Summary
आइस कैप विधि एक 96 अच्छी तरह प्लेटें और गैर विध्वंस फसल जड़ ऊतक में प्रत्येक अंकुर से पौधों को विकसित करने के लिए अनुमति देता है. इस रूट ऊतकों से निकाली डीएनए जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने पाया है कि आइस कैप के लिए अच्छी तरह से काम करता है
Protocol
1. अग्रवाल विकास मीडिया के साथ आइस कैप अंकुर प्लेट्स तैयार
पिघला हुआ विकास मीडिया (Murashige 0.5X और Skoog (एमएस) बेसल नमक मिश्रण, 2 मिमी Morpholinoethanesulfonic एसिड (एमईएस), 0.6%, अगर (w / v), 5.7 पीएच) autoclaved अंकुर MicroFill Microplate औषधि का उपयोग प्लेट्स में तिरस्कृत है. मीडिया की एक लीटर प्रति 18 अंकुर प्लेट्स की जरूरत है.
- एक पेंच शीर्ष lids और 20 मिनट के लिए आटोक्लेव के साथ लीटर कांच की बोतलों में वृद्धि मीडिया तैयार करें.
- आटोक्लेव पेंच ऊपर ढक्कन के साथ एक कांच की बोतल में एक लीटर आसुत जल के. एक ही समय में भी खाली अंकुर एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा प्लेट्स आटोक्लेव.
- एक मशीन सेट के 65 में autoclaved मीडिया और पानी स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस यह एक पिघला हुआ राज्य में तापमान वृद्धि मीडिया को बनाए रखना होगा.
- वाष्पदावी विसंक्रण के बाद, पन्नी और लामिना का प्रवाह हुड में जगह के लिए सूखी से अंकुर प्लेट्स हटा दें. प्लेट्स पूरी तरह से सूखे से पहले इतना है कि चिपकने वाला टेप पैकिंग कार्यवाही कर सकते हैं होना चाहिएपूरी तरह से प्लेटों के कुओं के तल पर छेद सील.
- प्रयोगशाला बेंच के नीचे 95% इथेनॉल sanitize के साथ पोछो.
- अंकुर प्लेट्स के लिए स्पष्ट प्लास्टिक lids 95% इथेनॉल में sanitize भिगोएँ. लामिना का प्रवाह हुड में इथेनॉल और शुष्क हवा से lids निकालें. आटोक्लेव प्लास्टिक lids उन्हें बाँझ क्योंकि वे आटोक्लेव में पिघल जाएगा मत करो.
- प्रत्येक अंकुर प्लेट के नीचे पैकिंग टेप लागू करें और मजबूती रोलर उपकरण का उपयोग मुहर.
- एक पानी 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट स्नान में पिघला हुआ विकास मीडिया और निष्फल पानी की बोतलें प्लेस
- MicroFill मशीन के कमरे के तापमान पर 70% इथेनॉल युक्त बोतल संलग्न और शुद्ध चक्र दो बार MicroFill मशीन की पाइपलाइन sanitize चला.
- बोतल MicroFill मशीन को बाँझ पानी के साथ संलग्न. शुद्ध चक्र पाइपलाइन गर्म और इथेनॉल प्रणाली के बाहर स्पष्ट छह बार चलाएँ. इस प्रक्रिया के दौरान पानी की बोतल 65 ° सी स्नान में रहना चाहिए.
- बाँझ पानी के साथ purges पूरा करने के बाद, तुरंत MicroFill मशीन पिघला हुआ विकास मीडिया की बोतल देते हैं. शुद्ध चक्र दो बार आसुत पानी पाइपलाइन के बाहर स्पष्ट चलाएँ. वृद्धि मीडिया की बोतल 65 ° सी स्नान में इस प्रक्रिया के दौरान रहना चाहिए.
- प्रत्येक अंकुर प्लेट के कुओं में वृद्धि मीडिया के 450 microliters के बग़ैर. जल्दी इतना काम है कि विकास मीडिया MicroFill मशीन की पाइपलाइन में जमना नहीं करता.
- जब अंकुर प्लेट्स के सभी भर गया है, तुरंत MicroFill मशीन के लिए 65 ° सी बाँझ पानी की बोतल देते हैं और शुद्ध चक्र 12 बार चलाने के लिए नलसाजी साफ. इस प्रक्रिया के दौरान पानी की बोतल 65 ° सी स्नान में रहना चाहिए.
