Summary
세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.
Abstract
혈류 감염 때문에 패혈증의 가능성이 발현, 심한 패혈증 및 패혈증에 의한 쇼크 1의 높은 사망률 속도와 관련된. 따라서 적절한 항생제 치료의 급속한 행정부는 혈류 감염의 치료에 제일 중요합니다. 이 과정에서 중요한 요소는 박테리아 식별 및 항생제 자화율 시험의 결과에 크게 의존 타이밍입니다. 이러한 매개 변수 모두가 일상적으로 시간이 많이 소요되며 평균 24~48시간 2, 4를 취한다 문화 기반 테스트에 의해 얻을 수 있습니다. 연구의 목적은 DNA를 기반 혈류 감염의 신속한 식별을위한 assays뿐만 아니라, 신속한 항균 자화율 시험을 개발하는 것이었습니다. 첫 번째 분석은 종 또는 속 특정 프로브 5 보완 rDNA 기반 실시간 PCR 분석 eubacterial 16입니다. 이러한 프로브, 모나스 종을 포함한 그람 음성 박테리아를 사용하여., 녹농균이그리고 대장균뿐만 아니라 포도상 SPP., 포도상 구균, Enterococcus SPP., 연쇄상 구균 SPP. 및 연쇄상 구균 pneumoniae를 포함한 그람 양성 세균은 구분할 수 있습니다. 이 multiprobe 분석을 사용하여 원인이되는 미생물의 첫번째 식별은 2 시인데 후에 주어졌다.
둘째, 우리는 S.의 항생제 자화율 테스트를위한 세미 분자 분석을 개발 구균, Enterococcus 종. 그리고 (통성) aerobe 그람 음성 막대 6. 이 분석은 PCR은 세균 7의 성장을 측정하는 데 사용된하는 연구를 기반으로했다. 혈액 배양에서 직접 수확한 박테리아는 항생제의 선택 6 H 위해 incubated 및 Sybr 그린 기반 실시간 PCR 분석을 따라하는 것은 성장 억제를 결정합니다. 이 두 방법의 조합은 같은 날 (그림 1)에 대한 적절한 항생제 치료의 선택을 안내할 수 있습니다. 결론적으로신분증과 항생 자화율 모두, 분자 분석은 병원균 검출을위한 빠른 대안을 제공하고 혈류 감염의 진단을 향상시킬 수 있습니다.
Protocol
부 I : 병원균 식별
1. 샘플 준비
참고 : 다음과 같은 프로토콜에서 설명하는대로 전체 분자 흐름이 분자 진단에있어서의 품질 보증 3에 대한 권장 사항에 따라 수행되어야한다.
- 1시 10분 희석 샘플이 될 1.5 ML 반응 관에 0.9 % NaCl 0.9 ML에 혈액 문화의 0.1 ML의 나누어지는을 추가합니다. (희석 qPCR 억제를 방지하기 위해서).
- 펠렛 5 분 박테리아 DNA를 13,400 XG에서 샘플을 원심 분리기.
- 100 μl 멸균 demineralised H 2 O를 안에 세균 펠릿을 Resuspend
- 4 ° C까지 추가로 사용에서 DNA 샘플을 보관합니다.
2. 식별 분석 : 실시간 16 rDNA PCR
- 다음과 같이 반응 섞어 준비합니다. 분석은 시료 당 4 개의 별도의 반응으로 구성되어 있습니다. 각 혼합물은 12.50 μl 마스터를 포함믹스, 0.9 μm의 순방향 프라이머 (5 TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0.6 μm의 역방향 프라이머 (5 GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 프로브의 패널. 프로브의 금액은 아래에있는 네 개의 별도의 반응 각각에 대해 제공됩니다.
- 첫 번째 반응은 다음과 같습니다
- 0.2 μm의 범용 프로브 (5-식구들-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0.2 μm의 P. 녹농균이라는 박테리아 프로브 (5 조-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- 두 번째 반응은 다음과 같습니다
- 0.2 μm의 E. 대장균 프로브 (5 조-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0.2 μm의 모나스 종. 프로브 (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- 세 번째 반응이 포함됩니다 :
- 0.2 μm의 포도상 SPP. 프로브 (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0.2 μm의 S. 구균 프로브 (5-식구들-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0.2 μm의 Enterococcus 종. (5 - 죠 - TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- 네 번째 반응이 포함됩니다 :
- 0.2 μm의 범용 프로브 (5-식구들-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0.3 μm의 연쇄상 구균 SPP. 프로브 (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0.2 μm의 S. pneumoniae 프로브 (5 조-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- 20 μl의 총 볼륨에 도달 멸균 demineralised H 2 O를 추가합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트의 우물 각 반응 혼합물 20 μl를 추가합니다.
- 각도에 샘플의 5 μl를 추가합니다.
- 96 - 웰 PCR 플레이트를 밀봉하는 접착제 필름을 사용합니다.
- 다음과 같은 최적의 온도 사이클 조건을 사용하여 ABI 프리즘 7900HT 리얼 타임 PCR 시스템에 접시를 실행합니다 :
- 10 분 대한 ° C에서 50 미리 가열
- 15 분 95 ° C에서 초기 변성
- 42주기
- 15의 95 ° C에서 변성
- 1 분 동안 60 ° C에서 풀림
3. 결과의 분석
탭 분석 설정에서 0.1 CT 분석의 한계를 조정합니다. 6 월말 (주기) : 15 시작하는 기준 구성 (주기)를 좁힐.
- 모든 샘플에 대한주기 임계값 (CT) 값을 기록합니다. 긍정으로서 PCR 결과를 고려할 컷 - 오프 값은 35 CT-값으로 설정할 수 있습니다. 혈액 배양에 존재하는 박테리아의 양은 CT-값을 35 이하로 발생, 10 7 10 11 CFU / ML로 원거리.
부 II : 항생제 자화율 시험
4. 긍정적인 혈액 배양 9 시부터 박테리아의 분리
- 긍정적인 혈액 배양 병에서 국물의 5 ML을 기음과 혈청 분리관에 그 파일을 전송합니다.
- 10 분 2000 XG에서 혈청 분리관을 원심 분리기.
- 혈청 분리관에서 뜨는 폐기하십시오.
- 전송 BACteria는 멸균 면봉으로 튜브 겔 층에서 0.9 %의 식염수에 0.5 맥팔랜드 표준 정지 얻을 때까지.
5. 마이크로 Titre 플레이트의 접종
- 5 × 10 5 CFU / ML의 현탁액을 형성하는 두 농축 뮐러 Hinton II 국물의 0.5 맥팔랜드 서스펜션을 희석.
- 항생제 (표 1)의 선택을 포함하는 마이크로 titre 플레이트의 우물이 서스펜션을 추가합니다.
- 6 H에 대해 37 ° C에서 마이크로 titre 판을 품어.
- 4 ° C (마이너스 성장 제어 등)에 정지 나누어지는을 저장합니다.
- 부화 6 H 후, 멸균 튜브에 각 우물의 콘텐츠를 전송할뿐만 아니라, 부정적인 성장 제어 샘플 4 ° C.에 저장된되었다 그
- 5 분 용 16,000 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 조심스럽게 세균성 펠렛을 방해하지 않고, 표면에 뜨는를 제거합니다.
- 멸균 demineralised H에 펠릿을 Resuspend
- 멸균 demineralised H 2 O에 동안 10 배 샘플을 희석
6. 실시간 16 rDNA PCR 10
- 다음과 같이 PCR 혼합물 준비 :
- 12.50 μl IQ SYBR 녹색 Supermix
- 앞으로 0.5 μm의 프라이머 16-1 (5 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0.25 μm의 역방향 프라이머의 16-2 (5 TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- 20 μl의 총 볼륨에 무균 demineralised H 2 O
- 96 - 웰 PCR 플레이트의 우물에 PCR 혼합물의 20 μl를 추가합니다.
- 각도에 샘플의 5 μl를 추가합니다.
- 96 - 웰 PCR 플레이트를 밀봉하는 접착제 필름을 사용합니다.
- 다음과 같은 최적의 온도 사이클 조건을 사용하여 MyiQ 단일 컬러 리얼 타임 PCR 검출 시스템에 접시를 실행합니다 :
- 4 분 95 ° C에서 초기 변성
- 초기는 ° C ~ 30의 65에서 풀림
- 35주기
- 9시 변성15의 5 ° C
- 1 분 동안 60 ° C에서 풀림
- (° C ~ 0.57 ° C 단위로 20 분 안에 60-95에서) 곡선 분석을 용융
7. 결과의 분석
- 다음 수식 (항생제의 종류에 따라) 중 하나를 사용하여 절단 CT 값을 계산합니다.
