Évaluation longitudinale des souris Limb perte osseuse Hind après un traumatisme médullaire utilisant Novel, In vivo Méthodologie

Summary

Un examen longitudinal de la perte osseuse dans les fémurs et les tibias des souris adultes a été réalisée suite à une blessure de la moelle épinière en utilisant séquentielle faible dose de rayons X scanne. La perte osseuse du tibia a été détecté pendant l'étude, tandis que la perte osseuse dans le fémur n'a pas été détecté jusqu'à 40 jours après la lésion.

Abstract

Lésion de la moelle épinière (SCI) est souvent accompagnée de l'ostéoporose dans les régions sublesional du bassin et des extrémités inférieures, conduisant à une fréquence plus élevée de fractures ^1. Comme ces fractures se produisent souvent dans des régions qui ont perdu la fonction sensorielle normale, le patient est à un plus grand risque de fracture de pathologies dépendantes, y compris la mort. SCI-dépendante de perte à la fois dans la densité minérale osseuse (DMO, g / cm ²⁾ et le contenu minéral osseux (CMO, g) a été attribuée à la désuétude mécanique ^{2, 3} neuronale aberrante de signalisation et les changements hormonaux ^4. L'utilisation de modèles de rongeurs de la SCI ostéoporose induite peut fournir de précieuses informations concernant les mécanismes qui sous-tendent le développement de l'ostéoporose après la SCI ainsi que d'un environnement de test pour la génération de nouvelles thérapies ^5-7 (et révisée en ^8). Des modèles murins de la SCI sont d'un grand intérêt car ils permettent une approche réductionniste d'un mécanisme-bal'évaluation sed grâce à l'utilisation des souris nulles et non transgéniques. Bien que ces modèles ont fourni des données importantes, il ya toujours un besoin pour minimalement invasif, des méthodes fiables, reproductibles et quantifiables dans la détermination de l'étendue de la perte osseuse après la SCI, en particulier au cours du temps et au sein de la même cohorte d'animaux de laboratoire, pour améliorer le diagnostic , méthodes de traitement, et / ou la prévention de l'ostéoporose induite par la SCI.

Une méthode idéale pour mesurer la densité osseuse chez les rongeurs permettrait d'expositions multiples, séquentiels (le temps) à faible niveau d'irradiation par rayons X. Cette étude décrit l'utilisation d'un nouvel ensemble d'animaux du scanner, le IVIS Lumina XR (étrier Instruments) qui peuvent être utilisés pour fournir de basse énergie (1-3 milligray (mGy)) à haute résolution, à fort grossissement des images radiographiques des os des membres postérieurs de la souris au cours du temps après un traumatisme médullaire. Une perte significative de la densité osseuse a été observée dans les tibias des souris de 10 jours post-rachidien transection comparativement aux indemne, appariés selon l'âge de contrôle (naïfs) souris (13% de diminution, p <0,0005). La perte de densité osseuse dans le fémur distal est également détectable par jour 10 post-SCI, tandis qu'une perte de densité dans la partie proximale du fémur n'était pas détectable jusqu'à 40 jours après la lésion (diminution de 7%, p <0,05). SCI-dépendante la perte de densité du fémur de souris a été confirmé post-mortem par l'utilisation de bi-énergie absorptiométrie à rayons X (DEXA), le «gold standard» actuel pour les mesures de densité osseuse. Nous détecter une perte de 12% de BMC dans les fémurs de souris à 40 jours post-SCI en utilisant les IVIS Lumina XR. Cela se compare favorablement avec une perte indiqué précédemment BMC de 13,5% par Picard et ses collègues qui ont utilisé l'analyse DXA sur la souris fémurs post-mortem 30 jours après la SCI ^9. Nos résultats suggèrent que l'IVIS Lumina XR offre une nouvelle méthode pour effectuer high-resolution/high-magnification long terme, les mesures longitudinales de la densité osseuse des membres postérieurs chez la souris après un traumatisme médullaire.

