Summary
Udformningen af en simpel en dag arbejdsgang ordning for bakterielle patogener diagnostik muliggør hurtig genkendelse af infektioner i blodet. Inddragelsen af otte klinisk relevante bakterielle mål og deres antibiotikaresistens profiler giver klinikeren et første indblik på samme dag, hvilket kan føre til en mere hensigtsmæssig behandling.
Abstract
Infektioner i blodet er forbundet med høj dødelighed på grund af den sandsynlige manifestation af sepsis, alvorlig sepsis og septisk shock 1. Derfor hurtig administration af passende antibiotisk terapi er af største betydning i behandlingen af infektioner i blodet. Den kritiske element i denne proces er timing, stærkt afhængig af resultaterne af bakteriel identifikation og antibiotisk resistensbestemmelse. Begge disse parametre rutinemæssigt opnås ved dyrkning baseret test, som er tidskrævende og tager i gennemsnit 24-48 timer 2, 4. Målet med undersøgelsen var at udvikle DNA-baserede assays til hurtig identifikation af infektioner i blodet, samt hurtig Antimicrobial Susceptibility Testing. Det første assay er en eubakterielle 16S rDNA-baserede realtids-PCR assay suppleret med arts-eller slægt-specifikke prober 5. Under anvendelse af disse prober og Gram-negative bakterier, herunder Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaog Escherichia coli såvel som Gram-positive bakterier, herunder Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. og Streptococcus pneumoniae kunne skelnes. Anvendelse af denne Multiprobe assay blev et første identifikation af den forårsagende mikroorganismen gives efter 2 timer.
For det andet har vi udviklet en semi-molekylær analyse for antibiotika følsomhedstest af S. aureus, Enterococcus spp. og (fakultativt) aerobe Gram-negative stave 6. Dette assay er baseret på en undersøgelse, hvor PCR blev anvendt til at måle væksten af bakterier 7. Bakterier høstes direkte fra blodkulturer inkuberes i 6 timer med et udvalg af antibiotika, og efter en SYBR Green-baseret realtids-PCR assay bestemmer inhibering af vækst. Kombinationen af disse to metoder kan dirigere valget af en egnet antibiotisk terapi på den samme dag (figur 1). Afslutningsvis, Molekylær analyse af både identifikation og antibiotikum modtagelighed giver en hurtigere alternativ til påvisning af patogener og kan forbedre diagnose af infektioner i blodet.
Protocol
DEL I: Patogen IDENTIFIKATION
1. Prøvefremstilling
Bemærk: Hele molekylære arbejdsgangen, som er beskrevet i det følgende protokol skal udføres i henhold til anbefalinger for kvalitetssikring inden for molekylær diagnostik 3.
- Tilsættes en 0,1 ml alikvot blod kultur til 0,9 ml 0,9% NaCI til en 1,5 ml reaktionsrør for at blive en 1:10 fortyndet prøve. (Fortyndet for at forhindre qPCR inhibering).
- Centrifugeres prøven ved 13.400 x g i 5 min for at pelletere den bakterielle DNA.
- Resuspender den bakterielle pellet i 100 ul sterilt demineraliseret H2O
- Opbevares DNA-prøven ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
2. Identifikation Assay: Real-time 16S rDNA-PCR
- Forberede reaktionsblandinger som følger. Assayet består af fire separate reaktioner pr prøve. Hver blanding omfatter 12,50 gl førerblanding, 0,9 uM fremadrettet primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 uM revers primer (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 og et panel af prober. Mængden af prober er givet for hver af de fire separate reaktioner i det følgende.
- Den første reaktion omfatter:
- 0,2 uM universal probe (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0,2 uM P. aeruginosa probe (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- Den anden reaktion omfatter:
- 0,2 uM E. coli probe (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 uM Pseudomonas spp. probe (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- Den tredje reaktion omfatter:
- 0,2 uM Staphylococcus spp. probe (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0,2 uM S. aureus probe (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- Den fjerde reaktion omfatter:
- 0,2 uM universal probe (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 uM Streptococcus spp. probe (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0,2 uM S. pneumoniae-probe (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Tilsættes sterilt demineraliseret H2O for at opnå en samlet volumen på 20 ul. Tilsættes 20 ul af hver reaktionsblanding til brøndene i en 96-brønds PCR-plade.
