Summary
우리는 세포와 도금 매체로 읽어 좋았 냐고 물어 봤어, 캐나다의 국립 연구 협의회 소독하고,,,,에서 가공 및 electrophysiological 녹음에 사용하는 방법 평면 패치 - 클램프 칩 보여줍니다.
Abstract
그 섬세한 감성과 이온 채널의 레벨에서 각각의 세포를 모니터하고 제어할 수있는 능력으로 인해, 패치 - 고정은 전기 생리학의 황금 표준 모두 한 질병 모델과 제약 화면에 적용됩니다. 방법은 전통적으로 부드럽게 그 정점이 아래 멤브레인의 패치를 분리하기 위해 생리적 용액으로 채워진 유리 피펫으로 세포에 문의하는 것입니다. 피펫에 삽입 전극은 전체 세포를 위해 파열 멤브레인 패치하거나 내에서 이온 채널의 활동을 캡처합니다. 지난 10 년, 패치 - 클램프 칩은 대안 3, 4로 제안되었습니다 정지 필름 배지에서 생리 매체를 분리하고, 영화 microfabricated 조리개는 피펫의 꼭대기를 대체합니다. 패치 - 클램프 칩은 자동화 시스템에 통합과 높은 처리량 검사 5 상용화되었습니다. incr하기처리량을 완화, 그들은 휴대 프로브 바다표범를 검색하고 전체 세포 모드로 들어가는 유체 정지에서 세포의 전달, 흡입에 의한 조리개에서 자신의 위치, 그리고 자동화된 루틴을 포함합니다. 우리는 최적화된 임피던스와 교양 달팽이 뉴런의 행동 잠재력 6 고품질 녹음을 허용하는 오리피스 형태로 실리콘 패치 - 클램프 칩의 제조에보고에 따르면, 최근에, 우리는 또한 포유류의 뉴런에게 7 심문으로 진행 상황을보고했습니다. 저희 패치 - 클램프 칩은 캐나다 Photonics 제작 센터 8, 상용 공장에 가공, 대형 시리즈에서 사용할 수 있습니다. 우리는 서로 다른 모델 NRCC 기술의 사용을 확인할 electrophysiologists와 협력에 종사하는 열망입니다. 칩은 그림 1에 나타나 일반적인 방식에 따라 사용됩니다 : 실리콘 칩은 플렉시 글라스 문화 유리병와 조리개의 뒷면 하단의 것은 지하 chann에 연결되어엘은 패키지의 양쪽 끝에 튜브가 장착되어. 전지는 유리병에 배양해되며 프로브 위에 세포는 유체 포트가 세포에 최소한의 방해와 솔루션 교류를 촉진 밖 channel.The 두 삽입 측정 전극에 의해 모니터링되고,이 세포 내 용 유리 pipettes에 비해 장점이다 재관류.
그림 1. NRCC 패치 - 클램프 칩을 사용하여 측정의 원리
여기서 우리는 세부 소독 및 주요 칩, 세포와 매체, 판 그들과 함께 그들을로드하고, 마지막으로 electrophysiological 음반들을 위해 사용하는 프로토콜.
Protocol
1. 칩 제조
3 μm의 두께 셀프 스탠딩 필름, 낮은 1 Mohm 접속 저항과 셀 9 친밀한 인감을 용이하게 매끈한 표면 깔대기 모양의 개구에서 6 결과에 설명된 과정은 그림 2를 참조하십시오. 칩은 지하 채널에 칩을 연결하는 구멍을 마주 조리개와 singulated와 플렉시 글라스 패키지에 접착된다. gluing은 공칭 17 PF에 션트 커패시턴스를 최소화하는 방향으로 적절합니다. 패키지는 두 1.5 밀리미터 직경 및 유체 포트가 6mm 긴 유리 튜브 (그림 3)가 장착되어있다.
그림 2. NRCC 패치 - 클램프 칩의 중심 이온 빔 섹션의 전자 현미경 스캐닝은 부드러운 이산화 규소 표면과 친밀한 세포 연락처를 하시더군요 퍼널 형상, 그리고 낮은 액세스 resistanc위한 차지하고있는 얕은 구멍을 보여줍니다전자.
그림 3. 칩은 지하 fluidics와 유리 튜브를 들으며 플렉시 글라스 패키지에 문화 유리병의 하단에 붙어있다.
2. 살균, 프라이밍 및 테스트
다음 단계는 조리개의 오염이나 도전을 방지하기 위해 생물 안전 캐비넷에서 수행해야합니다.
- 18 W. 기타 에어 플라즈마 시스템의 최대 전력 15 분 0.1-0.3 mbar 잔류 공기 압력으로 Harrick 기본적인 플라즈마 클리너 (www.harrickplasma.com)에 칩을 소독은 비교 출력 밀도 (24 MW로 사용할 수 있습니다 / cm 3)와 전력 밀도와 시간의 제품이 일정한 유지. 플라즈마 처리는 마중물을 용이하게하는 칩이 친수성 렌더링.
- 멸균 Silastic 연구실 실리콘 튜브, 1mm 아이디 X 2mm OD (콜 Parmer와 유리 튜브를 장착고양이. 한쪽엔 # 96115-08), 3inch, 반대쪽에 1 인치.
- 아무런 거품이 갇혀되지 확인하고, 무균 여과 표준 인산염 완충 용액 (PBS)와 튜브를 통해 fluidics를 채웁니다.
- 한 현금 지급기에서 짧은 측면에서 PBS를 pressurizing 동안 긴 실리콘 튜브를 고정. 조리개를 통해 들어와서 PBS의 수영장 유리병에서 볼 수 있습니다. PBS의 가압 공급을 클립하고 해당 공급 장치에서 짧은 실리콘 튜브를 분리합니다.
- PBS는 주사기를 사용하여 필터링으로 병을 채우십시오.
- 망할 CIA의 짧은 튜브 전극과 유리병에 반대 전극 : 자세 / 자세 젖어. 임피던스 미터 접속 저항이 있는지 확인하는 데 사용됩니다 300kohm 및 3Mohm 및 션트 커패시턴스 10pF 및 25pF 사이 사이입니다. 낮은 저항과 칩 누출이있을 가능성이 있으며, 그것이 세포의 전기 생리학 6 빠른 역학을 캡처하지 않을 수로 높은 용량을 사용하기 위해 부적절하게 간주됩니다. 낮은 커패시턴스와 칩이상의 저항은 그것이 거품이 구멍에 갇혀있는 것을 간단하게있을 수 있지만, 전원 연결로 간주됩니다. 일부 칩은 상반기 이후 다시 테스트 및 올바른 전기 임피던스를 갖고 찾을 수 있습니다.
- 멸균 탈이온수있는 유체 채널을 소독하고, 맨 병을 비우 같은 두 번이나로 린스.
- 멸균 탈이온수 가득 무균 용기에 다른 칩을로드 후 30 분 동안 신선한 멸균 탈이온수의 튜브와 패키지 칩을 젖어. 이 칩은 친수성과 오염으로부터 보호 남아 있도록합니다.
3. 세포 생물 실험실에 칩 준비
다음 단계는 무균 기술을 사용하여 HEPA 여과 층류 후드에서 수행되며,이 절차에서 사용되는 모든 솔루션은 0.22μm 필터를 사용하여 사용하기 전에 소독을 필터링해야합니다.
- HEPA 필터 층류 후드 아래에 칩을 컨테이너를 열고 conta에서 칩을 제거iner 맨 위로 유리병에 가능한 떠다니는 오염 물질을 떠서 피하기 위해 아래로 직면하고 있습니다.
- 칩 표면에서 잔여 부스러기를 제거하는 신선하게 여과 멸균 탈이온수와 칩 2X의 유리병 상단을 씻어.
- 상단 유리병 밖 멸균 탈이온수을 기음.
- 멸균 여과 탈이온수를 포함하는 가압 주사기로 유체 채널에 부착된 silastic 튜브의 한쪽 끝을 연결합니다. 우리의 시스템에서 솔루션으로 가득 주사기는 20psi로 설정된 압축 공기 탱크에 연결하여 가압 수 있습니다. 불임을 보장하기 위해 공기 주사기 입국 이전 (0.22 μm의 필터) 필터링 및 시스템은 필요할 때 우리에게 압력을 중지하거나 적용할 수있는 켜기 / 끄기 밸브를 가지고있다.
- hemostat 이용하여 튜브의 출력 끝을 클램프.
- 솔루션의 기압을에서 / 밸브 오프 엽니다.
- 신선한 멸균 탈이온수로 칩의 subterranen 유체를 헹굴하려면 튜빙의 출력 끝을 unclamp.
- 하기위한조리개를 통해 CE가 물 위로, hemostat로 튜빙의 출력 끝을 클램프.
- 물 배수를 방지하려면 hemostats로 튜빙의 입력 및 출력 끝을 클램프와에 / 밸브 해제 닫습니다.
- 주사기의 튜브의 입력 엔드를 분리합니다.
- 튜브의 양쪽에 유리 플러그를 삽입하고 hemostats를 제거합니다.
- 필터 steriled 탈이온수로 가기 병을 채우십시오.
- 100mm 멸균 요리의 기본으로 35mm 멸균 접시의 뚜껑을 놓으십시오
- 100mm 접시 덮개와 35mm의 뚜껑 및 덮개 위에 장소 칩.
