Эта статья подробно процедура вскрытия, инструментальная установка, и экспериментальных условиях при оптическом отображение трансмембранного потенциала (ВМ) и внутриклеточного кальция переходных (КПП) в интактных изолированных Langendorff перфузии мыши сердца.
Мышь сердце популярной моделью развития сердечно-сосудистых исследований из-за наличия недорогих технологий для генной инженерии у этого вида. Сердечно-сосудистые физиологических Фенотипирование мыши сердца можно легко сделать с помощью флуоресцентной визуализации с использованием различных зондов для трансмембранного потенциала (V м), кальция переходных (КПП), и другие параметры. Возбуждение-сжатия связи характеризуется потенциала действия и внутриклеточной динамики кальций, поэтому крайне важно, чтобы обе карты V м и кот одновременно с того же места на сердце 1-4. Одновременное отображение из оптических Langendorff перфузии сердца мыши имеет потенциал для выяснения механизмов, лежащих сердечной недостаточности, аритмии, нарушение обмена веществ, и других сердечных заболеваний. Визуализация активации, скорости проведения, продолжительность потенциала действия и других параметров на множество сайтов не может быть достигнута из ячеистого расследования уровне, но хорошо решается оптическим отображением 1,5,6. В этой статье мы представляем установку приборов и экспериментальных условий для одновременного оптического отображение V м и КПП в мыши сердца с высоким пространственно-временным разрешением использования государством в самых современных КМОП-технологий визуализации. В соответствии оптических записей, полученных с помощью этого метода показывают, что одновременное отображение оптических Langendorff перфузии сердца мыши является возможным и надежным.
В этом эксперименте мы изменили метод Langendorff перфузии, добавив небольшую трубку кремния, что особенно важно после подавления желудочковых сокращений с возбуждением-сжатия разобщающий агент. Трубки кремния используется для предотвращения заторов решение, подкисление перфузии раствора и развития ишемии в левый желудочек. Мышь сердце очень чувствительны к гипотермии, таким образом, колебания температуры через сердце приведет искусственного различия в длительности потенциала действия. Следовательно, система отопления была реализована в перфузионной камере, чтобы поддерживать постоянную температуру 37 ° С в течение полноту эксперимента 8. Так как модель Langendorff не сохраняет иннервации сердца, необходимо рассмотреть вопрос о включении нейротрансмиттеров в перфузат с целью изучения физиологических симпатической и парасимпатической тон 9. Кроме того ретроградной перфузии, добавление superfusion сердца помогает поддерживать подходящие параметры окружающей среды, таких как рН и температура. В этом методе, Langendorff перфузии сердце горизонтально расположенные. Вертикальной установки перфузии Langendorff также может быть использован 10, но может привести к несколько иной сердечной механике 11. В дополнение к CMOS-камер, альтернативных детекторов, также доступны и могут быть применены к карте V м и кот одновременно 12.
Применение камер CMOS высокой пространственно-временное разрешение обеспечивает точность записей, однако оптические сигналы отображение не из одной ячейки. Скорее, каждый флуоресцентный сигнал поступает из сотен или тысяч клеток, в зависимости от оптического увеличения. Гораздо больше желудочка флуоресценции может исказить предсердий сигналов оптического рассеяния, поэтому осторожной интерпретации оптически регистрируемых сигналов не требуется. Другим ограничением мыши препарата искажения сигнала и шума индуцированных кривизна поверхности из-за небольшого размера сердца 13. Измерения скорости проведения могут быть изменены не только от кривизны мыши сердца, но и от полярности электрода и виртуальных электродов. Для достижения точности для скорости проведения, активизации анизотропии и реполяризации карт, правильная фокусировка камеры на поверхности сердца имеет важное значение.
В этом методе реального времени записи ЭКГ может дополнить оптического исследования сердечной электрофизиологии. Напряжение чувствительных красителя (RH237) и кальция индикатор (Rhod-2 утра) используются в протокол из-за их быстрой реакции, подобные возбуждения, и различные спектры излучения 3,7. Существуют альтернативные комбинации красителей, которые могут быть использованы для измерения V м и CaT кроме RH237 и Rhod-2 утра 3. Роман напряжения чувствительной краситель, PGHI, с большим сдвигом Стокса (> 200 нм) был найден, чтобы лучше V м и CaT сигналы из-за большего разделения длин волн излучения между PGHI и Rhod-2 утра 14. Дальнейшее совершенствование может сосредоточиться на изучении новых флуоресцентных зондов, разработка новых детекторов изображений, а также усовершенствованное программное обеспечение для обработки изображений. Более высокое разрешение и новых оптических условий для 3D визуализации оптических отображение также важны будущие направления оптических отображение 5.
The authors have nothing to disclose.
NIH гранты R01 HL085369.
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |