Summary
Utformningen av en enkel en dag arbetsflöde system för bakteriell patogen diagnostik gör det möjligt att snabbt erkännande av blodomloppet infektioner. Införandet av åtta kliniskt relevanta bakterier mål och deras antibiotika profiler resistens ger läkaren en första inblick i samma dag, vilket kan leda till mer adekvat behandling.
Abstract
Blodomloppet infektioner är förknippade med hög dödlighet på grund av den troliga manifestation av sepsis, svår sepsis och septisk chock 1. Därför är snabb administration av tillräcklig antibiotisk terapi av största betydelse vid behandling av infektioner i blodomloppet. Den kritiska element i denna process är timing, starkt beroende av resultaten av bakteriell identifiering och antibiotika resistensbestämning. Båda dessa parametrar rutinmässigt erhålls genom kultur-baserade tester, vilket är tidskrävande och tar i genomsnitt 24-48 timmar 2, 4. Syftet med studien var att utveckla DNA-baserade analyser för snabb identifiering av blodomloppet infektioner, liksom en snabb resistensbestämning. Den första analysen är en eubakteriella 16S rDNA-baserade realtids-PCR-analys kompletteras med arter-eller genus-specifika prober 5. Med användning av dessa prober, gram-negativa bakterier, däribland Pseudomonas spp.., Pseudomonas aeruginosaoch Escherichia coli såväl som grampositiva bakterier inkluderande Staphylococcus spp.., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.., Streptococcus spp.., och Streptococcus pneumoniae kunde urskiljas. Med hjälp av denna Multiprobe analys gjordes en första kartläggningen av den orsakande mikroorganismen ges efter 2 timmar.
För det andra, utvecklade vi en semi-molekylär analys för antibiotika resistensbestämning av S. aureus, Enterococcus spp.. och (valfritt) aeroba gramnegativa stavar 6. Denna analys baserades på en studie i vilken PCR användes för att mäta tillväxten av bakterier 7. Bakterier skördas direkt från blododlingar inkuberas under 6 h med en selektion av antibiotika, och efter en SYBR Green-baserad realtids-PCR-analys bestämmer inhibering av tillväxt. Kombinationen av dessa två metoder kan styra valet av en lämplig antibiotisk terapi på samma dag (Figur 1). Sammanfattningsvis, Molekylär analys av både identifiering och antibiotikakänslighet erbjuder ett snabbare alternativ för detektion av patogener och skulle kunna förbättra diagnosen blodomloppet infektioner.
Protocol
DEL I: identifikation av patogener
1. Provberedning
Obs: Hela molekylära arbetsflödet som beskrivs i följande protokoll ska utföras enligt rekommendationer för kvalitetssäkring i molekylär diagnostik 3.
- Tillsätt en 0,1 ml alikvot av blododling till 0,9 ml 0,9% NaCl i en 1,5 ml reaktionsrör att bli en 1:10 utspätt prov. (Späd för att förhindra qPCR inhibering).
- Centrifugera provet vid 13.400 xg under 5 minuter för att pelletera bakteriellt DNA.
- Resuspendera den bakteriella pelleten i 100 pl sterilt avjoniserat H 2 O.
- Lagra DNA-provet vid 4 ° C tills vidare användning.
2. Identification Test: Real-time 16S rDNA PCR
- Framställa reaktionsblandningar enligt följande. Analysen består av fyra separata reaktioner per prov. Varje blandning innehåller 12,50 ul mästareblandning, 0,9 | iM framåtriktad primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 ^ M omvänd primer (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 och en panel av prober. Mängden av prober anges för var och en av de fyra separata reaktioner i nedan.
- Den första reaktionen ingår:
- 0,2 | iM universell prob (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0,2 | iM P. aeruginosa sond (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- Den andra reaktionen inkluderar:
- 0,2 | iM E coli sond (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 | iM Pseudomonas spp.. sond (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- Den tredje reaktionen inkluderar:
- 0,2 | iM Staphylococcus spp.. sond (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0,2 pM S. aureus sond (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0,2 | iM Enterococcus spp.. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- Den fjärde reaktionen inkluderar:
- 0,2 | iM universell prob (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 | iM Streptococcus spp.. sond (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0,2 pM S. pneumoniae sond (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Tillsätt steril avmineraliserat H 2 O för att nå en total volym på 20 pl. Tillsätt 20 pl av varje reaktionsblandning till brunnarna i en 96-brunnars PCR-platta.
