Summary
De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.
Abstract
De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por linfócitos efetores CCR7-T de memória que infiltram o local da injeção de um antígeno contra o qual o sistema imunológico tem sido preparado. A reação inflamatória é caracterizada por vermelhidão e inchaço do local de desafio antigênico. É um modelo conveniente para determinar a eficácia in vivo de imunossupressores. DTH cutânea pode ser induzida ou por transferência adotiva de linfócitos T antígeno-específicos ou por imunização ativa com um antígeno e subseqüente desafio intradérmico com o antígeno para induzir a reação inflamatória da pele em uma área determinada. Respostas DTH pode ser induzida a vários antígenos, para a ovalbumina exemplo, a tuberculina, toxóide tetânico, ou hemocianina limpet buraco da fechadura. Tais reações também pode ser induzida contra autoantígeno, por exemplo, para proteína básica da mielina (MBP) em ratos com encefalomielite auto-imune experimental induzida com MBP, um modelo animal para a esclerose múltipla (1). Aqui demonstramos como para induzir uma reação adotivos DTH em ratos Lewis. Vamos primeiro estimulam as células T específicas ovalbumina in vitro e injetar essas células ativadas por via intraperitoneal em ratos ingênuos. Depois de permitir que as células para equilibrar in vivo por 2 dias, vamos desafiar os ratos com ovalbumina no pavilhão auricular de uma orelha, enquanto a outra orelha wil receber solução salina. A reação inflamatória será visível 3-72 horas depois e espessura de ouvido será medido como uma indicação da gravidade da DTH.
Protocol
1. Estimulação dos linfócitos T específicos ovalbumina
Descansando células ovalbumina específico T são estimuladas com ovalbumina na presença de ratos irradiados timócitos Lewis (30 Gy) como células apresentadoras de antígenos (APCs), no Médio Estimulação (Prepare em DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitaminas + + 2ME Rat Serum + ovalbumina, nas concentrações finais observou na lista de materiais.)
Preparação do soro de ratos
- Tomamos soro dos ratos nos sacrificamos como doadores timo.
- Os ratos são profundamente anestesiado por inalação de halotano e tanto sangue quanto possível é desenhada por perfusão cardíaca (50-10 ml por rato), utilizando 10 seringas ml e 23 G 1 "agulhas, após o que os ratos são imediatamente decapitado para garantir a morte.
- O sangue é permitida a coagular por 10 min a 37 ° C seguido por 10 min no gelo.
- O coágulo é removido eo líquido restante fiadas.
- O soro é coletado, filtrado estéril e armazenado a -20 ° C.
Preparação das células apresentadoras de antígenos
- Leve o timo de um rato decapitado utilizando instrumentos estéreis e colocá-lo em PBS contendo penicilina e estreptomicina (PBS-PS), sobre o gelo.
- Leve o timo de um capuz de cultura de tecidos, limpe-o de coágulos sanguíneos e tecido contaminar outras e corte-o em pequenos pedaços em uma peneira de células (Fisher # 08-771-2) colocado em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de PBS- PS.
- Cada peça é pressionado através do filtro de células usando as costas de um êmbolo da seringa estéril 1 ml. Recolher a suspensão única célula em um tubo de 50 ml no gelo.
- Lavar o filtro de células com 20-40 ml de PBS mais-PS. Centrifugar a suspensão de 1250g e ressuspender o sedimento em PBS-PS, 5 ml / timo, sobre o gelo.
- Irradiar esta suspensão (30 Gy) em um irradiador gama e lave-o duas vezes com 50 ml de PBS-PS.
Nota: O melhor doadores timo são ratos adultos jovens, 5-7 semanas de idade. Ratos até 10 semanas pode ser usado, mas o número de células diminui com o tempo. Sexo não é importante, embora algumas pessoas dizem que os homens são melhores doadores timo. Nós sempre usamos fêmeas porque todos os nossos animais são alojados no mesmo quarto e nós não queremos homens e mulheres na mesma sala.
Estimulação
- Lavar os linfócitos T uma vez e contá-las.
- Contar as células apresentadoras de antígenos.
- Mix 3 x 10 6 ovalbumina específicas de células T com 150 x 10 6 APCs em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de meio de estimulação.
- Incubar por 48 horas a 37 ° C.
2. Transferência adotiva dos linfócitos T específicos ovalbumina
- Os ratos que usamos como destinatários são do sexo feminino 70-10 semanas de idade.
- Contar os linfócitos T, elas devem ser grandes e redondos. As células apresentadoras de antígenos será morto.
- Centrifugar os linfócitos T e ressuspenda-los em 10 x 10 6 células / ml em PBS.
- Injectar 1 ml por via intraperitoneal com 3 seringas ml e 23 G 1 "agulhas.
3. Desafio com antígeno no ouvido
- Dois dias após a transferência adotiva, injetar 20 l de 1 mg / ml solução ovalbumina (= antígeno relevante) por um ouvido e salinas (ou antígeno irrelevante) na outra orelha. Não filtrar a solução antígeno como você pode perder agregados que aumentam a reação inflamatória.
Nota: Os ratos devem ser anestesiados para evitar movimentos. Se você é destro, segure a orelha entre o polegar eo dedo indicador esquerdo, o dedo indicador estar dentro da orelha e do rato voltado para você.
- Injetar a solução no pavilhão da orelha usando 27G ½ "agulhas. Tente injetar todos os ratos exatamente no mesmo lugar.
4. Medição de DTH
- O ouvido começa a ficar vermelha e inchar como um sinal de inflamação. Medir a espessura de cada orelha com um micrômetro de mola (por exemplo modelo PK-0505 da Mitutoyo).
- Tome 5-6 medições para cada orelha em cada ponto do tempo e calcular a média.
- O inchaço máxima deve ocorrer entre 24 e 72 horas.
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Discussion
O desafio antigênico também pode ser realizada em outros locais, por exemplo, na pele do dorso (2). Nós, no entanto descobrir que um desafio. Usando o pavilhão da orelha, como mostra este vídeo, permite a medição mais precisa da reação DTH.
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Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemanha) para fornecer-nos com a GFP-rotulados, linha de células T específicas ovalbumina utilizado neste protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
