מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.
הלב העכבר הוא מודל פופולרי ללימודי לב וכלי דם בשל קיומה של הטכנולוגיה בעלות נמוכה עבור הנדסה גנטית של מין זה. Phenotyping פיזיולוגיים לב וכלי דם של הלב העכבר ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות דימות פלואורסצנטי העסקת בדיקות שונות פוטנציאל הטרנסממברני (V מ '), הארעיים סידן (CAT), ופרמטרים נוספים. עירור-התכווצות צימוד מאופיין הדינמיקה פעולה פוטנציאליים תאיים סידן, ולכן חשוב למפות באופן ביקורתי הן מ V ו-CAT בו זמנית באותו מקום על הלב 1-4. מיפוי אופטי סימולטני מן Langendorff perfused לבבות העכבר יש את הפוטנציאל להבהיר המנגנונים אי ספיקת לב, הפרעות קצב, מחלות מטבוליות, מחלות לב אחרות. ויזואליזציה של הפעלה, מהירות ההולכה, משך פעולה פוטנציאליים, ופרמטרים נוספים על מספר עצום של אתרים לא ניתן להשיג מחקירה ברמה התאית אבל גם נפתרת על ידי מיפוי אופטי 1,5,6. במאמר זה אנו מציגים את תוכנית ההתקנה מכשור תנאי הניסוי למיפוי אופטי סימולטני של V מ 'חתול ועכבר לבבות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה באמצעות המדינה-of-the-art טכנולוגיית CMOS הדמיה. הקלטות אופטי עקבי להשיג בשיטה זו להמחיש כי מיפוי אופטי סימולטני של לבבות Langendorff עכבר perfused הוא גם ריאלי ואמין.
בניסוי זה שינינו את שיטת זלוף Langendorff ידי הוספת צינורית סיליקון קטנה, אשר הוא חיוני במיוחד לאחר דיכוי התכווצויות חדרית עם uncoupler עירור-התכווצות. צינורית סיליקון משמש כדי למנוע גודש פתרון, החמצה של הפתרון זלוף, ופיתוח של איסכמיה של החדר השמאלי. הלב העכבר רגיש מאוד היפותרמיה, ולכן וריאציות הטמפרטורה על פני הלב תגרום הבדלים מלאכותיים משך פוטנציאל פעולה. כתוצאה מכך, מערכת חימום בוצע בתא זלוף על מנת לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במהלך מכלול הניסוי 8. מאז מודל Langendorff אינו שומר העצבוב של הלב, צריך לשקול להוסיף עצביים אל perfusate על מנת לחקור את הטון אוהד הפאראסימפתטית פיזיולוגיים 9. מלבד זלוף מדרדר, תוספת של superfusion הלב עוזר לשמור על פרמטרים סביבתיים מתאימים כגון pH וטמפרטורה. בשיטה זו, בלב Langendorff perfused הונח אופקית. התקנה אנכית זלוף Langendorff יכול לשמש גם 10, אך עלולה לגרום מכניקה לב שונה במקצת 11. בנוסף CMOS מצלמות, גלאים חלופיים זמינים גם יכול להיות מיושם על המפה V מ 'חתול בו זמנית 12.
יישום של מצלמות CMOS ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן מבטיח את הדיוק של הקלטות, אולם אותות מיפוי אופטי אינם מתא בודד. במקום זאת, כל אות ניאון נובע מאות או אלפי תאים, בהתאם הגדלה אופטית. הקרינה חדרית הרבה יותר גדול יכול לעוות אותות פרוזדורים על ידי פיזור אופטי, ולכן פרשנות זהירה של אותות רשמה אופטית נדרש. מגבלה נוספת של הכנה העכבר הוא עיוות האות לרעש הנגרם על ידי העקמומיות של פני השטח בשל גודלו הקטן של הלב 13. מדידות מהירות הולכה ניתן לשנות לא רק עקמומיות הלב העכבר אלא גם קוטביות אלקטרודה אלקטרודות וירטואלי. כדי להשיג דיוק עבור מהירות ההולכה, אנאיזוטרופיה ההפעלה, ומפות repolarization, נכון התמקדות של המצלמה על פני השטח של הלב היא חיונית.
בשיטה זו, בזמן אמת הקלטות א.ק.ג. ניתן להשלים את החקירה אופטי של electrophysiology לב. מתח רגיש צבען (RH237) ו אינדיקטור סידן (Rhod, 02:00) משמשים בפרוטוקול בגלל תגובה מהירה שלהם, עירור דומה, ספקטרום פליטה ברורים 3,7. קיימים שילובים של צבעים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי למדוד V מ 'חתול אחר מאשר RH237 ו-Rhod 02:00 3. לצבוע רומן מתח רגיש, PGHI, עם שינוי גדול של סטוק (> 200nm) נמצא כדי לאפשר יותר מ V אותות חתול בגלל הפרדה גדולה יותר של אורכי גל הפליטה בין PGHI ו-Rhod 02:00 14. שיפורים עתידיים עשויים להתמקד בחקר בדיקות ניאון רומן, פיתוח של גלאי הדמיה חדש, תוכנת עיבוד תמונה משופרת. רזולוציה גבוהה הרומן שיטות הדמיה אופטית למיפוי אופטי 3D הם גם הכיוונים העתידיים החשובים של מיפוי אופטי 5.
The authors have nothing to disclose.
NIH מענקים R01 HL085369.
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |