Summary
Gravações extracelular da atividade neuronal utilizando sondas de silício no rato anestesiado serão descritas. Esta técnica permite obter informação através de múltiplas áreas do cérebro de mais de 100 neurônios simultaneamente. Ele fornece informações com resolução única célula neuronal sobre a dinâmica conjuntos em vários circuitos locais.
Abstract
Em larga escala a partir de gravações eletrofisiológicas ensembles neuronal oferecem a oportunidade de investigar como o cérebro coordena a grande variedade de comportamentos da atividade spiking de seus neurônios. Um dos métodos mais eficazes para monitorar spiking atividade de um grande número de neurônios em vários locais simultaneamente circuitos neuronais é usando estruturas de silicone com eletrodo 1-3.
Potenciais de ação transmembrana produzir mudanças grandes de tensão nas proximidades da somata celular. Estes sinais de saída pode ser medido pela colocação de um condutor muito próximo de um neurônio. Se há muitos ativos (spiking) neurônios na vizinhança da ponta, o eletrodo registros sinal combinado de todas elas, onde a contribuição de um único neurônio é ponderado pela sua "distância elétrica". Sondas de silício são eletrodos de registro ideal para monitorar neurônios múltiplos por causa de um grande número de sites de gravação (64) e um pequeno volume. Furthermore, vários sites podem ser organizados por uma distância de milímetros, permitindo assim a gravações simultâneas de atividade neuronal nas várias camadas corticais ou em várias colunas cortical (Fig. 1). Importante, a distribuição geométrica precisa dos locais de gravação também permite a determinação da relação espacial entre os quatro neurônios isolados único. Aqui, descrevemos uma aguda, a gravação em larga escala neuronal da esquerda e da direita córtex somatosensorial forelimb simultaneamente em um rato anestesiado com sondas de silício (Fig. 2).
Protocol
1. Preparação cirurgia
- Anestesiar o rato com o tipo apropriado ea dose de anestésicos. Aqui usamos uretana (1,5 g / kg, Sigma-Aldrich Co., St. Luis, MO) - preparado como solução a 20%, diluindo 20 g de uretano em 100 ml de tampão fosfato (PBS) ou seja, o animal receberá 7,5 ml / kg de uretano solução por via intraperitoneal (IP). Por causa de sua curva dose-resposta, a dose total de uretano é dividida em quatro aplicações, cada uma separada por aproximadamente 30 minutos. Antes de as duas primeiras aplicações de uretano, animal é anestesiado com isoflurano administrado em uma concentração de 3-4% (oxigênio a 2 litros por minuto) e mantida em 2% (oxigênio em até 2 litros por minuto) para evitar que um animal de ficar estressado por injeção. Durante a cirurgia, uma administração adicional de isofluorano (concentração de 2% por 2 minutos) podem ser usados se necessário.
- Raspar a pele ao longo do local da incisão (lado dorsal da cabeça) para garantir quea pele não vai contaminar a ferida, e que uma área suficiente pode ser desinfectado todo o local da incisão.
- Prepare sítio cirúrgico anti-septicamente usando iodo orgânico ou sabonetes anti-sépticos clorexidina e (etanol).
- Prepare sondas de silício (NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI). Sondas podem ser desinfectados com álcool 70%, seguido por lavagem com água destilada. Se necessário, as sondas podem ser pintadas com um marcador fluorescente anti-septicamente preparado (por exemplo, Dye I, Invitrogen Co.), para depois revelar a posição da sonda na análise histológica. Para fazer isso, use um pincel pequeno e muito macia e delicadamente toque na parte de trás da sonda de silício com o corante. Este procedimento deve ser feito sempre ao longo de um microscópio para verificar se a sonda não está sendo danificada ou dobrada. Sempre certifique-se que o corante não está bloqueando qualquer um dos canais. Qualquer corante residual deixado na sonda pode ser removido mais tarde com o álcool, seguido de lavagem com água.
- Silicon electrodcuidados es: Por causa de seu pequeno tamanho, as sondas de silício são delicados e extremamente suscetíveis a quebrar, mesmo quando usá-lo com cuidado. Assim, recomendamos monitoramento perigos potenciais em todos os momentos, tais como: (i) Mantenha as sondas em uma caixa devidamente designado; (ii) Evitar cair ou deixar cair as sondas ao manipulá-las, (iii) Certifique-se que os manipuladores estereotáxica são bem fixa para evitar acidentes; (iv) Quando a gravação do tecido, ao redor e / ou sangue pode anexar para as sondagens. Portanto, é importante ser também cuidado ao remover as sondas após a gravação. Usando um fluxo constante de solução PBS ou salina é fortemente recomendado, (v) Sempre limpe as sondas após a gravação. Para limpar as sondas, é altamente recomendável colocá-los em um produto líquido enzimático (Boston, Bausch & Lomb) por alguns minutos. Sempre lave as sondas com água destilada e devolvê-los à sua caixa dedicada. Em nossa experiência, os cuidados adequados das sondas de silício garanteboas gravações de qualidade para mais de 10 experimentos. Se um canal 'fica barulhento' durante o uso, que devem ser excluídas das análises subseqüentes. Descobrimos que cross-talk entre os canais é mínima, portanto um canal ruidoso geralmente tem muito pouco efeito sobre um sinal de outros canais.