- यदि एक MicroFill मशीन उपलब्ध नहीं है, अंकुर प्लेट्स भी हाथ सील एक multichannel pipettor का उपयोग कर प्लेटें में पिघला हुआ अगर pipetting द्वारा तैयार किया जा सकता है.
- प्रत्येक अंकुर प्लेट्स टी के कुओं का निरीक्षणओ सुनिश्चित करना है कि विकास मीडिया के किसी भी कुओं की लीक नहीं है. हाथ विंदुक अतिरिक्त व्यक्तिगत कुओं में पिघला हुआ विकास मीडिया के रूप में की जरूरत है.
- एक स्पष्ट प्लास्टिक के ढक्कन के साथ कवर एक थाली, और विकास मीडिया कमरे के तापमान पर अंकुर प्लेट्स में जमना करने के लिए अनुमति देते हैं. ढेर प्लेटें और 4 में भंडारण के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो डिग्री सेल्सियस स्टोर प्लेटें उल्टा भंडारण के दौरान कुओं में पानी के संचय को रोकने के लिए.
2. आइस कैप अंकुर प्लेट्स और उगना Seedlings में बोना बीज
हम पहले एक बीज लोड हो रहा है डिवाइस (2) का उपयोग अंकुर प्लेट्स में Arabidopsis बीज वितरण के लिए एक अर्द्ध स्वचालित विधि वर्णित है. हालांकि इस डिवाइस के बीज के कुछ बैचों के लिए उपयोगी हो सकता है, हमने पाया है कि बीज Arabidopsis बीज के विभिन्न बैचों द्वारा प्रदर्शित आकार में परिवर्तनशीलता इस डिवाइस के सामान्य उपयोगिता की सीमा. हम बीज वितरण के लिए एक वैकल्पिक स्वचालित पद्धति के विकास की प्रक्रिया में हैं, बूवर्तमान में टी हमने पाया है कि अंकुर प्लेट्स में बीज वितरण के लिए सबसे प्रभावी रणनीति के हाथ से इस कदम का प्रदर्शन के रूप में नीचे वर्णित है.
- वाटमान फिल्टर पेपर पर सूखे बीज छिड़क.
- बीज पर 95% इथेनॉल बांटना इतना है कि बीज के सभी इथेनॉल के साथ कवर किया जाता है. इस उपचार की सतह बीज बाँझ बनाना होगा.
- बीज सूखी हवा की अनुमति दें.
- अंकुर प्लेट्स का उपयोग कर एक संशोधित डिस्पोजेबल गिलास पाश्चर विंदुक के कुओं में अलग - अलग बीज का स्थानांतरण. पाश्चर विंदुक के अंत टिप ज्वलंत द्वारा बंद है. परिणामस्वरूप कांच टिप धीरे से अगर मीडिया, जो एक एकल बीज आसानी से उठाया और अंकुर प्लेट के कुओं में अगर की सतह को हस्तांतरित की अनुमति देता है के लिए छू द्वारा सिक्त है. इस बीज चढ़ाना उपकरण के दो सिरों वाले संस्करण भी throughput बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक स्पष्ट प्लास्टिक और micropore सर्जिकल टेप के साथ ढक्कन सील के साथ प्रत्येक अंकुर प्लेट कवर. खड़ी प्लेटों लपेटेंएल्यूमीनियम और 4 में पन्नी की दुकान Arabidopsis बीज के साथ डिग्री सेल्सियस चार दिनों के लिए बीज विभक्त हो जाना करने के लिए और अंकुरण सिंक्रनाइज़. टमाटर का बीज 12 ° C पर अंधेरे में चार दिनों के लिए भंडारित किया जाना चाहिए.
- फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत 18 ° 20 ° C अंकुरण आरंभ करने के लिए पर अंकुर प्लेट्स रखें.
3. आइस कैप फाउंटेन अंकुर प्लेट्स स्थानांतरण
बाद अंकुर प्लेट्स प्रकाश के तहत चार दिनों के लिए किया गया है, फव्वारा आइस कैप अंकुर प्लेट्स हस्तांतरण. Arabidopsis के लिए, seedlings आम तौर पर 10 से 14 दिनों के लिए आइस कैप फव्वारा में छोड़ दिया जाता है.
- कस्टम रैक संरचना है जो एक प्लास्टिक का भंडारण बॉक्स के अंदर रखा गया है के शीर्ष पर एक कुकी शीट रखकर आइस कैप फाउंटेन इकट्ठा. कुकी शीट के स्तर को समायोजित करने के लिए leveling के नट का प्रयोग करें. प्लेस भंडारण बॉक्स में एक पनडुब्बी पंप और पंप से कुकी शीट के पक्ष उत्पादन नली संलग्न एक वसंत लोड सीएलए का उपयोगसांसद. आइस कैप संयंत्र विकास कमरा या विकास कक्ष में एक शेल्फ पर फाउंटेन इकट्ठा इतना है कि आइस कैप फाउंटेन की सतह प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश व्यवस्था प्राप्त है.
- फाउंटेन आइस - कैप 3 1 हिस्सा पानी के नल के लिए आसुत जल भागों का एक मिश्रण के साथ भरें. पानी के फव्वारे के लिए जोड़ा जाना चाहिए जब तक पंप पनडुब्बी पानी के स्तर से नीचे कई सेंटीमीटर है. प्लास्टिक का भंडारण बॉक्स का उपयोग करके प्रयोगशाला टेप में अंतिम जल स्तर और एक अंकन कलम मार्क.
- रूट प्लेट्स एक रूट प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक 3/32-inch व्यास स्टेनलेस स्टील की गेंद को जोड़कर तैयार करें.
- स्टेनलेस स्टील गेंदों रूट प्लेट्स एक गेंद वितरण डिवाइस एक बनाई गई कस्टम का उपयोग करने के लिए जोड़ा जा सकता है. यह डिवाइस एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली की सतह पर एल्यूमीनियम पन्नी की एक एकल पत्रक रखने और एक अंकन कलम का उपयोग करने के लिए पन्नी की सतह पर प्रत्येक अच्छी तरह के केन्द्रों के स्थानों को चिह्नित किया जाता है. पन्नी के इस पत्रक के रूप में चिह्नित तो के लिए एल्यूमीनियम का एक अतिरिक्त 6 शीट के शीर्ष पर रखा हैil और एक प्रयोग किया विंदुक टिप बॉक्स से एक ढक्कन के चिकनी सतह के चारों ओर लपेटा. जैसे एक लकड़ी की कटार एक तेज उपकरण तो एक काफी बड़े के लिए 96 पदों के प्रत्येक में एक एक धातु गेंद को पकड़ divot बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. गेंदों के साथ इस वितरण युक्ति को भरने के लिए, धातु गेंदों की एक अतिरिक्त डिवाइस पर डाल दिया है और यह धीरे अतिरिक्त गेंदों को दूर करने के लिए हिल रहा है. रूट प्लेट तब वितरण डिवाइस, जो खत्म रूप से फ़्लिप रूट प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक गेंद ड्रॉप के शीर्ष पर रखा गया है.
- रूट MicroFill मशीन का उपयोग कर प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 3 1 हिस्सा पानी के नल के लिए आसुत जल भागों का एक मिश्रण के 340 microliters जोड़ें. सुनिश्चित करें कि इस्पात गेंदों से पहले पानी वितरण रूट प्लेट्स करने के लिए जोड़ा गया है.
- अंकुर प्लेट्स के नीचे बंद चिपकने वाली फिल्म के पील और प्लेटों से स्पष्ट प्लास्टिक lids हटायें. एक रूट प्लेट युक्त एक धातु गेंद और पानी में प्रत्येक अंकुर प्लेट प्लेस और दो प्लेटों के साथ सुरक्षित दो लोचदार है का उपयोगआर बैंड.
- आइस कैप फाउंटेन में खड़ी आइस कैप प्लेटें प्लेस. स्पष्ट प्लास्टिक lids जब प्लेटें आइस कैप फाउंटेन में नहीं किया जाना चाहिए. यकीन है कि अच्छी तरह से अंकुर प्लेट की एक 01 अच्छी तरह से रूट प्लेट के A-01 के साथ गठबंधन किया है की जाँच करें.
- खड़ी अंकुर / रूट प्लेट्स आइस कैप फाउंटेन में छोड़ दिया जाना चाहिए जब तक seedlings के बहुमत जड़ ऊतक कि रूट प्लेट्स में प्रवेश कर गया है. आइस कैप फाउंटेन में Arabidopsis seedlings के लिए आदर्श वृद्धि तापमान ca है . 18 डिग्री सेल्सियस जल स्तर कुकी शीट में ऐसी है कि रूट प्लेट्स के कुओं में पानी प्रवाह कर सकते हैं, लेकिन नहीं होना चाहिए इतनी गहरी है कि अंकुर प्लेट में seedlings जलमग्न हैं. अगर पानी का स्तर सही नहीं है आप सही गहराई का एक अलग कुकी शीट मिल की आवश्यकता होगी.
- आसुत जल समय - समय पर आइस कैप फाउंटेन के लिए मूल जल स्तर को बनाए रखने में जोड़ें. फव्वारा शुद्ध आसुत जल जोड़कर आप बदल देगातरल फव्वारा में पानी की खनिज संरचना को बदलने के बिना वाष्पीकरण के कारण खो दिया है. जल स्तर आइस कैप फाउंटेन में दैनिक जाँच की जानी चाहिए.
4. फसल काटने वाले रूट ऊतक
रूट ऊतक रूट प्लेट में पानी की ठंड और फिर अंकुर प्लेट रूट प्लेट से दूर छीलने से काटा जाता है.
- जड़ ऊतक कटाई से पहले दिन, खड़ी आइस कैप प्लेट्स आइस कैप फाउंटेन से हटा दें.
- खड़ी अंकुर और रूट प्लेटों के कुओं के बीच तीन लकड़ी skewers डालें. skewers के प्रयोजन के अंकुर प्लेट्स के महत्वपूर्ण व्यक्ति रूट प्लेट्स के जमने की प्रक्रिया के लिए तैयारी में कुओं से बाहर बढ़ा है.
- रोशनी के तहत रातोंरात खड़े डाला लकड़ी skewers के साथ खड़ी आइस कैप प्लेट्स की अनुमति दें. इस रूट प्लेट्स, जो बाद ठंड और थाली जुदाई प्रक्रियाओं की सुविधा में तरल के ऊष्मायन मामूली वाष्पीकरण की अनुमति देता है.
- परऊतक फसल के दिन, एक ठंड स्नान तैयार करते हैं. सूखी बर्फ और 95% इथेनॉल के मिश्रण के साथ एक pyrex डिश में 96 अच्छी तरह से एक धातु थर्मल ब्लॉक रखें. थर्मल ब्लॉक तापमान में कैरियर के लिए संतुलित करना दें. 20 मिनट. तो एक प्रकार का दस्ताना है कि कम तापमान प्रयोगशाला बेंच की सतह को नुकसान नहीं करता है आटोक्लेव के रूप में ऐसी सामग्री इन्सुलेट के कुछ प्रकार के शीर्ष पर Pyrex पकवान प्लेस.
- 5 मिनट के लिए ठंडा थर्मल ब्लॉक और सेते में लकड़ी skewers के साथ खड़ी आइस कैप प्लेटें प्लेस. इस समय के दौरान रूट प्लेट में पानी ठोस फ्रीज होगा. अंकुर प्लेट में seedlings के इस इलाज के दौरान स्थिर नहीं है और पूरी तरह से व्यवहार्य रहना.
- थर्मल ब्लॉक से खड़ी आइस कैप प्लेटें निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला बेंच पर जगह है. इलास्टिक बैंड और खड़ी प्लेटों से लकड़ी skewers निकालें. अंकुर प्लेट के शीर्ष पर मजबूती से नीचे प्रेस करने के लिए प्लेटें "दरार". तो ध्यान से छील रूट प्लेट और अंकुर प्लेट एपीकला.
- रूट प्लेट्स में पानी कमरे के तापमान पर पिघलना करने की अनुमति दें. विगलन 25 में एक थर्मल सेट ब्लॉक डिग्री सेल्सियस में रूट प्लेट्स incubating द्वारा शीघ्र कर सकते हैं
5. कम तापमान पर अंधेरे में अंकुर प्लेट स्टोर
ऊतक फसल के बाद, अंकुर प्लेटें जो seedlings के व्यवहार्यता बनाए जबकि जीनोटाइप विश्लेषण किया जाता है कम तापमान पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है. seedlings व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना कई हफ्तों के लिए इन तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है.
