Summary
嗜碱性粒细胞活化试验是一种IgE依赖的过敏检测的有力工具
Abstract
对像propyphenazone（PP）和双氯芬酸（DF）的非甾体抗炎药（NSAIDs）的过敏反应可表现为I型样过敏反应 1 。在临床实践中，对药物过敏的诊断主要是由患者的病史，皮肤测试是不可靠的和口头挑衅测试熊生命危险， 为病人2的。因此，一个潜在的IgE介导的病理机制证据是很难获得。
在这里，我们目前的基础上，使用药物过敏的患者，可以模仿在体内的效应反应过敏的人类嗜碱性粒细胞的体外培养方法。由于药物过敏的患者嗜碱性粒细胞进行特定的IgE分子的罪魁祸首药物，他们被激活后IgE受体交联，释放过敏效应分子。嗜碱性粒细胞的活化，可以监视通过上调CD63的表面表达用流式细胞仪检测3测定。
在低分子量药物的情况下，共轭旨在使嗜碱性粒细胞上的IgE受体的交联。正如在图1中 ，非甾体抗炎药的两名代表所示，PP和DF，共价结合，通过与主赖氨酸残基的氨基酸组的羧基反应组的人血清白蛋白（ HSA）的。东风带有一种内在的羧基，因此，可以直接使用 4，而含羧基衍生的PP organochemically合成前研究 1 。
耦合度低分子量蛋白质载体分子化合物及其空间分布，重要的是要保证两个IgE受体分子的交联。这里所描述的协议，适用于高性能尺寸排阻色谱（HPSEC）配备一个连续的折射率（RI）和紫外线（UV）检测系统的耦合度的决心。
由于描述的方法可应用于其他药物，嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）熊潜力的IgE介导的机制的药物过敏的决心。在这里，我们确定IgE介导和DF英美烟草公司非IgE抗体介导的过敏PP的超敏反应。
Protocol
1。药物结合物的制备
- 溶解于1.5 ml反应管1毫升DH 2 O 10毫克的DF。在进一步的程序，使用本DF解决方案的95μL。共轭聚丙烯人血清白蛋白溶于500μL0.3 M氢氧化钠（NaOH）的30.4毫克PP衍生工具（304克/摩尔）。
- 新增430.6μL生署2 O和100μL0.5 M的2 - （N -吗啉）乙磺酸（MES）的缓冲液pH值6.5至95μL溶解的DF。加入33.1μL生署2 O和140μL2米MES缓冲液pH值2.9的聚丙烯样品。
- 加入57.5μL新鲜制备的N -乙基- N' - - （3 - dimethylaminopropyl）碳二亚胺盐酸盐（EDC），卫生署2 O溶解原液浓度为100毫克/毫升的DF样品，或10μLEDC解决方案PP的样本。涡1分钟的样品。
- 用118毫克/毫升的浓度，每个样品添加的HSA溶液16.9μL。
- 孵育样品在室温下2小时，而在300转/分的晃动。
- 2磷酸盐缓冲液（PBS）pH值7.4升，每几个小时，透析对DF和PP样品的3倍。执行所有在4 ° C透析的步骤
- 14000 XG离心样品10分钟，收集上清液含DF或聚丙烯共轭与HSA。
- 检查执行的SDS - PAGE蛋白质的上清液，用12％的凝胶。装入一个凝胶槽约12微克HSA的共轭。
2。确定药物的共轭耦合率（图2）
- 对于DF和PP共轭耦合率的HPSEC分析，使用100毫米磷酸钠缓冲液的pH值6.5包含150 mM氯化钠和0.05％的叠氮化钠。使用一个7.8 × 300毫米TSK - GEL - G2000的SWXL列。
- 执行通过使用一个在线耦合RI和紫外检测器系统的信号检测。
- 准备一个HSA的标准样品，用1毫克/毫升的浓度，卫生署2 O探测器的校准注入50μL血清白蛋白标准溶液。
- 计算RI常数k RI和常数k UV紫外线探测器。使用的公式面积RI = K RI * [（DN / DC） 人血清白蛋白 （HSA）的]和地区紫外线 = K 紫外线 * [（DA / DC）， 白蛋白 （HSA）]与* C（DN / DC） 人血清白蛋白 = 0.185和（DA / DC） 人血清白蛋白 = 0.518 5。
- 准备DF和聚丙烯衍生HPSEC，5，10和30 nmol金额两种标准可以很容易地注入标准。
- 计算平均值（DN / DC） 的药物和（DA / DC）两种标准的药物。对于东风，（DN / DC）的0.235 ± 0.010和（DA / DC）为39.000 ± 0.493决心。对于PP，（DN / DC）和0.328 ± 0.016（DA / DC）53.155 ± 2.464决心。
- 上HPSEC注入药物的结合物，并确定他们的RI和UV峰面积。
- 解决这两个方程面积RI = K RI * [（DN / DC） 药物 * C（药）+（DN / DC） 人血清白蛋白 * C（HSA）]和地区紫外线计算DF，聚丙烯衍生物，与HSA的浓度= K * [ 紫外线 （DA / DC） 药物 * C（药）+（DA / DC） 人血清白蛋白 * C（HSA）的未知数。
3。英美烟草公司使用药物结合物
- 准备7流式细胞仪样品瓶和标签取决于其内容：未染色的控制，阴性对照，阳性对照组，和药物的结合物。
- 移液器50μL刺激的B - CCR - STB缓冲区中保留未染色和阴性对照的小瓶（Flow2科协，Bühlmann实验室，Schönenbuch，CH）。作为阳性对照，用50μLFlow2科协套件提供了一个反FcεRI解决方案。共轭溶液中加入适当的金额，创造了从0.02 -20微克/毫升DF共轭和PP共轭（终浓度的检测量在200μL）1:10稀释系列药物共轭保留小瓶。必须执行这些滴定实验，以确定最佳嗜碱性粒细胞活化为每一个病人样本的浓度。
- 每管加入100μL刺激缓冲区和50μL患者的EDTA全血。仔细混合样品。
- 移液器20μLFlow2科协染色试剂含有藻红蛋白（PE）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记，以每管的抗CD63抗体标记的抗CCR3抗体，再次组合。不要到不染样品的染色试剂移液器！
- 在37℃水浴中孵育45分钟的样品。
- 5分钟，停止对冰的反应。
- 加入2.0毫升Flow2科协裂解试剂，每小瓶和旋涡轻轻裂解红细胞。在黑暗中孵育样品在室温下10分钟。
- 离心5分钟，小心倒出上清液500 XG样本。
- 重悬于500μLFlow2科协洗涤缓冲液和冰，直到流式细胞仪存储的细胞。
- 调整流式细胞仪的电压Settings前部和侧散射（FSC，SSC），同时收购未染色样品。
- 从SSC - FSC阴谋的SSC - PE情节淋巴细胞门细胞预测。嗜碱性粒细胞识别CCR3 您好 SSC LO和门到FITC标记的PE图的PE标记的抗CCR3抗体。用FITC标记的抗CD63抗体检测激活嗜碱性粒细胞。
- 设置截止到最大的嗜碱性粒细胞CD63的在喜阴性对照的2.5％ 。 A样品嗜碱粒细胞的活化被认为是积极的，如果> 5％嗜碱性粒细胞CD63 的喜和除以阴性对照组的MFI样品平均荧光指数（MFI）超过2（图3） 。
4。代表性的成果：
这个实验评估作为一个有益的工具来检测IgE依赖的药物过敏的英美烟草公司。用于嗜碱性粒细胞激活蛋白结合物的非甾体抗炎药。通过HPSEC RI和紫外检测聚集状态，耦合度，并有效的结合物产量的决定。 如图4所示，43.5％的DF共轭保持了5.0 DF / HSA的耦合度的单体。对于总量的9.5耦合度决定的。 propyphenazone共轭显示，68.5％与21.2耦合度单体组成。聚集的耦合度为27.9。 DF的共轭确定的耦合度，共计7.6 DF和PP的结合物，为23.2。
英美烟草公司与结合物进行优化条件（偶联物的浓度，刺激时间）在允许调查甾体抗炎药过敏的IgE依赖的反应。正如图5所示，只有PP的结合，能够触发嗜碱性粒细胞激活可视化中的上调CD63的表面表达：20.6％，嗜碱性粒细胞被激活，在荧光强度的日志移特点。的MFI增加至386（阴性对照），到1893年的4.9倍。相比之下，使用DF共轭只有3.1％的嗜碱性粒细胞被激活，低于5％的切断。小额信贷机构只增加了从197到210（阴性对照）的一个因素1.1（限2.0）。含量的有效性是由（i）<5％嗜碱粒细胞的活化，阴性对照（二）日志移一个嗜碱粒细胞亚群的荧光强度，及（iii）激活嗜碱性粒细胞> 50％（阳性对照）。
图1。DF和PP衍生物的耦合与HSA 。溶解后的药品，水，MES缓冲液，和EDC（偶联剂）。样品振荡1分钟前HSA是吸管的药物解决方案。在室温下摇晃2小时内的药物共价键结合血清白蛋白。单体以及聚合可能的结果。
图2。耦合度的计算。首先，k RI和K 紫外线的常量确定。因此，HSA与已知浓度的标准是注入HPSEC系统。 （DN / DC）和（DA / DC）对HSA给定值0.185和0.518，分别为5。峰面积计算的常数。其次，每种药物注入三个标准，以确定药物浓度的特定的RI和UV领域。以来的K RI和K 紫外线常数从上面的步骤，可以计算出特定药物（DN / DC）和（DA / DC）衍生物。第三，药物人血清白蛋白结合物注入HPSEC。由此产生的峰值区是用于解决两个未知变量的两个方程来计算药物和HSA的浓度每峰。
图3。嗜碱粒细胞浇注。预测的细胞如淋巴细胞与前向散射的闸门侧散射（SSC - FSC图）。嗜碱性粒细胞是从门控淋巴细胞（SSC - CCR3 - PE图）认定为CCR3 您好 SSC LO。嗜碱性粒细胞都激活（CD63 您好 ）CD63 - FITC - CCR3 - PE情节分析。阴性对照是用来设置最高2.5％，其余CD63您好嗜碱性粒细胞切断。
图4。药物共轭确定的耦合度。 RI和UV信号显示两峰代表聚集（低保留体积洗脱）和单体（高保留体积洗脱）的药物 - 人血清白蛋白的结合物。单体和聚合的百分比（RI信号来确定），其耦合度描述（N = 1）。
嗜碱粒细胞activati 图5。在测试。共轭激活药物样品，阴性对照，阳性对照结果显示CD63 - FITC - CCR3 - PE图（N = 1）。
Discussion