Protocol

1. Modèle de souris transection spinale

1. Adulte, mâle, souris C57BL6 (environ 20-25 g) sont anesthésiés à l'aide d'une combinaison de kétamine (200 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées dans un cadre institutionnel, IACUC approuvé bloc opératoire dans des conditions stériles.
2. Une fois profondément anesthésiés, la fourrure du dos est garni en utilisant une tondeuse électrique. Le dos est d'abord nettoyée rasé avec une solution d'iode suivie par 70% d'éthanol.
3. Avant l'incision initiale, la zone de l'arrière pour être incisé est d'abord infiltré avec un anesthésique local (marcaïne) à une concentration de (0,25%, <1ml/kg) pour minimiser les douleurs post-chirurgicales.
4. L'utilisation de petits ciseaux, une petite ouverture est faite dans la peau autour de la zone L2. Cette ouverture est élargie avec le même ensemble de ciseaux, qui s'étend longitudinalement à la zone T2. Les bords de la peau sont ensuite tenus à l'écart par l'utilisation de pinces de bouledogue.
5. Micro-ciseaux sont alors utiliséspour effacer le tissu musculaire de la lamina épinière dorsale au niveau thoracique 8 (T8). T8 peuvent être identifiés comme décrit dans Kuh et Wrathall (1998) ^10. Brièvement, T13 peut être identifié par son apophyse épineuse dorsale. En utilisant une paire de pince Dumont # 5, la dernière côte peut être palpé / identifiés et comptés retour à T8. Une fois effacé, Rongeurs d'os sont utilisées pour effectuer une laminectomie dorsale T8.
6. Lésion pleine transection spinale: Une fois la moelle épinière est exposée à T8, un ensemble supplémentaire de stériliser les micro-ciseaux sont utilisés pour sectionner la moelle épinière dans le plan perpendiculaire à l'axe long de la corde sous un microscope chirurgical. Nous utilisons # 5 pince Dumont à soulever délicatement un pôle de la moelle épinière afin de confirmer la complétude de la lésion.
7. Après transection spinale, un petit morceau de Gelfoam stérile, trempé dans une solution saline stérile (0,9%) est soigneusement placée dans la cavité lésion à favoriser l'hémostase.
8. Une pièce supplémentaire de Gelfoam est ensuite placé sur le spin exposéecordon al. La peau est ensuite fermé avec stériles, en acier inoxydable des agrafes chirurgicales. Les sujets sont ensuite retournés dans leur cage d'origine, placé sur une serviette en papier pour empêcher l'aspiration de litière et chauffée avec un coussin chauffant pour une période de 12 heures environ. Les sujets sont également fournis avec des packs d'hydrogel (ClearH2O) et boulettes de nourriture sur le plancher de leurs cages pendant redresser au début. Sujets blessés sont en mesure d'accéder à la nourriture / eau dans leur maison une fois récupérés des cages de l'anesthésie.
9. Tous les sujets blessés reçoivent deux fois par jour évacuations vessie manuel (à environ 12 heures d'intervalle) en utilisant une modification de la méthode manuelle de Crede pour la durée de l'étude (40 jours).
10. Souris blessés sont également fournis avec deux injections quotidiennes intrapéritonéales de saline à 0,9% pendant trois jours (0,5 cc) pour aider à maintenir l'hydratation, et deux fois des injections quotidiennes de l'buprénorphine opiacés (0,05 mg / kg) pour contrôler les douleurs post-chirurgicales pour une période de 5 jours. Si des animaux présentent des signes of douleur après la période initiale de 5 jours, ils recevraient la buprénorphine supplémentaires (0,05 mg / kg) par jour tant que les signes de la douleur (mobilité réduite, la stature courbée, non marié, la vocalisation lorsqu'il est manipulé) ont résolu.

2. L'évaluation longitudinale de la densité osseuse à l'aide de l'IVIS Lumina XR sur la même cohorte d'spinale-sectionné souris

1. À compter du jour 10 post-SCI et continue à intervalles de 10 jours jusqu'au jour 40, nous avons évalué les fémurs droit et gauche et tibias dans la vie, les sujets anesthésiés (transection SCI et saufs témoins appariés par âge).
2. Le jour de la numérisation, les sujets ont été transférés dans leurs cages à domicile de la zone de Vivarium de l'institution de la pièce dans laquelle l'étrier IVIS Lumina XR est logé. Tous les sujets sont ensuite anesthésiés en utilisant le même kétamine / xylazine cocktails précédemment utilisé dans la livraison de la SCI. Ce cocktail assure un état d'anesthésie pour une période de 1 à 1,5 heures; suffisante pour la durée de l'scannprocédure d'ING.
3. L'enquêteur initialise le périphérique Lumina XR et permet à la caméra interne pour atteindre la température de fonctionnement (-90 ° C) (~ 10 minutes).
4. Une fois anesthésié, le sujet (transection ou de contrôle) est doucement placée sur la plate-forme des animaux dans la XR Lumina. Une lentille à fort grossissement est inséré dans l'appareil pour permettre à la fois se concentrer sur le fémur et du tibia régions (Champ de vision 2.4X2.4cm avec fort grossissement de l'objectif). Si le sujet est mal positionné en dehors du champ de vue, la porte est ouverte et le sujet repositionné jusqu'à ce que la jambe gauche ou arrière droit est centré (voir figure 2a pour le placement correct de la patte postérieure).
5. Une fois correctement positionné, la fonction X-ray peut être exécuté. Faites une sélection à partir de l'énergie dans la liste déroulante appropriée des animaux (sous réserve de vie, 35 kV 100uA, filtré les rayons X)
6. Une fois que l'animal est en bonne position, activer la fonction X-ray par chèque de marquage X-Ray dans lepanneau de contrôle. Acquérir l'image aux rayons X. Assurez-vous que le fémur et le tibia sont ensemble visible (voir figure 2b). Données d'image RAW est automatiquement sauvegardé sur le disque dur. Représentant. Les fichiers TIFF sont également enregistrés. La souris est ensuite retourné à la maison de sa cage et a permis de récupérer sous observation enquêteur. Le processus est ensuite répété avec la souris à côté.
   Note: Le logiciel Image habitable affiche transformé images aux rayons X par défaut. Pour afficher premières images aux rayons X, supprimer la coche à côté de X-Ray Absorption dans le système correctionnel / Les outils de filtrage. Lorsque les données de rayons X a été corrigé pour l'absorption, vous pouvez évaluer la densité osseuse par rapport en comparant les intensités du signal de ROIs mesure. L'intensité augmente avec la densité ROI tissus augmente.

3. L'analyse des images des rayons X IVIS scans

1. Ouvrez le logiciel en double-cliquant sur l'icône vivante image.
2. Charger une image aux rayons X en cliquant sur le OK. Le navigateur d'image Living affiche les données sélectionnées avec l'ID utilisateur, les informations d'étiquettes et les informations de configuration caméra. Pour ouvrir les données, effectuez l'une des manières suivantes: Double-cliquez sur la ligne de données, clic droit sur ​​le nom de données et sélectionnez Charger dans le menu contextuel, sélectionnez la ligne de données et cliquez sur Charger, ou double-cliquez sur la vignette. La palette de l'image et l'outil sont affichées. Ouvrir les données sont surlignés en vert dans le navigateur.
3. Cliquez sur Outils ROI dans la palette d'outils. Dans les outils ROI, ROI Mesure sélectionner le type de liste déroulante. Pour charger le ROI 3 est utilisé dans cette expérience, cliquez sur l'icône Square et de charge de 3 cases.
4. En utilisant une règle, mesurer la longueur du fémur. Ajuster la longueur de deux des carrés à ^e 1 / 8 de la longueur du fémur au total. Ajuster la largeur de ces deux places à 1/24e de la longueur du fémur total. Avec votre règle, mesurez 1 / 8 ^ème de la distance de l'extrémité proximale du fémur, et de situer la place de sorte qu'il soit centré dans le fémur. Situer le second carré de sorte qu'elle repose 1/4ème de la longueur du fémur au total depuis l'extrémité distale du fémur (fig. 3). Ces ROI peut être utilisé pour mesurer les régions du fémur proximale et distale.
5. Utilisation de la règle, mesurer la longueur du tibia. Ajuster la longueur de la troisième carré à ^e 1 / 8 de la longueur totale du tibia. Ajustez la largeur à 1 / 30 ^ème de la longueur totale du tibia. Situer la place de telle sorte que soit centré et 1 / 8 ^ème de la longueur totale de la distance du tibia de l'extrémité proximale du tibia (voir figure 3).
6. Cliquez sur l'icône Mesurer (un crayon et une règle). Les mesures d'intensité ROI apparaissent dans l'image aux rayons X et la table ROI mesures apparaît. Exporter cette table to l'emplacement souhaité dans un fichier. csv. Cela vous permettra d'ouvrir la table en utilisant Excel.
7. Répétez cette opération avec toutes vos images enregistrées.
8. Consolider toutes vos données sur une seule feuille de calcul Excel. La signification statistique a été déterminée par l'étudiant t-test en utilisant Microsoft Excel ou SigmaPlot 11,0 logiciel (Software Systat).