- ऊतक फसल के बाद, चिपकने वाला टेप के साथ अंकुर प्लेट के निचले हिस्से सील.
- अंकुर प्लेट के शीर्ष पर एक स्पष्ट प्लास्टिक के ढक्कन प्लेस और micropore टेप के साथ सुरक्षित है.
- कई अंकुर प्लेट्स के साथ ढेर और एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो.
- Arabidopsis seedlings के लिए, 4 में प्लेटें जगह डिग्री सेल्सियस टमाटर seedlings के लिए, 12 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें जगह एक बार जीनोटाइपिंग पूरा हो गया है, सेedlings इस कम तापमान गर्मी से हटाया जा सकता है है और मिट्टी में प्रत्यारोपित के रूप में नीचे वर्णित है.
6. डीएनए निष्कर्षण
पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त डीएनए आसानी से रूट ऊतकों के नमूनों से निकाला जा सकता है है. कुल Arabidopsis रूट ऊतकों के नमूनों से बरामद डीएनए की उपज ca है. 2 औसतन 400 एनजी.
- यकीन है कि रूट प्लेट्स में पानी पूरी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया प्रदर्शन से पहले thawed है. प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए निर्धारित करती है कि किसी भी कुओं औसत से काफी कम पानी है. हाथ विंदुक है कि अतिरिक्त पानी की आवश्यकता होती है कुओं में पानी आसुत.
- MicroFill मशीन का प्रयोग Tris - EDTA समाधान (500 मिमी Tris, पीएच 8, 50 मिमी EDTA, PH8) के 25 microliters जोड़ने रूट प्लेट्स के प्रत्येक अच्छी तरह से.
- रूट थर्मल सील पन्नी और एक गर्मी सील मशीन का उपयोग कर प्लेट्स के कुओं सील.
- GenoGrinder मशीन पर के साथ सील जड़ प्लेटें प्लेसनीचे का सामना करना पड़ रहा प्लेटों के अंत सील. यह प्लेट ओरिएंटेशन इष्टतम मनका आंदोलन प्रदान करता है और कुओं में चिपका से मोती रोकता है. GenoGrinder में प्लेटें प्रति मिनट 1350 स्ट्रोक में 3 साढ़े मिनट के लिए हिलाओ.
- एक अपकेंद्रित्र के लिए प्लेटें और microplate वाहकों के साथ स्थानांतरण 3500 RPM में 4 बजे 10 मिनट के लिए प्लेटें ° चूर्णित जड़ ऊतक स्पिन सी गोली.
- परिणामस्वरूप पतला निकालने जीनोमिक डीएनए कि पीसीआर प्रतिक्रियाओं में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल हैं. आमतौर पर एक इस डीएनए निकालने के 2 microliters एक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए जोड़ देगा.
- डीएनए नमूनों के भंडारण के लिए, microplate मुहर 20 ऋण पर चिपकने वाला टेप पैकिंग और जगह का उपयोग डिग्री सेल्सियस डीएनए के नमूने की गुणवत्ता में कोई स्पष्ट कमी के साथ कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
7. मिट्टी में वांछित जीनोटाइप के साथ Seedlings स्थानांतरण
एक बार जीनोटाइप विश्लेषण पूरा हो गया है, वांछित जीनोटाइप के साथ seedlings अंकुर से स्थानांतरित किया जा सकता है हैमिट्टी में प्लेट्स.
- कोल्ड स्टोरेज से अंकुर प्लेट्स निकालें और पानी संतृप्त मिट्टी का मिश्रण के साथ बर्तन तैयार.
- अंकुर प्लेट से एक व्यक्ति अंकुर को निकालने के लिए, एक संदंश कि एक अंकुर को कुचल के बिना अगर प्लग खींचने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें. संदंश के साथ अगर प्लग ले लो और धीरे से अंकुर अंकुर नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा प्लेट के बाहर अगर प्लग स्लाइड. वैकल्पिक रूप से, दबाव हवा धीरे अगर प्लग और अच्छी तरह से बाहर अंकुर गोली मार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अच्छी तरह से नीचे में छोटा सा छेद करने के लिए दबाव लागू करें जब तक प्लग प्रयोगशाला बेंच पर बाहर चबूतरे.