- Tillsätt 5 | il prov i varje brunn.
- Använda en adhesiv film för att täta 96-brunnars PCR-platta.
- Köra plattan på ABI PRISM 7900HT realtids-PCR System med användning av följande optimala termiska cykliska betingelser:
- Förvärmning vid 50 ° C under 10 minuter
- Initial denaturering vid 95 ° C under 15 min
- 42 cykler av
- Denaturering vid 95 ° C under 15 s
- Hybridisering vid 60 ° C under 1 min
3. Analys av resultaten
Justera tröskeln till Ct Analysis till 0,1 på fliken Inställningar Analysis. Begränsa utgångsläget konfigurationer Start (cykel): 6 och End (cykel): 15.
- Spela cykeln tröskeln (Ct) värde för alla prover. Cut-off värde att överväga ett PCR-resultat som positiv kan sättas till en Ct-värdet av 35. Mängden bakterier som finns i blod kulturer varierade från juli 10 - November 10 CFU / ml, vilket genererar Ct-värden lägre än 35.
DEL II: antibiotikakänslighet TEST
4. Isolering av bakterier från positiva blododlingar 9
- Aspirera 5 ml buljong från en positiv blododling flaskan och överföra det till ett serum separator rör.
- Centrifugera serumseparator röret vid 2000 xg under 10 min.
- Kasta bort supernatanten från serumet separatorröret.
- Transfer bacterier från gellagret av röret med en steril bomullstopp i 0,9% saltlösning till dess att en 0,5 McFarland-standard suspension erhålles.
5. Ympning av Micro titerplattor
- Späda 0,5 McFarland suspension i dubbel koncentrerad Mueller Hinton II buljong för att bilda en suspension av 5 x 10 5 CFU / ml.
- Lägga till denna suspension till brunnarna i en mikro-titer-platta innehållande ett urval av antibiotika (tabell 1).
- Inkubera mikro-titer plattan vid 37 ° C under 6 timmar.
- Lagra en delmängd av suspensionen vid 4 ° C (som negativ tillväxt-kontroll).
- Efter 6 timmars inkubering överföra innehållet i varje brunn i en steril slang, liksom det negativa tillväxtkontroll prov som lagrades vid 4 ° C.
- Centrifugera rören vid 16000 x g under 5 minuter.
- Försiktigt avlägsna supematanten, utan att störa den bakteriella pelleten.
- Återsuspendera pelleten i sterilt avjoniserat H
- Späda proven 10-faldigt i sterilt avmineraliserat H 2 O
6. Real-time 16S rDNA PCR 10
- Bered PCR-blandningen enligt följande:
- 12,50 ul iQ SYBR Green Supermix
- 0,5 | iM framåtriktad primer 16S-en (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0,25 ^ iM omvänd primer 16S-2-(5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- sterilt demineraliserat H2O till en total volym av 20 pl
- Tillsätt 20 pl av PCR-blandning till brunnarna i en 96-brunnars PCR-platta.
- Tillsätt 5 | il prov i varje brunn.
- Använda en adhesiv film för att täta 96-brunnars PCR-platta.
- Kör plattan på MyiQ en färg Real-Time PCR Detection System, under användning av följande optimala termiska cykliska betingelser:
- Initial denaturering vid 95 ° C under 4 minuter
- Initial härdning vid 65 ° C under 30 s
- 35 cykler av
- Denaturering på 95 ° C under 15 s
- Hybridisering vid 60 ° C under 1 min
- Smält kurva analys (från 60-95 ° C i 20 min med steg om 0,57 ° C)
7. Analys av resultaten
- Beräkna cut-off-Ct-värdet med användning av en av följande formler (beroende på typen av antibiotikum).