4. Analyse post-mortem de la densité osseuse:

1. Après l'acquisition de la finale longitudinale X-ray scanner dans le XR IVIS Lumina, les souris sont ensuite profondément anesthésiés avec Beuthanasia (75 mg de pentobarbital / kg). Une fois l'anesthésie profonde a été atteint, les souris sont perfusées avec transcardiaque glacé froide tampon phosphate salin avec heparain (40 mg / litre) pour être exsangue.
2. Une fois saigné, deux fémurs d'accise. Payer un soin particulier pour éliminer autant que possible les tissus mous, à cet effet a été démontré qu'elle affecte ¹¹ des mesures de densité. Enveloppez les fémurs avec une gaze imbibée d'eau et stocker à-20C jusqu'à ce que vous êtes prêt à les analyser.

5. Analyse DXA aide d'un densitomètre Hologic QDR 4000 osseuse

1. Gaze imbibée dégel fémurs et le transfert à la suite Ostéodensitomètre.
2. Calibrer l'appareil selon le protocole du fabricant; s'assurer que les valeurs de BMC et BMD tombent dans les limites acceptables.
3. Placez un collimateur en laiton dans la machine. Cela permet à l'utilisateur de limiter la taille et l'angle du faisceau de rayons X pour se concentrer sur une cible spécifique.
4. Immerger le fémur décongelé dans une boîte de Pétri remplie d'eau (condyles vers la gauche, avec le parallèle fémur pour le lit), et le positionner juste à droite du laser.
5. Entrez une biographie (un titre descriptif qui inclut des informations d'identification des animaux, traitement, etc) pour le fémur vous êtes sur le scan.
6. Entrez numérisation à partir du menu Sélections, puis sélectionnez régiona salut-res. Indiquez vos paramètres de numérisation: Un balayage région de 2 x 0,7489 pouces, avec un interligne 0,01 pouces et résolution du point de 0,00499 pouce.
   Note: Surveiller le balayage alors qu'elle est en cours. Comme le faisceau de rayons X raster scanne l'échantillon, un contrôle pour s'assurer qu'il ya suffisamment d'eau dans la chambre pour couvrir complètement l'échantillon d'os.
7. Entrez Analyser dans le menu Sélection Analyse. Suivez les invites pour souligner le fémur entier comme un retour sur investissement. Une page de rapport sera venue l'calculée BMC (grammes) et la DMO (g / cm ^2).
8. Répétez ces étapes pour analyser les fémurs restant.
9. Consolider toutes vos données sur une seule feuille Excel et effectuer des analyses statistiques (test t).