英美烟草公司是一个良好的成立虽然尚未用于常规诊断IgE介导的过敏性疾病的6,7的方法。然而，药物过敏，其适用性受到损害为低分子化合物不能交联的IgE受体，嗜碱性粒细胞活化8的一个先决条件。因此，根据调查的药物，需要合适的载体蛋白质（如白蛋白）共价结合。重要的是，耦合度（ 即每载体蛋白的药物分子的数量），需要加以控制，以保证免疫活性的结合物 （即IgE受体交联）。从理论上讲，载体分子，每两个半抗原应足以IgE受体交联，只有百分之五的人血清白蛋白的DF分子已被证明在基于单元的检测 4触发介质释放。两者结合物，PP - HSA和DF - HSA的，已被确定为显示足够高的耦合度（HPSEC），使他们在BAT合适的试剂，免疫积极。另一个问题可能是药物代谢物可能会起到一定的作用，而不是母体药物的代谢产物可能会引起过敏反应。在东风的情况下，这种可能性已经在以前使用的五个主要阶段我的代谢产物和联动变种4的详细评估。掌握所描述的技术重要因素包括血液样本（<12小时后采血，检测嗜碱性粒细胞数> 500）的质量和优化的刺激条件（时间，剂量）。此外，所谓的非应答，谁也不确定阳性对照（抗体IgE受体的指示）反应。因此，验证标准，包括抗FcεRI抗体为阳性对照。一个重要的优势是使用药物共轭的事实，他们出现在对比纯净的药品，作为DF - HSA的共轭抗FcεRI 英美烟草 4抗体协同刺激无毒。相比之下，纯东风，显示在浓度为1.25毫克/毫升的细胞毒作用，导致英美烟草 9解释性的问题。一般情况下，潜在的细胞毒性测试，强烈建议每一个新产生的药物共轭。
在这里，我们已经表明PP - HSA的结合物的潜力，在英美烟草公司用来揭示IgE介导的超敏反应。与此相反，DF过敏是不是与IgE的表现在缺乏嗜碱粒细胞的活化响应DF - HSA的共轭。重要的是，关于IgE介导的机制的不确定性的情况下，结合物的免疫活性，在体外细胞为基础的检测系统进行评估，已为东风4所示。
使用的描述设置合适的蛋白载体共价键的共轭低分子量药物分子对包括抗生素药，非甾体抗炎药，造影媒体，肌肉松弛剂，麻醉剂的过敏反应等，可进行调查的IgE介导的参与机制。因此，英美烟草公司可能会作为一个除了现有的方法进行诊断（皮试，口服激发试验）。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由奥地利科学基金会（FWF）授予P18820 - B13。
伦理声明：
这项研究是由伦理委员会批准（PLUS_Ethik_090514）在萨尔茨堡大学，涉及人类和/或动物实验与修订于1983年，所有患者参加了他们的书面知情同意遵守赫尔辛基Declaraction。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3671 | - |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Corp. | 08540 | - |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | 338962 | - |
| Bench top centrifuge | Sigma-Aldrich | - | - |
| Diclofenac sodium salt | Sigma-Aldrich | D6899 | - |
| EDTA-Vacutainer | BD Biosciences | 368589 | - |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett-Packard | - | - |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | - |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | - | - |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | E6383 | - |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | - |
| Propyphenazone derivative | University of Salzburg | - | - |
| Shaker | Eppendorf | - | - |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S1679 | - |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | 90421C | - |
| Sodium hydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | - |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | - |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | - |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | - |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | - |
References
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