- Tilsættes 5 ul prøve til hver brønd.
- Anvender en klæbende film til at forsegle 96-brønds PCR-plade.
- Køre pladen på ABI PRISM 7900HT Real Time PCR System under anvendelse af følgende optimale termiske cyklusforhold:
- Forvarmning ved 50 ° C i 10 minutter
- Indledende denaturering ved 95 ° C i 15 min
- 42 cykler af
- Denaturering ved 95 ° C i 15 s
- Annealing ved 60 ° C i 1 minut
3. Analyse af resultater
Juster tærsklen til det Ct Analyse til 0,1 i fanen Analysis Indstillinger. Begræns de grundlæggende konfigurationer at starte (Cycle): 6 og End (cyklus): 15.
- Registrere cyklus tærskelværdien (Ct) værdi for alle prøver. Cut-off værdi til at behandle en PCR-resultat som positiv kan indstilles til en Ct-værdi på 35. Mængden af bakterier i blodkulturer varierede fra juli 10 - November 10 CFU / ml, genererer CT-værdier under 35.
DEL II: ANTIBIOTIKUM Susceptibility Testing
4. Isolering af bakterier fra positive blodkulturer 9
- Aspirer 5 ml bouillon fra en positiv blodkultur flaske og overføre det til et serum separator rør.
- Centrifugeres serum separatoren røret ved 2000 xg i 10 minutter.
- Supernatanten fra serum separatoren røret.
- Overførsel BACterier fra gelen lag af røret med en steril vatpind til 0,9% saltvand, indtil en 0,5 McFarland standard suspension.
5. Podning af Micro titre plader
- Fortynd 0,5 McFarland suspensionen i dobbelt koncentreret Mueller Hinton II bouillon til dannelse af en suspension af 5 x 10 5 CFU / ml.
- Tilføje denne suspension til brøndene i en mikro-titer plade indeholdende et udvalg af antibiotika (tabel 1).
- Inkubér mikro-titer pladen ved 37 ° C i 6 timer.
- Opbevares en portion af suspensionen ved 4 ° C (som negativ vækst kontrol).
- Efter 6 timers inkubation, overføre indholdet af hver brønd i en steril slange, såvel som en negativ vækst kontrolprøve, der blev opbevaret ved 4 ° C.
- Centrifuger rørene ved 16000 xg i 5 min.
- Forsigtigt fjernes supernatanten, uden at forstyrre den bakterielle pellet.
- Pellet resuspenderes i sterilt demineraliseret H
- Fortyndes prøverne 10 gange i sterilt demineraliseret H2O
6. Real-time 16S rDNA-PCR 10
- Fremstille PCR-blandingen som følger:
- 12,50 gl iQ SYBR Green Supermix
- 0,5 uM fremadrettet primer 16S-en (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0,25 um reverse primer 16S-2-(5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- sterilt demineraliseret H2O til et samlet volumen på 20 ul
- Tilsættes 20 ul PCR-blanding til brøndene i en 96-brønds PCR-plade.
- Tilsættes 5 ul prøve til hver brønd.
- Anvender en klæbende film til at forsegle 96-brønds PCR-plade.
- Kør pladen på MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, ved hjælp af følgende optimale termiske cyklisternes forhold:
- Indledende denaturering ved 95 ° C i 4 min
- Første annealing ved 65 ° C i 30 s
- 35 cykler af
- Denaturering ved 95 ° C i 15 s
- Annealing ved 60 ° C i 1 minut
- Smelte kurveanalyse (fra 60-95 ° C i 20 minutter med inkrementer på 0,57 ° C)
7. Analyse af resultater
- Beregn cut-off Ct værdi ved hjælp af en af de følgende formler (afhængigt af typen af antibiotika).
- Generelt:
Cut-off Ct værdi = Ct værdi positiv vækst kontrol + 0,5 x (Ct værdi negativ vækst i kontrol - Ct værdi positiv vækst kontrol) - Piperacillin, piperacillin / tazobactam og ceftazidim i Gram-negative stave, Amoxicillin, oxacillin og trimethoprim / sulfamethoxazol i S. aureus, Amoxicillin i Enterococcus spp. Cut-off Ct værdi = Ct værdi positiv vækst kontrol + 0,25 x (Ct værdi negativ vækst kontrol - Ct værdi positiv vækst kontrol)
- Generelt:
- Brug prøven inkuberes med sterilt demineraliseret H 2 O som en positiv vækst kontrol.
- Afhængigt af mikroorganismen, i modsat fald vækstkontrol anvende:
- Gram-negative stave prøve inkuberet med en blanding af antibiotika
- Enterococcus spp. Prøve opbevaret ved 4 ° C
- S. aureus prøve opbevaret ved 4 ° C
- Bestemme modtageligheden (S) eller modstand (R) af stammen for den testede antibiotika som følger:
- En CT-værdi højere end cut-off Ct værdi indikerer modtagelighed
- En CT-værdien er lavere end cut-off Ct værdi indikerer modstanden
8. Repræsentative resultater
To modelorganismer, dvs en Gram-negativ E. coli og en Gram-positiv S. aureus, er valgt til at visualisere den kombinerede procedure til påvisning og identifikation af bakterielle patogener og bestemmelse af deres antimikrobielle profil. Den første del af protokollen omfatter patogenet identifikation. Specifikke prober designet til detektion af otte klinisk relevante mikroorganismer. I nærvær af et mål indeholdt i den bakterielle panelet er amplifikationsprodukter kurverne frembragt og Ct-værdier beregnes (figur 2). Cut-off værdi til at behandle en PCR-resultat som positiv sættes til en Ct-værdi på 35. I figur 2A er identifikationen profilen af en E. coli-inficeret blod kultur vist. Den 16S universelle Sonden er inkluderet i to separate reaktionsblandingerne og dermed genererer to forstærkning kurver (Ct på 25,20 og 25,95). Det tredje signal afledes fra proben er specifik for E. coli (Ct i 27,04). Identifikation af en S. aureus-inficeret blod kultur er vist i figur 2B. 16S universelle probe har amplifikationsprodukter signaler 33,35 og 33,71. De to resterende signaler afledt af prober specifikke for Staphylococcus spp. og S. aureus (Ct på 32,48 og 30,59).
Figur 3 er et eksempel på et antibiotikum følsomhedstest forstærkning plot, der repræsenterer E. coli-stammen, der blev også vist i figur 2A. Hver linje repræsenterer et antibiotikum, at bakterieprøven blev inkuberet med. En prøve med en lav Ct-værdi er en prøve, hvis vækst forekom i nærvær af et antibiotikum, der angiver resistens til det testede antibiotika. Tværtimod repræsenterer en høj Ct værdi en prøve, hvori ingen vækst er sket på grund af den effektive bearbejdning af antibiotika, hvilket indikerer modtagelighed for den testede antibiotika. Tabel 1 illustrerer bestemmelsen af den antimikrobielle profil E. coli og S. aureus-isolater. Alle Ct-værdier er rapporteret, og ved hjælp af de formler, der er nævnt i protokollen teksten (7,1), to cut-off Ct-værdier opgøresberegnes til at skelne mellem modstand og følsomhed. Stammen er resistent over for antibiotika, hvis den rapporterede Ct er lavere end det beregnede cut-off Ct værdi (og vice versa).
Figur 1. Rutediagram af patogenet identifikation og antibiotikum følsomhedstest procedure under anvendelse tidstro 16S rDNA PCR.
Figur 2 Identifikation analysen:. Amplification plots og cykelstier tærskelværdier (Ct-værdier) Et positivt blod kultur er opdaget af den universelle 16S rDNA sonde, mens de specifikke prober anvendes til identifikation af kausale patogener.. A. amplifikation afbildning af blod kultur indeholdende E. coli B. amplifikation afbildning af blod kultur indeholdende S. aureus, Pseu ae, Pseudomonsom aeruginosa, uni, 16S universelle probe; Ecoli, Escherichia coli probe, Pseu sp, Pseudomonas spp. probe, S. pneu, Streptococcus pneumoniae-probe, Strep sp, Streptococcus spp. probe, entero, Enterococcus spp. probe, S. aureus, Staphylococcus aureus probe, Staph sp, Staphylococcus spp. probe.