- 이미지 칩은 칩 막과 조리개는 부스러기 및 / 또는 기포 무료임을 보장합니다. 우리가 실험실에서 우리가 직립 현미경과 20x 긴 작동 거리 목표를 사용합니다.
- 잔해 및 / 또는 공기 방울이있는 경우, 반복적으로 유체 채널과 최고의 병을 플러시. 잔해 및 / 또는 공기 거품이 제거되지 않을 경우 칩은 삭제됩니다.
- 칩은 일단군데, 층류 후드로 돌아가서 튜브의 양쪽을 뽑습니다.
- 생리 미디어를 포함하는 가압 주사기에 튜브의 한쪽 끝을 연결합니다.
- hemostat로 튜빙의 출력 끝을 고정
- 압력 밸브를 열고 fluidics의 출력 끝에서 hemostat를 제거하고 생리적 매체와 유체 채널을 플러시
- 생리적 매체와 지하 유체를 헹굴하려면에서 / 밸브 오프 열고 튜브의 출력 끝에서 hemostat를 제거합니다.
- 조리개를 통해 생리 미디어를 강제하려면 hemostat로 튜빙의 출력 끝을 클램프.
- hemostat로 튜브의 입력 끝을 고정하고에 / 밸브 해제 닫습니다.
- glas 플러그와 튜브의 양쪽 주사기 및 플러그에서 튜빙의 입력 끝을 제거합니다.
- hemostats를 제거합니다.
- 상단 유리병에서 물을 제거합니다.
- 필터 멸균 생리 미디어 맨 병을 채우십시오.
- 100mm 배양 접시에 칩 돌려 놓으십시오.
- 100 밀리미터 그릇에 35 밀리미터 접시의 기반을 놓고와 습도를 풍부하게하기 위해 필터 소독 탈이온수로 채운다.
- 그것이 도금 시간까지 요리를 커버
4. 달팽이 뉴런의 세포 도금
패치 - 클램프 칩은 준비 다양한 적합 있습니다. 현재 포유류의 기본 피질 뉴런으로 우리 칩을 테스트하고 있으며 살균 프로토콜 적합함을 나타냅니다하며 칩은 장기적인 문화에 세포 독성 않다는 것을 십사일 7 일 동안 배양해 세포와 예비 결과를 획득했습니다. 그들의 연결을 전기 생리학 11을 공부하는 간단하지만 잘 창업 모델을 대표하고, 우리가 날짜를 10 ~ 가장 중요한 결과를 얻은 것으로 그 세포로하기 때문에이 프로토콜의 목적, 달팽이 뉴런이 선정되었습니다. 상세 전지 격리와 문화 절차도이전에 12, 13을 설명되었습니다.
10 % Listerine를 포함 Lymnaea 염분의 무딘 포셉 및 마취 동물 2-3개월 오래된 Lymnaea의 stagnalis에서 바깥쪽을 제거합니다.
모든 후속 단계는 실온에서 소독을 해부 장비 및 솔루션 판상 공기 후드 내에서 무균 수행했습니다.
- Eppendorf 피펫을 사용하여 적절한 녹화 솔루션 fluidics의 생리 미디어를 교체합니다. Lymnaea의 뉴런의 경우 솔루션이 포함되어 있습니다 (㎜에서) : 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic 산 (EGTA) 및 5 4 - (2 - 히드록시 에틸)-1-piperazineethanesulfonic 산성 (HEPES, pH는 7.4 ; 130 mOsm) 14
- Lymnaea 식염수로 가득 Sylgard 그릇에 달팽이를 핀과 이전 13 설명된대로 전체 뇌를 제거
- isolat을 치료15 분 동안 DM와 트립신 억제제의 치료 (시그마, 콩, 카탈로그 # T-9003)에 의해 다음 18분위한 트립신 효소와 정의 미디어 에드 두뇌 (DM) (0.2 % 솔루션, 시그마, 카탈로그 # T-9201).
- (-; 20 ML DM으로 1M 포도당 용액 750 μL 포도당이 추가로 DM HODM) 미디어를 정의 높은 osmolarity 가득한 작은 Sylgard 요리로 머리 핀.
- 미세 포셉 및 해부 가위 사용하여 뉴런을 노출, 관심있는 신경의 바깥쪽과 안쪽 껍질을 제거하십시오.
- 신경 세포는 두뇌에서 분리하고 피펫으로 정지 때까지 관심 (왼쪽 페달의 지느러미 1) 세포 가까운 부드러운 흡입을 적용 HODM 가득한과 microsyringe에 부착된 화재 광택 유리 피펫을 사용하여.
