I ROI-værktøjer,. Vælge Måling investeringsafkast fra den type drop-down listen For at indlæse de 3 ROI der bruges i dette eksperiment, skal du klikke på pladsen ikonet og belastning 3 felter.
4. Ved hjælp af en lineal, længden på lårbenet foranstaltning. Juster længden af to af de pladser, der skal 1 / 8 ^th af den samlede lårbenet længde. Juster bredden af ​​disse to felter, der skal 1/24th den samlede lårbenet længde. Med din lineal, måle 1 / 8 ^th af afstanden fra den proksimale ende af lårbenet, og placere pladsen, så den er centreret i lårbenet. Placere andet kvadrat, så det ligger 1/4th af den samlede lårben længde fra den distale ende af lårbenet (Fig. 3). Disse ROI er kan bruges til at måle både proksimale og distale femur regioner.
5. Ved hjælp af linealen, længden af ​​skinnebenet foranstaltning. Juster længden af den tredje pladsen til 1 / 8 ^th af den samlede tibia længde. Juster bredden til 1 / 30 ^th af den samlede tibia længde. Placere pladsen, så er centreret og 1 / 8 ^th den samlede længde af skinnebenet afstand fra den proksimale ende af skinnebenet (se figur 3).
6. Klik på Mål ikonet (en blyant og lineal). Den ROI intensitet målinger vises i X-ray billede og ROI målinger tabellen vises. Export denne tabel to din ønskede placering som en. csv-fil. Dette giver dig mulighed for at åbne tabellen ved hjælp af Excel.
7. Gentag dette med alle dine gemte billeder.
8. Konsolidere alle dine data på ét excel ark. Statistisk signifikans blev bestemt via student t-test ved hjælp af enten Microsoft Excel eller SigmaPlot 11,0 software (Systat Software).

4. Post-mortem analyse af knogletæthed:

1. Efter overtagelsen af ​​den endelige langsgående X-ray scanner i IVIS Lumina XR, er mus efterfølgende dybt bedøvet med Beuthanasia (75 mg pentobarbital / kg). Når dyb anæstesi er opnået, er de mus transcardially perfunderet med ice-kold fosfat-bufferet saltvand med heparain (40 mg / liter) til exsanguinate.
2. Når exsanguinated, punktafgifter begge lårben. Vær særlig omhyggelig med at fjerne så meget blødt væv som muligt, for dette har vist sig at påvirke tæthed måling ^11. Pak lårben med vand opblødt gaze og opbevares ved-20C, indtil du er klar til at analysere dem.

5. DXA Analyse ved hjælp af en Hologic QDR 4000 Bone densitometer

1. Optø gaze-gennemblødt lårben og overførsel til Bone densitometer suite.
2. Kalibrer apparat i henhold til producentens protokollen; sikre, at BMC og BMD værdier falder inden for de acceptable grænser.
3. Placer en messing kollimator i maskinen. Dette giver brugeren mulighed for at begrænse størrelsen og vinklen på X-ray stråle at fokusere på et specifikt mål.
4. Nedsænkes optøede lårbenet i en petriskål fyldes med vand (condyles til venstre, med lårbenet parallelt med seng), og placer det lige til højre for laser.
5. Indtast en biografi (en beskrivende titel, der omfatter dyreidentifikation information, behandling, mv) til lårbenet du er ved at scanne.
6. Indtast Scan fra Selections Menu, og vælg derefter regionens hi-res. Angiv dit scanningsparametre: En scanning region 2 x 0,7489 inches, med 0,01 tommer linjeafstand og 0,00499 tommer punkt opløsning.
   Bemærk: Overvåg scanningen, mens den er i gang. Da X-ray stråle raster scanner prøven, overvåge for at sikre, at der er tilstrækkeligt vand i kammeret til helt at dække knoglen prøven.
7. Indtast Analyser under Analysis Selection menuen. Følg vejledningen for at fremhæve hele lårbenet som en ROI. En rapport side vil komme op med den beregnede BMC (gram) og BMD (GMS / cm ^2).
8. Gentag disse trin for at analysere de resterende lårben.
9. Konsolidere alle dine data på ét excel ark og statistisk analyse (t-test).

6. Repræsentative resultater:

Den relative knogletæthed tab af en mus skinneben og lårben efter rygmarvsskade sammenlignet med naive mus kan påvises ved hjælp af ovenstående metode. Der er en påviselig signifikant fald i knogletæthed, efterblot 10 dage (12%, p <0,0005), med op til 15% knogletæthed tab på 40 dage (p <0,0005, figur 4). Knogletæthed tab i lårbenet blev observeret ved 40 dage efter skaden (7% fald, p <0,05, figur 5). Disse resultater giver evidens for anvendelse af ikke-invasiv x-ray imaging for langsgående observation af knogletæthed ændre sig efter rygmarvsskade.

For at sammenligne virkningen af ​​denne metode til at det nuværende niveau, og vi analyserede fjernet lårben af ​​disse mus 40 dage efter skaden ved hjælp af DXA scanning. En repræsentation af data-outputtet kan ses i Figur 6. Vi fandt, at der var et betydeligt tab af knoglemineralindhold i SCI mus sammenlignet med naive (12% reduktion, p <0,05, figur 7). Knoglemineraltæthed ikke ændre sig væsentligt, men har fulgt en lignende tendens (figur 8). Disse resultater svarer til dem, der findes i litteraturen; Picard et al observeret en 13,5% reduktion (p <0,001) i BMC, men ingen signifikant decrlethed i BMD (Picard 2008).

Figur 1. Eksperimenterende Tidslinje.