- अगर प्लग के आकार में एक छोटे छेद मिट्टी तैयार. मिट्टी में अगर प्लग प्लेस और अगर प्लग आसपास नम मिट्टी पैक करने के लिए मिट्टी में अंकुर सुरक्षित. अंकुर चारों ओर से अगर के किसी भी हटा करने का प्रयास मत करो.
- मानक विकास शर्तों के तहत एक विकास के कमरे में प्रतिरोपित seedlings रखें. के लिए एक प्लास्टिक के ढक्कन के साथ पॉट कवरपहले दो दिनों के प्रत्यारोपण के बाद. इसके बाद ढक्कन को हटा दें और मानक स्थितियों का उपयोग पौधों को बढ़ने के लिए जारी है.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
Arabidopsis आइस कैप प्रणाली का उपयोग करने के लिए बड़े हो seedlings का एक उदाहरण 4A चित्रा में दिखाया गया है. ये seedlings आइस कैप फव्वारा में दो सप्ताह के लिए किया गया था जब चित्र लिया गया था और ऊतक फसल के लिए तैयार थे. ये वही अंकुर से रूट के ऊतकों 4B चित्रा में दिखाया गया है. Arabidopsis रूट ऊतक के एक नमूना से निकाले डीएनए की कुल राशि 100 एनजी के 700 एनजी 2 रेंज में आम तौर पर है. यह उपज गणना कच्चे जड़ निकालने के केवल एक भाग का उपयोग पर आधारित है. क्योंकि ca केवल. कच्चे जड़ निकालने के 10% आम तौर पर डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है, यह संभव है काफी अधिक जीनोमिक डीएनए बहाव विश्लेषण के लिए कच्चे तेल निकालने के अधिक बनाए रखने के द्वारा प्राप्त है. जीनोमिक डीएनए की कुल राशि का उपयोग कर प्राप्त बर्फकैप प्रक्रिया पीसीआर 2 प्रतिक्रियाओं के सैकड़ों करने के लिए पर्याप्त है .
चित्रा 1: आइस कैप की प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट . ए) अंकुर प्लेट युक्त अगर विकास मीडिया जिस पर seedlings उगना. जड़ें अगर घुसना और प्लेट के नीचे की ओर बढ़ने की. थाली के कुओं के नीचे में छेद चिपकने वाली फिल्म के साथ सील कर रहे हैं. बी) अंकुर प्लेट एक रूट प्लेट युक्त पानी के ऊपर और एक धातु की गेंद पर खड़ी है. जड़ें अंकुर प्लेट के कुओं के नीचे में छेद से बाहर निकलें और रूट प्लेट के कुओं के रूप में विकसित होने. सी) लकड़ी skewers अंकुर प्लेट और रूट प्लेट के बीच दिन पहले डाला जाता है खड़ी आइस कैप प्लेटें एक सूखी स्नान / बर्फ इथेनॉल में एक thermoblock में रखा जाता है. डी) एक बार रूट प्लेट में पानी ठोस जमे हुए है, अंकुर प्लेट रूट प्लेट से दूर खुली है, 96 ऊतकों के नमूनों के साथ एक रूट प्लेट उपजप्लेट और 96 व्यवहार्य seedlings के साथ एक अंकुर. लकड़ी skewers इस कदम के दौरान दो प्लेटों के विभाजन की सुविधा.
चित्रा 2: एक अंकुर प्लेट और एक रूट प्लेट के फोटो. ए) एक अंकुर प्लेट और एक रूट अलग से देखा प्लेट. बी) एक अंकुर प्लेट एक रूट प्लेट के शीर्ष पर खड़ी है. डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल इस्पात गेंदों रूट प्लेट के कुओं में देखा जा सकता है है. इलास्टिक बैंड के दो प्लेटों के साथ सुरक्षित किया जाता है.