- I allmänhet:
Cut-off Ct värde = Ct-värdet positiv tillväxt kontrollen + 0,5 x (Ct-värdet negativ tillväxt kontroll - Ct-värdet positiv tillväxt kontroll) - Piperacillin, piperacillin / tazobaktam och ceftazidim i Gram-negativa stavar, Amoxicillin, oxacillin och trimetoprim / sulfametoxazol i S. aureus, Amoxicillin i Enterococcus spp.:. Cut-off Ct värde = Ct-värdet positiv tillväxt kontrollen + 0,25 x (Ct-värdet negativ tillväxt kontroll - Ct-värdet positiv tillväxt kontroll)
- I allmänhet:
- Använd provet inkuberas med steril avmineraliserat H 2 O som positiv tillväxt kontroll.
- Beroende på mikroorganismen, använda rätt negativ tillväxt kontroll:
- Gram-negativa stavar Prov inkuberades med blandning av antibiotika
- Enterococcus spp.. Prov lagrades vid 4 ° C
- S.aureus Prov lagrades vid 4 ° C
- Bestämma känsligheten (S) eller motståndet (R) av stammen för den testade antibiotikumet enligt följande:
- En Ct-värdet högre än cut-off Ct värde anger känslighet
- En Ct-värdet är lägre än cut-off Ct värde anger motståndet
8. Representativa resultat
Två modellsystem organismer, dvs en Gram-negativ E. coli och en grampositiv S. aureus, är valda för att visualisera det kombinerade förfarandet för detektering och identifiering av bakteriella patogener och fastställandet av deras antimikrobiella profil. Den första delen av protokollet omfattar identifikation av patogener. Specifika prober är utformade för detektionen av åtta kliniskt relevanta mikroorganismerna. I närvaro av en mål inkluderas i den bakteriella panelen är amplifierings-kurvor genererades och Ct-värdena beräknas (figur 2). Cut-off värde att överväga ett PCR-resultat som positiva sätts till en Ct-värdet av 35. I figur 2A är identifieringen profilen av en E. coli-infekterade blododling visas. 16S universella Sonden ingår i två separata reaktionsblandningar och därmed genererar två amplifieringskurvor (Ct för 25,20 och 25,95). Den tredje signalen är härledd från den sond som är specifik för E. coli (Ct i 27,04). Identifieringen av en S. aureus-infekterat blod odling visas i figur 2B. 16S universell prob har förstärkningssignaler från 33,35 och 33,71. De två återstående signaler härleds från de sönder som är specifika för Staphylococcus spp.. och S. aureus (Ct i 32,48 och 30,59).
Figur 3 är ett exempel på ett antibiotikum resistensbestämning förstärkning intrig, som representerar E.coli stam som också visades i fig 2A. Varje linje representerar en antibiotikum som den bakteriella provet inkuberades med. Ett prov med en låg Ct-värdet är ett prov i vilket tillväxten har skett i närvaro av ett antibiotikum, som indikerar motstånd mot det testade antibiotikumet. Tvärtom innebär en hög Ct-värdet ett prov i vilket ingen tillväxt har skett på grund av den effektiva driften av antibiotikumet, vilket indikerar mottaglighet för det testade antibiotikumet. Tabell 1 illustrerar bestämningen av den antimikrobiella profilen hos E. coli och S. aureus-isolat. Alla Ct-värden redovisas och med hjälp av formler som nämns i protokollet texten (7,1), två cut-off Ct-värden är beräknasreglerad för att skilja mellan resistens och känslighet. Stammen är resistent mot antibiotikumet om den rapporterade Ct-värdet är lägre än det beräknade cut-off-Ct-värdet (och vice versa).
Figur 1. Flödesschema av patogenen identifiering och antibiotikakänslighet testproceduren med real-time 16S rDNA PCR.
Figur 2 Identifiering analysen. Amplification tomter och cykel tröskelvärden (Ct-värden) En positiv blododling detekteras av den universella 16S rDNA proben, medan de specifika prober används för identifiering av kausala patogenen.. A. förstärkning tomt på blod kultur innehållande E. E. coli, B. förstärkning plot av blod kultur innehållande S. aureus; Pseu ae, Pseudomonsom aeruginosa; uni, 16S universell prob; Ecoli, Escherichia coli sond; Pseu sp, Pseudomonas spp.. sond, S. pneu, Streptococcus pneumoniae sond; Strep sp, Streptococcus spp.. sond, Entero, Enterococcus spp.. sond, S. aureus, Staphylococcus aureus sond, Staph sp, Staphylococcus spp.. sond.