6. Les résultats représentatifs:

La perte osseuse de la densité relative d'un tibia et le fémur de souris après lésion de la moelle épinière par rapport aux souris naïves est détectable en utilisant la méthode ci-dessus. Il ya une diminution significative de la densité détectable osseuse après10 jours seulement (12%, p <0,0005), avec jusqu'à 15% la perte de densité osseuse à 40 jours (p <0,0005, figure 4). Perte de densité osseuse dans le fémur a été observée à 40 jours après la lésion (diminution de 7%, p <0,05, figure 5). Ces résultats fournissent des preuves à l'usage des non-invasive imagerie par rayons X pour l'observation longitudinale du changement de densité osseuse après lésion de la moelle épinière.

Afin de comparer l'efficacité de cette méthode pour ce qui est actuellement disponible; nous avons analysé les fémurs excisés de ces souris 40 jours après des blessures à l'aide d'imagerie DXA. Une représentation de la sortie des données peut être vu dans la figure 6. Nous avons trouvé qu'il y avait une perte significative du contenu minéral osseux chez les souris par rapport à la SCI naïfs (12% de diminution, p <0,05, figure 7). La densité minérale osseuse n'a pas beaucoup changé, mais il n'a suivi une tendance similaire (figure 8). Ces résultats sont semblables à ceux trouvés dans la littérature; Picard et al ont observé une diminution de 13,5% (p <0,001) dans BMC, mais aucune decr significativela facilité de la DMO (Picard 2008).

Figure 1. Chronologie expérimentale.

Figure 2 Représentant de l'orientation arrière gauche-membre:. Une photographie) et b) x-ray.

Figure 3. Dimensions ROI et d'orientation au sein des régions du fémur proximal et le tibia.

Figure 4. Perte de densité osseuse après un traumatisme médullaire dans le tibia proximal 10, 20, 30 et 40 jours après la lésion (n = 5) par rapport à appariés selon l'âge naïfs (n = 5). Les barres d'erreur représentent SEM; ** p <0,005, *** p <0,0005.

Figure 6. Perte de densité osseuse après un traumatisme médullaire dans le fémur distal jours 10, 20, 30 et 40 après la blessure (n = 5) par rapport à témoins appariés par âge naïfs (n = 5). Les barres d'erreur représentent SEM; * p <0,01-0,05; ** p <0,001-0,01; *** p <0.0001 à 0.001; **** p <0,0001.

Figure 7. Image représentative de données DXA montrant BMC et de sortie DMO.

Figure 8. DXA analyse du contenu minéral osseux (en grammes) dans les fémurs de souris SCI 40 jours après la blessure (n = 5) vs appariés selon l'âge naïfs (n = 5).Les barres d'erreur représentent SEM; * p <0,05.

Figure 9. Analyse DXA de la densité minérale osseuse (mg / cm ²⁾ dans les fémurs de souris SCI 40 jours après l'accident (n = 5) vs appariés selon l'âge naïfs (n = 5). Les barres d'erreur représentent SEM; aucune différence significative.

Discussion

Cette étude présente un roman, méthode non invasive permettant d'évaluer les changements de densité dans les os individuels (tibias et fémurs) longitudinalement, au sein d'une seule cohorte de souris, en utilisant l'étrier IVIS Lumina XR système d'imagerie. SCI a entraîné une diminution de la densité osseuse dans les deux fémurs et tibias lorsqu'ils sont étudiés au sein d'une seule cohorte d'spinale-sectionné souris sur une période d'essai 40 jours par rapport à appariés selon l'âge, indemnes souris témoins,. Nos résultats dans le fémur ont été confirmés, post-mortem, par l'utilisation de la DXA, ce qui suggère que l'application de l'étrier Instruments IVIS Lumina XR peut servir comme un outil de mesure sensible pour évaluer les effets à long terme et progressive de SCI sur la perte osseuse .