Figur 2 repræsentants orientering af venstre bagben-lemmer:. A) fotografi og b) x-ray.

Figur 3. ROI dimensioner og orientering inden for regionerne i de proksimale lårben og skinneben.

Figur 4. Knogletæthed tab efter SCI i den proksimale tibia 10, 20, 30 og 40 dage efter skaden (n = 5) i forhold til alder-matchede naives (n = 5). Fejl søjler repræsenterer SEM, ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figur 6. Knogletæthed tab efter SCI i distale femur 10, 20, 30 og 40 dage efter skaden (n = 5) i forhold til alder-matchede naive kontrol (n = 5). Fejl søjler repræsenterer SEM; * p <0,01 til 0,05, ** p <0,001 til 0,01, *** p <0,0001-,001; **** p <0,0001.

Figur 7. Repræsentant billede af DXA data, der viser BMC og BMD output.

Figur 8. DXA analyse af knoglemineralindhold (gram) i lårben af SCI mus 40 dage efter skaden (n = 5) vs alder-matchede naives (n = 5).Fejl søjler repræsenterer SEM; * p <0,05.

Figur 9. DXA analyse af knoglemineraltæthed (mg / cm ²⁾ i lårben af SCI mus 40 dage efter skaden (n = 5) vs alder-matchede naives (n = 5). Fejl søjler repræsenterer SEM; ingen signifikant forskel.

Discussion

Denne undersøgelse præsenterer en roman, non-invasiv metode til at vurdere tæthed forandringer inden for de enkelte knogler (tibiae og lårben) på langs, inden for en enkelt kohorte af mus, ved hjælp af Caliper IVIS Lumina XR imaging system. SCI medførte et fald i knogletæthed i både lårben og tibiae, når studeret inden for en enkelt kohorte af spinally-transected mus over en 40 dage assay periode i forhold til alder-matchede, uskadt, kontrol mus. Vores resultater i lårbenet blev bekræftet, post-mortem, ved hjælp af DXA, hvilket tyder på, at anvendelsen af ​​den Caliper Instruments IVIS Lumina XR kan tjene som et følsomt måle redskab til at vurdere de langsigtede og progressive effekter af SCI om knogletab .

En potentiel fordel for efterforskerne at bruge dette system er muligheden for at langs følge udviklingen af ​​patologiske forandringer i bageste del knogler af dyr efter SCI. Evnen til at vurdere en enkelt kohorte over lange perioder giver stRong fordele for investigator i form af: 1) omkostninger forbundet med dyre køb og langvarig pleje. I stedet for en undersøgelse, der kræver et stort antal dyr, der har brug for at blive ofret på bestemte tidspunkter for at vurdere tidsafhængig ændringer, kan disse patologiske resultater følges i samme kohorte over den samme periode, 2) variation: Ud over sammenlignet med kontrol kohorter, kan resultaterne genereres inden for det indre kohorte af sårede emner vurderes og sammenlignes mellem tidspunkter for de samme dyr hele omfanget af forsøget endnu engang, hvilket reducerer både intra-dyr variabilitet såvel som behovet for større kohorter af eksperimentelle fag.

Mens Caliper IVIS Lumina XR givet os vigtige langsgående oplysninger om udviklingen af ​​SCI-induceret osteoporose, der er begrænsninger, der bør overvejes: 1), mens denne platform har givet os mulighed for at generere høj opløsning X-ray datA i den bageste del knogler fra mus efter SCI, kan dens nytteværdi være begrænset til små gnavere som mus. Den maksimale emne højde tilladt inden for Lumina XR er 2,8 cm. Alt over denne højde kan ikke med held filmede med X-ray del af Lumina XR. I vores hænder, har dette udelukket vores evne til at studere rotter i 200-250 gram vægt. Selv om det kan være muligt at billedet rotter under denne vægt interval eller andre gnavere som hamstere eller ørkenrotter, vil dette kræve yderligere afprøvning af PI. 2) Fælles orientering. Det er afgørende, at Investigator omhyggeligt arrangere lemmer i en let reproducerbar orientering, der vil give succesfulde sammenligning mellem billeddannelse sessioner. Standardisering af lemmer placering vil gøre det muligt Investigator at generere og anvende standardiserede ROI er, der kan gemmes og anvendes på tværs af både fag og tid.

Samlet set mener vi, at IVIS Lumina XR giver en god platform, som til modeludviklingen af ​​SCI-afhængige osteoporose hos mus. Evnen til at studere knogletab på langs inden for samme musen kohorte vil give os mulighed for at: 1) bedre at forstå den tidsmæssige karakteren af ​​knogletab og demineralisering efter SCI, 2) at afgøre, om disse ændringer stabilisere sig over tid, 3) udforske, med tilgængeligheden af både transgene og null mus linjer, evnen til at studere de molekylære mekanismer bag disse patologiske forandringer i en reduktionistisk måde, og 4) helt muligvis den vigtigste fordel, begynde at afprøve nye tiltag, der skal enten forebygge udvikling af osteoporose i de tidlige stadier af skade, eller at vende sådanne ændringer, når knogleskørhed allerede har udviklet. Endelig Lumina XR, ud over at give fremragende røntgenbilleddannende potentiale, kan også bruges til at studere både selvlysende og fluorescerende signaler i levende dyr. Man kunne sagtens forestille sig at indarbejde andre modaliteter, der tilbydes inden for dette system til at se på en multitude af faktorer, der bestemmer knogle dynamik mekanisk følgende SCI eller enhver anden sygdom proces, der resulterer i knogleskørhed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production