2. Cirurgia
- Aplicar um olho pomada sobre a superfície do olho antes de qualquer cirurgia manipulações.
- Administrar dexametasona 5 mg / ml por via subcutânea para reduzir a inflamação cerebral.
- Corrigir o animal no quadro estereotáxico toda a cirurgia.
- Administrar lidocaína HCl 2% com epinefrina (2-4 mg / kg diluído em solução a 0,5%) por via subcutânea no local da incisão antes da incisão é feita para reduzir o risco potencial de o sangramento da ferida e para anestesia local.
- Faça uma incisão através de dois centímetros da linha média do couro cabeludo e deslocar lateralmente a pele para expor a superfície do crânio.
- Limpar o couro cabeludo dorsal do fascia por dissecção romba e controleo sangramento por microcautery ou usando cera de osso.
- Faça dois furos para prender pequenos parafusos no osso occipital do crânio para o aterramento de animais e de referência. O parafuso de referência deve estar em contato com dura. A fim de reduzir o ruído elétrico durante as gravações, ele é recomendado para manter os parafusos molhada o tempo todo. Para fazer isso, uma pequena barreira de acrílico em torno dos parafusos pode ser construída ou os parafusos podem ser cobertas com agar.
- Fazer uma craniotomia diâmetro 1-2 mm nas coordenadas correspondente à área cortical e / ou subcortical (s) de interesse 5. Use ar comprimido para remover o pó de osso, conforme necessário durante a craniotomia (orifício de perfuração). Evitar crânio warm up de perfuração através da aplicação de gotas de PBS. Fazer uma craniotomia segundo, se necessário para inserir a segunda sonda. Neste vídeo, estamos apresentando uma gravação de duas áreas corticais simultaneamente, portanto, duas craniotomias são feitas.
- Construir uma pequena barreira de resina acrílica (por exemplo: Lang DentalManufacturing, Co., Inc., Wheeting, IL) em torno das duas craniotomias para manter PBS em cima do exposto dura, impedindo-o de secagem. Aplicar PBS constantemente durante todo o experimento.
- Abra a matéria dura de ambas as craniotomias. Duas agulhas (30 ½ gauge) dobrado na ponta (formando um gancho), pode ser utilizado para esta manipulação.
- Ligue o conector das sondas de silício para a manipulatiors estereotáxica. Conectores estão ligados a um poste a fim de ter as patas das sondas perfeitamente paralelo ao manipulador estereotáxica. Isto é crucial para manter registros estáveis e evitar danos sonda.
- Conecte o parafuso de referência para o pino de referência sonda de silício. Para reduzir o ruído elétrico os parafusos chão tem que ser conectado a: i) o terreno da ficha sonda; ii) solo do chassi do aparelho de gravação, e iii) o quadro estereotáxico.
- Coloque a ponta das sondas de silício apenas em contato com a pia.
- Lentamente introduzir ªsondas de silício e e certifique-se que as hastes das sondas de silício (Fig. 1 e 2) podem ser inseridos no cérebro sem resistência ou flexão.
- Cuidadosamente abaixe as pontas até atingir área de gravação desejado. Se necessário, adicione gotas de PBS no topo de craniotomias para evitar a secagem do tecido.
- Porque a anestesia uretano só deve ser utilizado para procedimentos de terminal, o animal é sacrificado por uma injeção ip de pelo menos 200mg/kg de pentobarbital sódico diluída a uma concentração não superior a 60 mg / ml. Isto é seguido pela decapitação do animal.
3. Resultados representativos:
Gravações representante de potenciais de campo locais e atividade spiking são ilustrados na Figura 3A. Depois de realizar triagem pico (picos de discriminar provenientes de diferentes neurônios; Fig. 3B, C, 6, 7, 8) gravações de silício sonda fornecem a capacidade de investigar a atividade neuronal população envolvida, among outros, os seguintes processos: memória e tomada de decisão 9, 10 plasticidade, o estímulo de codificação 11, 12 e atividade espontânea efeitos de várias drogas 13.
Figura 1. A. Exemplo de uma sonda de silício com uma haste única é sobreposto a uma montagem de neurônios reconstruída (cortesia de S. Sakata 14). B. Exemplo de uma sonda com uma configuração tetrode em cada um dos oito hastes. Esquemático de um C. crânio de ratos. As caixas verdes representam a extensão da craniotomia sobre o córtex somatosensorial direito e esquerdo.