चित्रा 3: आइस कैप फाउंटेन. आइस कैप फाउंटेन रूट प्लेट्स के कुओं की सबसे ऊपर की सटीक ऊंचाई पर एक निरंतर जल स्तर को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह निरंतर पानी प्रणाली सुनिश्चित करता है कि जड़ प्लेटों के कुओं में पानी वाष्पीकरण या स्वेद के लिए कारण हो समाप्त नहीं करता है. ए) एक घर बनाया रैककि कुकी शीट जिस पर खड़ी आइस कैप प्लेट्स बैठो का समर्थन करता है. बी) 1 "पागल है कि ठीक कुकी शीट का स्तर इतना है कि एक समान पानी की गहराई समायोजन फव्वारा की सतह भर में हासिल की है के लिए एक साधन प्रदान करता है की एक क्लोज़ - अप दृश्य सी) इस छवि के सभी प्रदर्शित करता है भागों के लिए घर एक आइस कैप फाउंटेन). डी इकट्ठे फाउंटेन आइस कैप के लिए रैक के निर्माण की जरूरत है एक पनडुब्बी फव्वारा पंप लगातार निचले जलाशय से कुकी शीट, जो घर का बना के शीर्ष पर टिकी हुई है पानी चाल. रैक एक वसंत लोड क्लैंप कुकी शीट के किनारे करने के लिए नली संलग्न किया है.
चित्रा 4: Arabidopsis seedlings आइस कैप की प्रक्रिया का उपयोग करते हुए बड़े हो . ए) शीर्ष दृश्य अंकुर प्लेट के दो कुओं में नीचे देख. हर अच्छी तरह से एक Arabidopsis अंकुर शामिल हैं. बी) एक रूट प्लेट के दो कुओं की साइड दृश्य. जड़ें घुमा देखा जा सकता हैकुओं की भीतरी सतह के आसपास. इस चित्र में seedlings आइस कैप फाउंटेन में कैरियर के लिए किया गया था. दो और सप्ताह जहां ऊतक फसल सामान्य रूप से प्रदर्शन होगा विकास मंच पर हैं.
Discussion
आइस कैप यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक वैज्ञानिक के लिए सैकड़ों या भी हजारों एक ही दिन में अलग - अलग पौधों की से ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा करने और कुशलता से उन नमूनों से जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं में उपयोग के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने में सक्षम बनाता है. एक व्यक्ति वैज्ञानिक seedlings के हजारों करने के लिए समय की एक छोटी अवधि में जीनोटाइप की क्षमता देकर, आइस कैप विधि आनुवंशिक प्रयोगों है कि अन्यथा प्रदर्शन करने के लिए व्यावहारिक नहीं होगा की एक संख्या की सुविधा की क्षमता है. कई उदाहरण नीचे प्रदान की जाती हैं.
- जेनेटिक मानचित्रण. ठीक पैमाने पर आनुवंशिक मानचित्रण अगर शोधकर्ता 3 गुणसूत्र के साथ एक विशिष्ट अंतराल के भीतर पुनर्संयोजन घटनाओं की पहचान करने में सक्षम है तेजी किया जा सकता है. यदि इस अंतराल एक बहुत ही कम आनुवंशिक दूरी शामिल है, तो पुनर्संयोजन घटनाओं अपेक्षाकृत दुर्लभ segregating मानचित्रण जनसंख्या में हो जाएगा. इस कारण से, यह अलग - अलग पौधों के हजारों स्क्रीन करने के लिए आवश्यक हो वांछित फिर से मिल सकता हैcombinant व्यक्तियों. आइस कैप के उपयोग के माध्यम से यह प्रक्रिया बहुत तेजी किया जा सकता है. जीनोम चौड़ा पुनः अनुक्रमण के युग में भी, यह अभी भी आवश्यक है करने के लिए सीधे दिखाना है कि किसी दिए गए उत्परिवर्तन ब्याज की एक phenotype के लिए सीधे तौर पर जिम्मेदार है. इन मामलों में, यह ब्याज के उत्परिवर्तन बारीकी से जुड़े अन्य म्यूटेशनों से दूर अलग क्रम में साबित करने के लिए के लिए एक उम्मीदवार उत्परिवर्तन वास्तव में प्रेरणा के लिए आवश्यक हो जाएगा. इन स्थितियों में, आइस कैप कसकर जुड़ा हुआ म्यूटेशनों की एक जोड़ी के बीच संबंध तोड़ने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करेगा.