Figur 3. Amplifiering plot av antibiotika resistensbestämning av ett E. coli isolat (prov 1). Varje kurva representerar en antibiotisk att stammen odlades med. En tidig signal orsakas av en hög bakteriell belastning, vilket betyder att stammen har vuxit i närvaro av den testade antibiotikumet och är således resistenta mot antibiotika. Sena signalerna indikerar att stammen inte har vuxit i närvaro av antibiotikumet, med andra ord, är den känslig.
| Prov 1: E. coli | Prov 2: S. aureus | ||||
| AST | Ct | R / S | AST | Ct | R / S |
| Amoxicillin 8 mg / L | 16,83 | R | Amoxicillin 0,25 mg / L | 21,03 | R |
| Amoxicillin-klavulanat 8/4 mg / L | 17,36 | R | Oxacillin 2 mg / L | 25,80 | S |
| Piperacillin 16 mg / L | 16,67 | R | Vankomycin 2 mg / L | 25,20 | S |
| Piperacillin-tazobaktam 16 /4 mg / L | 24,15 | S | Gentamicin 4 mg / L | 25,86 | S |
| Ciprofloxacin 1 mg / L | 29,72 | S | Trimetoprim-sulfametoxazol 2/38 mg / L | 24,62 | S |
| Ceftazidim 1 mg / L | 24,03 | S | |||
| Ceftazidim 8 mg / L | 26,58 | S | |||
| Gentamicin 4 mg / L | 29,83 | S | |||
| Trimetoprim-sulfametoxazol 2/38 mg / L | 27,60 | S | |||
| Negativ tillväxt kontroll (blandning av antibiotika) | 30,41 | Negativ tillväxt-kontroll (prov lagrades vid 4 ° C) | 27,42 | ||
| Positiv tillväxtkontroll | 16,90 | Positiv tillväxtkontroll | 20,22 | ||
| Cut-off Ct-värde 1 * | 21,76 | Cut-off Ct-värde 1 *** | 23,82 | ||
| Cut-off Ct-värde 2 ** | 18,75 | Cut-off Ct-värde 2 **** | 22,02 | ||
| * För amoxicillin, amoxicillin-klavulanat, ciprofloxacin, gentamici, trimetoprim-sulfametoxazol ** För piperacillin, piperacillin-tazobaktam, ceftazidim | *** För vankomycin och gentamicin **** För amoxicillin, oxacillin och trimetoprim-sulfametoxazol |
Tabell 1. Fastställande av antibiotika resistensbestämning av de två prover (E.coli och S. aureus). Ct-värden för PCR-analysen kopierades till denna Excel-fil, som som kan automatiskt beräknar de två cut-off Ct alues från positiva och negativ tillväxt kontroll med hjälp av formler som visas i protokollet texten. Om en antibiotisk visar en Ct-värdet är lägre än den avskurna Ct-värdet, är den stam resistent mot antibiotikumet, om Ct-värdet var högre än den avskurna, är den stam känslig.
Discussion
Protokollet som beskrivs här möjliggör snabb identifiering av patogener och ger en funktionell antimikrobiell profil som kan leda till tidig administrering av lämpliga antibiotika och därigenom förbättra prognosen för patienter med infektioner i blodomloppet. Beroende på de begärda villkoren för ett test, turn-around dvs låg kostnad, hög genomströmning, minimal tid kan provningsförhållandena justeras. Hela proceduren kan utföras inom en arbetsdag. Dessutom kan de två delarna av det protokoll som skall utföras samtidigt, vilket minskar svarstiden avsevärt. Som presenteras här är att identifiera panelen ett urval av de mest kliniskt relevanta bakterier i vårt sjukhus. Eftersom den viktigaste principen riktar 16S genregionen, kan specifika sönder för andra mikroorganismer vara utformade och sätts till analysen. Den kompletta assay-ursprungligen var avsedd för den snabba analysen av blododlingar, men kan även användas för behandling av oligare exempel på material. Detta är också fallet för de antibiotika som användes för antibiotika resistensbestämning: fler eller andra antibiotika kan, på grundval av lokala resistensmönster och riktlinjer.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Profileringsfonds AZM (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