Figur 3. Amplifikation afbildning af antibiotikum følsomhedstest af en E. coli isolat (prøve 1). Hver kurve repræsenterer et antibiotikum, at stammen blev inkuberet med. Et tidligt signal er forårsaget af en høj bakteriel belastning, hvilket betyder, at stammen er vokset i nærvær af den testede antibiotika og er således resistente over for antibiotika. Sene signaler angiver, at stammen ikke er dyrket i nærværelse af antibiotikum, med andre ord er den modtagelig.
| Prøve 1: E. coli | Prøve 2: S. aureus | ||||
| AST | Ct | R / S | AST | Ct | R / S |
| Amoxicillin 8 mg / L | 16,83 | R | Amoxicillin 0,25 mg / L | 21,03 | R |
| Amoxicillin-clavulanat 8/4 mg / L | 17,36 | R | Oxacillin 2 mg / L | 25,80 | S |
| Piperacillin 16 mg / L | 16,67 | R | Vancomycin 2 mg / L | 25,20 | S |
| Piperacillin-tazobactam 16 /4 mg / L | 24,15 | S | Gentamicin 4 mg / L | 25,86 | S |
| Ciprofloxacin 1 mg / L | 29,72 | S | Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L | 24,62 | S |
| Ceftazidim 1 mg / L | 24,03 | S | |||
| Ceftazidim 8 mg / L | 26,58 | S | |||
| Gentamicin 4 mg / L | 29,83 | S | |||
| Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L | 27,60 | S | |||
| Negativ vækstkontrol (blanding af antibiotika) | 30,41 | Negativ vækst kontrol (prøve opbevaret ved 4 ° C) | 27,42 | ||
| Positiv vækstkontrol | 16,90 | Positiv vækstkontrol | 20,22 | ||
| Cut-off Ct-værdi 1 * | 21,76 | Cut-off Ct-værdi 1 *** | 23,82 | ||
| Cut-off Ct-værdi 2 ** | 18,75 | Cut-off Ct-værdi 2 **** | 22,02 | ||
| * For amoxicillin, amoxicillin-clavulanat, ciprofloxacin, gentamici, trimethoprim-sulfamethoxazol ** For piperacillin, piperacillin-tazobactam, ceftazidim | *** For vancomycin og gentamicin **** For amoxicillin, oxacillin og trimethoprim-sulfamethoxazol |
Tabel 1. Bestemmelse af antibiotika følsomhedstest af de to prøver (E. coli og S. aureus). Ct-værdier for PCR-assayet blev kopieret til denne excel fil, som der kan automatisk beregner de to afskårne Ct alues fra de positive og negative vækstkontrol, ved hjælp af formlerne vist i protokollen teksten. Hvis et antibiotikum viser et Ct-værdi lavere end cut-off Ct værdi, er resistent over for antibiotikummet, hvis Ct-værdien var større end cut-off stammen er modtagelige.
Discussion
Protokollen beskrevet her muliggør hurtig identifikation af patogener og tilvejebringer et funktionelt antimikrobiel profil, kan føre til hurtig indgivelse af passende antibiotika og derved forbedre prognosen hos patienter med infektioner i blodet. Afhængig af de ønskede betingelser for en test, turn-around, dvs lave omkostninger, høj kapacitet, minimal tid, kan testbetingelser justeres. Hele proceduren kan udføres inden for én arbejdsdag. Endvidere kan de to dele af protokollen udføres samtidigt, hvilket reducerer vendesektionen væsentligt. Som det fremgår her, at identifikationen panelet er et udvalg af de mest klinisk relevante bakterier i vores hospital. Idet det vigtigste princip er rettet mod 16S genregionen, kan specifikke prober for andre mikroorganismer være udformet og tilsat til assayet. Den komplette Assayet blev oprindeligt beregnet til hurtig analyse af blodkulturer, men kan også anvendes til behandling af ondre prøvematerialer. Dette er også tilfældet for de antibiotika, der blev brugt til antibiotika resistensbestemmelse: flere eller andre antibiotika kan tilføjes, baseret på lokale resistensforhold og retningslinjer.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Profileringsfonds AZM (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