- मल्टी - म्यूटेंट. यह Arabidopsis अध्ययन शोधकर्ताओं ने एक व्यक्ति में कई अलग loci से उत्परिवर्ती alleles गठबंधन करने के लिए कार्यात्मक 4-6 अतिरेक पर काबू पाने के लिए आम बन गया है. एक उदाहरण के रूप में, एक मामले में जहां एक चार अलग अलग loci से आनुवंशिक पार के माध्यम से एक एकल संयंत्र में उत्परिवर्ती alleles गठबंधन की इच्छा पर विचार करें. इस परियोजना के लिए, यह एक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो जाएगाn व्यक्ति है कि पार योजना के भाग के रूप में इन चार loci में विषमयुग्मजी है. जब इस चौगुनी विषम युग्मज सेट बीज, चौगुनी homozygote एक की एक संतान के परिणामस्वरूप जनसंख्या में 256 की दर पर उपस्थित होने की उम्मीद है. परंपरागत तरीके से इस दुर्लभ व्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग काफी श्रम गहन होगा. तुलना करके, इस परियोजना के लिए आइस कैप का उपयोग एक ही पीढ़ी में दुर्लभ चौगुनी homozygote की पहचान करने के लिए एक कुशल रणनीति के साथ वैज्ञानिक प्रदान करेगा.
- iTILLING. हमारी प्रयोगशाला हाल ही में 7 Arabidopsis में ब्याज की जीन में प्रेरित म्यूटेशनों की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का वर्णन किया. इस विधि बुलाया tilling है कि व्यक्तियों के साथ एक रासायनिक 8-10 उत्परिवर्तजन इलाज का आदेश दिया आबादी में परिवर्तन को खोजने के लिए प्रयोग किया जाता है एक की स्थापना की तकनीक पर एक भिन्नता है. हम हमारे iTILLING विधि का नाम है क्योंकि यह tilling की एक individualized संस्करण है कि एक इंडस्ट्रीज़ की अनुमति देता है हैividual वैज्ञानिक को पूरा करने के लिए कुछ है कि परंपरागत एक बड़े शोध टीम को पूरा करने की आवश्यकता है. आइस कैप iTILLING 7 विधि का एक अभिन्न हिस्सा है, के रूप में नीचे वर्णित है .
iTILLING के पीछे विचार यह एक अल्पकालिक उत्परिवर्ती जनसंख्या है, जो टिकाऊ उत्परिवर्ती पारंपरिक tilling परियोजनाओं के लिए बनाई गई आबादी के विपरीत में खड़ा है उपज है. ITILLING के लिए, 50 से 100 आइस कैप ब्लॉक में एक bulked M2 आबादी से बीज बोया जाता है, और डीएनए आइस कैप विधि का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है Arabidopsis seedlings तो 4 में रखा जाता है. डिग्री सेल्सियस जबकि उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग डीएनए आइस कैप का उपयोग किया जाता है preps. टमाटर seedlings 12 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं. एक बार seedlings को ले जाने के लिए वांछित म्यूटेशन की पहचान की गई है, वे आइस कैप प्लेटों से बरामद कर रहे हैं और मिट्टी को हस्तांतरित. iTILLING स्क्रीन करने के लिए एक पूरे समुदाय अनुसंधान के लिए एक लंबे समय से स्थायी उत्परिवर्ती जनसंख्या प्रदान करने के लिए इरादा नहीं है. इसके बजाय, iTILLING एक रणनीति प्रदान करता है जिसके द्वाराएक वैज्ञानिक जीन की एक मुट्ठी में परिवर्तन के लिए एक कस्टम उत्परिवर्ती जनसंख्या जल्दी स्क्रीन, कुशलतापूर्वक, और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर कर सकते हैं.
हम आइस कैप के लिए बढ़ रही है और जीनोटाइपिंग Arabidopsis, टमाटर, चावल, और के लिए एक प्रभावी तरीका हो पाया है. हमें उम्मीद है कि पौधों की अन्य प्रजातियां भी आइस कैप के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. प्रजातियों की विविधता है कि आइस कैप द्वारा समायोजित किया जा सकता है पर एक सीमा के बीज के आकार है. काफी छोटे बीज के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में फिट के साथ ही पौधों को इसके वर्तमान विन्यास में आइस कैप के साथ संगत हो जाएगा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या MCB-+०४४७७५०) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek | AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17x11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17x11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any Supplier | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Biosciences | 351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local Grocery Store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local Grocery Store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar - cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholin–thanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene Limited | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00" x 54.6 yd | Office Max | Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾"disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. | |
References
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