- 일반적으로 :
컷 - 오프 CT 값 = CT 값 긍정적인 성장을 제어 + 0.5 X (CT 값 마이너스 성장 관리 - CT 값 긍정적인 성장을 제어) - Piperacillin, piperacillin / tazobactam과 그람 음성 막대의 ceftazidime, Amoxicillin, oxacillin과 트리 메소 / S.aureus의 설파 메 톡 사 졸, Enterococcus SPP의 Amoxicillin :. 컷 - 오프 CT 값 = CT 값 긍정적인 성장을 제어 + 0.25 X (CT 값 마이너스 성장 제어 - CT 값 긍정적인 성장을 제어)
- 일반적으로 :
- 긍정적인 성장 관리로 멸균 demineralised H 2 O와 incubated 샘플을 사용하십시오.
- 미생물에 따라 적절한 제외어 성장 제어를 사용합니다 :
- 그람 음성 막대 샘플은 항생제의 혼합으로 incubated
- Enterococcus SPP. 샘플은 4 ° C에 보관
- S.aureus 샘플은 4 ° C에 보관
- 자화율 (S) 또는 다음과 같이 테스트 항생제에 대한 변형의 저항 (R) 결정 :
- 컷 - 오프 CT 값보다 높은 CT 값은 느끼기 쉬운 상태를 나타냅니다
- 컷 - 오프 CT 값보다 낮은 CT 값은 저항을 나타냅니다
8. 대표 결과
두 모델 생물은 그람 음성 E. 즉 대장균 및 그람 양성 S. 구균은 세균성 병원균과 그 항균 프로파일의 결정 탐지 및 식별을위한 통합 절차를 시각화하기 위해 선택됩니다. 프로토콜의 첫 번째 부분은 병원균 식별로 구성되어 있습니다. Specific 프로브들은 8 임상 관련 미생물의 검출을 위해 설계되었습니다. 세균성 패널에 포함된 대상의 존재에 증폭 곡선이 생성되고 CT 값 (그림 2) 계산됩니다. 긍정으로서 PCR 결과를 고려할 컷 - 오프 값은 35 CT 값으로 설정됩니다. 그림 2A에서 E.coli에 감염된 혈액 문화의 신분 프로필이 표시됩니다. 16 범용 프로브라는 두 개의 독립된 반응 혼합물에 포함되어 있으며 결과적으로이 증폭 곡선 (25.20 및 25.95의 CT) 생성됩니다. 세 번째 신호는 E.위한 프로브 특정에서 파생됩니다 대장균 (27.04 중 CT). S.의 식별 구균에 감염된 혈액 문화는 그림 2B에 표시됩니다. 16 범용 프로브는 33.35과 33.71의 증폭 신호를 가지고 있습니다. 남은 두 신호는 황색 포도상 SPP 특정 프로브에서 파생됩니다. 그리고 S. 구균 (32.48 및 30.59의 CT).
그림 3도 표시되었다 E.coli 변형을 나타내는 항생제 자화율 시험 증폭 플롯의 예입니다 그림 2A 인치 각 라인은 세균 샘플로 incubated되었다 싶고, 항생제를 나타냅니다. 낮은 CT 값을 가진 샘플은 성장이 테스트 항생제에 대한 항생제, 나타내는 저항의 면전에서 오류가 발생하였습니다있는 샘플입니다. 반대로, 높은 CT 값이 더 성장 때문에 테스트 항생제에 대한 항생제, 표시 자화율의 효과적인 작동 중에 발생하지 않은있는 샘플을 나타냅니다. 표 1 중에 항균 프로필의 결정을 보여줍니다 대장균 및 S. 구균의 분리합니다. 모든 CT 값은보고하고, 프로토콜 텍스트 (7.1)에서 설명한 수식을 사용하여, 두 컷 - 오프 CT 값은 calcu 있습니다저항 및 자화율 구별 lated. 보고된 CT 값이 계산 컷 - 오프 CT 값 (및 그 반대)보다 낮으면 변형은 항생제에 강한 것입니다.
rDNA PCR 실시간 기가 사용 병원균 식별 및 항생제 자화율 시험 절차의 그림 1. 플로우 차트.
그림 2 인식 분석 :. 증폭 플롯과 사이클 문턱 값 (CT 값) 특정 프로브는 인과 병원체의 식별에 사용되는 반면 긍정적인 혈액 문화, 유니버설 16 rDNA 탐침에 의해 감지된다.. 혈액 문화의 A.의 증폭 줄거리는 엑스타시를 포함하는 대장균, S.를 포함하는 혈액 문화의 바실러스 증폭 줄거리 구균, Pseu AE, Pseudomon박테리아와 같은, 유니, 16 범용 프로브, Ecoli, 에스 대장균 프로브, Pseu SP, 모나스 종. 프로브, S. pneu, 연쇄상 구균 pneumoniae 프로브, Strep SP, 연쇄상 구균 SPP. 프로브, 힘들어, Enterococcus 종. 프로브, S. 구균, 포도상 구균 프로브, 포도상 SP, 포도상 SPP. 프로브.
중에 항생제 자화율 테스트 그림 3. 증폭 줄거리 대장균은 (예제 1) 분리. 각 곡선이 변형이 함께 incubated되었다 싶고, 항생제를 나타냅니다. 초기 신호는 변형이 테스트 항생제의 면전에서 성장하고 항생제에 대한 내성 따라서는 것을 의미 높은 세균 하중에 의해 발생합니다. 늦은 신호 변형율은 항생제의 면전에서 성장하지 않은 것을 의미, 즉, 그것은 쉽습니다.
| 예제 1 : E. 대장균 | 예제 2 : S. 구균 | ||||
| 대서양 표준시 | CT | R / S | 대서양 표준시 | CT | R / S |
| Amoxicillin 8 MG / L | 16,83 | R | Amoxicillin 0.25 MG / L | 21,03 | R |
| Amoxicillin-clavulanate 4분의 8 MG / L | 17,36 | R | Oxacillin이 MG / L | 25,80 | S |
| Piperacillin 16 MG / L | 16,67 | R | Vancomycin이 MG / L | 25,20 | S |
| Piperacillin-tazobactam 16 /4 MG / L | 24,15 | S | Gentamicin 4 MG / L | 25,86 | S |
| * 시프 로플 록 사신 1 MG / L | 29,72 | S | 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸 38분의 2 MG / L | 24,62 | S |
| Ceftazidime 1 MG / L | 24,03 | S | |||
| Ceftazidime 8 MG / L | 26,58 | S | |||
| Gentamicin 4 MG / L | 29,83 | S | |||
| 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸 38분의 2 MG / L | 27,60 | S | |||
| 마이너스 성장 제어 (항생제의 혼합물) | 30,41 | 마이너스 성장 제어 (샘플은 4 ° C에 보관) | 27,42 | ||
| 긍정적인 성장 제어 | 16,90 | 긍정적인 성장 제어 | 20,22 | ||
| 컷 - 오프 CT-값 1 * | 21,76 | 컷 - 오프 CT-값을 1 *** | 23,82 | ||
| 컷 - 오프 CT-값 2 ** | 18,75 | 컷 - 오프 CT-값 2 **** | 22,02 | ||
| * amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, * 시프 로플 록 사신, gentamic 위해트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸에서 ** piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidime에 대한 | vancomycin과 gentamicin을 위해 *** **** amoxicillin, oxacillin과 트리 메소 - 설파 메 톡 사 졸의 경우 |
표 1. 두 샘플 (E.coli와 S.aureus)의 항생제 자화율 시험의 결정. PCR-검정의 CT 값이 자동으로 프로토콜 텍스트에 표시된 수식을 사용하여 긍정적이고 부정적인 성장 컨트롤에서 두 컷 - 오프 CT의 alues을 계산 수있는대로이 Excel 파일에 복사되었습니다. 항생제는 컷 - 오프 CT 값보다 CT 값을 낮게 나타나면 CT 값이 절단보다 높은 아니었다면, 변형은 항생제에 강한이며, 변형은 쉽습니다.
Discussion
여기에서 설명한 프로토콜은 병원체의 급속한 식별을 가능하게함으로써 혈류 감염 환자의 예후를 개선하는 적절한 항생제의 조기 관리로 이어질 수있는 기능성 항균 프로파일을 제공합니다. 시험 요청한 조건에 따라 최소 즉 저렴한 비용, 높은 처리량은 설정 - 주변의 시간, 테스트 조건 조정할 수 있습니다. 모든 절차가 하나 근무일 이내에 수행할 수 있습니다. 또한 프로토콜의 두 부분이 크게 이정표 주위에 시간을 단축하는 동시에 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된대로 식별 패널은 우리 병원에서 가장 임상적으로 관련성이 높은 박테리아의 선택입니다. 주요 원칙은 16 유전자 영역을 목표로하고 있기 때문에, 다른 미생물에 대한 구체적인 프로브 설계 및 분석에 추가할 수 있습니다. 완전한 분석은 원래 혈액 배양의 신속한 분석을위한되었다뿐만 아니라 O의 처리에 사용될 수 있습니다군터 샘플 자료. 이것은 또한 항생제 자화율 시험에 사용된 항생제의 경우 : 자세한 또는 다른 항생제는 로컬 저항 패턴 및 가이드라인을 바탕으로 추가할 수 있습니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Profileringsfonds azM (PF245)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
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