Figura 2. Exemplo de experimento com sondas de silício inserido no córtex pré-frontal e hipocampo. Gotas de PBS cobrir a craniotomia para proteger o br expostosain da secagem. Dois parafusos localizados ao longo do cerebelo será ligado à terra e referência, respectivamente.
Figura 3. Imagem mostra A. 500ms de uma gravação representante eletrofisiológico de Potencial de Campo Local (LFP) de um tetrode (nota: tensão negativa é traçado em cima da ordenada). Mostra Inserir - uma forma de onda de um ponto B. bidimensional visualizações de clusters unidade em espaço de características a partir de 1 tetrode.. Cada cluster representa picos de uma única unidade (neurônio). C. Média pico de onda das unidades representativas (codificados por cores) em cada um dos quatro locais de gravação de um tetrode único. D. Waveform energia (relacionada à amplitude) dos picos registrados ao longo do tempo . Observe os valores de energia relativamente constante para cada unidade, o que indica uma gravação estável ao longo da duração do período exibido.
Discussion
Este artigo demonstra como usar as matrizes de eletrodos de silicone para gravar a partir de grande população de neurônios (> 100) em múltiplas áreas corticais simultaneamente. Para ser bem sucedido na cirurgia e gravação, as seguintes questões devem ser consideradas:
- Introdução das sondas a uma área desejada: Ao inserir as sondas no tecido cerebral, é possível causar danos consideráveis. Isso pode resultar em uma baixa qualidade das unidades registradas. Para evitar este problema, recomendamos o seguinte: (i) Introduzir a sonda em um ângulo certo grau (recomendado o uso de um ângulo de 10 graus). Ao fazer isso, danos dendríticas dos neurônios registrados podem ser reduzidos, (ii) Após as sondas são inseridos no tecido cerebral, que são inicialmente reduziu em um ritmo mais rápido (aproximadamente 50 a 100 microns por 10-30 seg) até se obter mais perto da área desejada de gravação. Quando as sondas são cerca de 200 mícrons da zona-alvo, a posição é ajustada de forma mais lenta (cerca demadamente 10 microns cada 2 ou 3 minutos).
- Estabilização das gravações: Quando as sondas estão na área designada e considerável atividade é detectada (picos distintos na maioria dos canais), recomenda-se esperar cerca de 30 minutos antes de iniciar uma gravação. Isso permitirá que o tecido cerebral para estabilizar mecanicamente após a inserção de sondas e garantir uma gravação mais estável.
- Pulsação cerebral: Ocasionalmente, é possível ver a pulsação do cérebro que pode reduzir significativamente a qualidade de uma gravação. A craniotomia pequena (espaço suficiente para caber a sonda) pode reduzir a pulsação do cérebro em uma área de gravação. Se necessário, a cisterna magna pode ser perfurado. Isto reduz a pressão do líquido cefalorraquidiano e diminui o inchaço e pulsação.
- Silicon configuração da sonda: sondas de silicone podem ter uma variedade de formas e configurações de local de gravação. Por exemplo, eles podem variar em número de hastes, o comprimento ea espessura das hastes, e emo arranjo dos locais de gravação (por exemplo tetrode configuração vs linear; ver: www.neuronexustech.com). A escolha da sonda utilizada com uma configuração específica depende da questão científica que precisam ser respondidas. Por exemplo, se o objetivo é registrar as populações de neurônios em vários locais em uma camada específica (como apresentado nestas gravações), a melhor opção é usar uma sonda com oito hastes e uma configuração tetrode. Isto permite gravações de várias unidades em cada tetrode e amostragem de oito localidades através de uma extensão 1,4 milímetros. Em outro exemplo, se alguém gostaria de estudar a atividade de material de propagação através das camadas corticais, a melhor opção seria a utilização de uma sonda com uma haste com os locais de gravação distribuídos regularmente ao longo desse haste que permite a gravação em múltiplas camadas corticais simultaneamente 14.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela NSERC & AHFMR. Os autores agradecem Mariam Alaverdashvili e Amanda Mauthe-Kaddoura para comentários sobre o manuscrito e Yamazaki Hiroe para ajudar na preparação da cirurgia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Isoflurane | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Dexamethasone 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Eye ointment | Vétoquinol | 005165414 | |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Electrode manipulator and holder | Kopf Instruments | 960 | |
| Rat ear-bars | Kopf Instruments | 1955 | |
| Rat adaptor | Kopf Instruments | 920 | |
| Anaesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ gauge needles | BD Biosciences | 305115 | |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 | |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Bone wax | Lukens | M263500 | |
| Compressed air bottle | Falcon BD | 50-10521C | |
| Enzymatic cleaner | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Distilled water | |||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 | |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | ||
| Alligator cables |
References
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