Un avantage potentiel pour les chercheurs qui utilisent ce système est la possibilité de suivre le développement longitudinal des changements pathologiques dans les os des membres postérieurs des animaux suivants SCI. La capacité à évaluer une seule cohorte sur de longues périodes fournit errong avantages pour le chercheur en termes de: 1) les coûts associés à l'achat d'animaux et de soins de longue durée. Au lieu d'une étude nécessitant un grand nombre d'animaux qui doivent être sacrifiés à des moments spécifiques, afin d'évaluer les changements en fonction du temps, ces résultats pathologiques peuvent être suivies au sein de la même cohorte au cours de cette même période, 2) la variabilité: en plus de comparaison avec les cohortes de contrôle, les résultats générés au sein de la cohorte unique de sujets blessés peuvent être évalués et comparés entre les points de temps pour les mêmes animaux dans toute l'étendue de l'étude; une fois de plus, la réduction de la variabilité intra-animale, ainsi que la nécessité pour les grands cohortes de sujets expérimentaux.

Alors que l'étrier IVIS Lumina XR nous ont fourni des informations longitudinales importantes concernant le développement de l'ostéoporose induite par la SCI, il ya des limites qui devraient être considérés: 1) alors que cette plateforme nous a permis de générer à haute résolution des rayons X datune dans les os des membres postérieurs des souris après la SCI, son utilité peut être limitée à de petits rongeurs comme les souris. La hauteur maximale autorisée sous réserve au sein de la XR Lumina est de 2,8 cm. Tout ce qui dépasse cette hauteur ne peuvent être imagées avec succès en utilisant le composant X-ray de la XR Lumina. Dans nos mains, ce qui a empêché notre capacité d'étudier des rats dans le poids de 200 à 250 grammes. Bien qu'il soit possible de rats image par cette gamme de poids ou d'autres rongeurs comme les hamsters ou les gerbilles, cela va nécessiter des tests supplémentaires par la PI. 2) l'orientation mixte. Il est essentiel que l'enquêteur attentivement arranger les branches dans une orientation facilement reproductible qui permette de comparaison réussie entre les séances d'imagerie. La normalisation du placement permettra à un membre de l'enquêteur de générer et d'appliquer standardisés ROI qui peuvent être enregistrés et appliqués sur les deux sujets et le temps.

Globalement, nous pensons que l'IVIS Lumina XR offre une excellente plate-forme avec laquelle le modèlele développement de la SCI-dépendante l'ostéoporose chez la souris. La possibilité d'étudier la perte osseuse longitudinalement dans la cohorte la même souris va nous permettre de: 1) mieux comprendre la nature temporelle de la perte osseuse et la déminéralisation après un traumatisme médullaire, 2) déterminer si ces changements se stabiliser au cours du temps, 3) d'explorer, avec la disponibilité de deux lignées de souris transgéniques et nulle, la possibilité d'étudier les mécanismes moléculaires sous-tendant ces changements pathologiques de manière réductrice, et 4) très probablement l'avantage le plus important, commencer à tester de nouvelles interventions conçues pour soit empêcher le développement de l'ostéoporose dans les premiers stades de blessure, ou d'inverser ces modifications une fois que l'ostéoporose a déjà développé. Enfin, le XR Lumina, en plus d'offrir un excellent potentiel de l'imagerie à rayons X, peut également être utilisée pour étudier les deux signaux bioluminescents et fluorescents dans les animaux vivants. On pourrait facilement imaginer incorporant les autres modalités offertes au sein de ce système pour regarder une multitude de facteurs qui déterminent la dynamique de l'os de façon mécaniste suivants SCI ou toute autre maladie processus qui aboutit à l'ostéoporose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beuthanasia	Butler Animal Health Supply	001848
Ketathesia (Ketamine Hydrochloride)	Butler Animal Health Supply	023061
Xylazine	Butler Animal Health Supply	037849
Bupivicaine	Butler Animal Health Supply	021801
Gelfoam; 7MM	Fisher Scientific	NC0085178	To promote hemostasis during surgery
IVIS Lumina XR	Caliper Life Sciences	135400
ZFOV, 2.5 cm field of view lens	Caliper Life Sciences	127285	Absolutely necessary to generate high magnification X-ray images of bone structure
QDR Bone Densitometer	Hologic		Model used no longer in production