- 유리 피펫 그런 다음 이사 microsyringe에서 부드러운 퇴학는 뉴런이 부드럽게 피펫에서 밀쳐 및 칩에 대한 개별 패치 구멍 위에 놓여 수 있습니다 개별 neurochips로 감소된다.
- 세포가 조리개를 둘러싼 칩 표면에 그들의 부착을 촉진하기 위해 상온에서 2 시간의 최소한 그대로 앉아 허용합니다.
5. Electrophysiological 녹음
(우리의 경우 Multiclamp 700B 증폭기, 분자 디바이스, 포스터 시티, CA, 미국) 앰프 칩을를 연결하려면
- 지하 유체와 적절한 녹음 솔루션과 칩 유리병의 솔루션을 교체합니다. Lymnaea의 뉴런의 경우, 상위 문화 실이 (㎜보기 : 51.3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCl2 및 MgCl2 1.5) Lymnaea 식염수 가득은 HEPES와 산도 7.9로 버퍼링된 14.
- 안정성 들어, 접착제 유리 슬라이드를 향해 칩 및 현미경으로 그것을 놓으십시오.
- 앰프 (우리의 경우 Multiclamp 700B 증폭기, 분자 디바이스, 포스터 시티, CA, 미국)에 칩을 연결하려면 튜브의 한쪽 끝을 잘라 silve를 삽입R 와이어있는가 머리 단계에 연결되어 있습니다.
- 칩 상단 유리병의 기준 전극을 배치합니다.
- 칩은 이제 레코딩을위한 준비가되었습니다.
- ; 전체 셀 (RT는 = 50-100 MΩ 플러스 용량성 과도, 지표 (R t> 1 GΩ) 셀 - 첨부 : 총 저항을 측정 (R T)와 뉴런의 구성을 결정하기 위해 앰프와 5 MV 단계를 적용 아니오로 밀봉 (MΩ R T <5), 멤브레인 조리개여 파열)의. 실험 10 마지막 세트에서, 세포의 58% %의 높은 저항 바다표범을했고, 그 때문에 세포의 80 %가 고르기가 응답을 보여주었다.
6. 대표 결과
- 신경 세포 (이 경우 LPeD1)로 전류 펄스를 (20 PA 증가) depolarizing 적용합니다.
- 그 휴식 잠재적으로 VM 가까운 (- 60 MV ~)에서 신경 세포를 잡아.
- 이러한 depolarizing 펄스에 반응을 관찰. Overshooting 작업 잠재력해야신경 세포가 가능한 경우에는 관찰한다.
- 그림 4는 14, 15 년 세부에서 설명하는 대표적인 결과를 보여줍니다.
세포내 전류 펄스 (아래)의 등급 시리즈 LPeD1 신경 세포의 그림 4. 전압 응답 (상단). 60mV - 전류 펄스는 VM =에 적용되었다.
문제 해결
- 막과 조리개 조각이 자유롭고 도금에 적합한 경우에 도금하기 전에 이미지 칩은 결정합니다. 우리는 직립 현미경과 20x 긴 작동 거리 목표를 사용합니다. 실험 1의 마지막 세트에서 칩을 67 % %가 성공적으로 그 방식으로 끝났다되었다.
- 잔해 및 / 또는 기포가 있으면 칩을를 버리고 다른 하나를 시도해보십시오.
- 각종 표면 처리 (혈장) 또는 코팅은 (PDL, PEI 등) 재판을받을 수 있지만 성공은 세포 유형에 따라 크게 의존있을 수 있습니다사용됩니다.
- 기가 - 도장과 전체 세포의 형성에 중요의 유체 ( "피펫") 솔루션의 구성. osmolarity, 산도, 그리고 이온 메이크업에 신경을 쓰는, 솔루션을 조정합니다.
- 장기 문화, 부드러운 중력 수사관 재관류 (~ 0.5 ML / 분)을 통해 녹음하기 전에 솔루션을 피펫로 전환 후, microfluidic 채널의 미디어와 함께 시작합니다.
Discussion
NRCC의 패치 - 클램프 칩 심문 플랫폼은 높은 정보량 제약 assays를위한 잠재적으로 강력한 도구이며, 질병의 체외 모델에서 조사를. 유리 pipettes에 비해 그것의 장점은 대형 세포를 알아내기 위해 장점은 낮은 접속 저항이며, 약간 더 큰 정전 용량에도 불구하고 작은 세포에 대한 비교 역학집니다. 개구 물개의 자연 세포는 정기적으로 취득했으며, 전체 셀 항목은 자발적인 14 것으로 관찰되었습니다. 칩 및 유리 피펫 방법 사이의 명확한 차이는 프로브는 세포 배양 접시의 일부이며 수동으로 세포막과 접촉 가져되지 않는다는 사실입니다. Culturing 세포, 기능적 네트워크의 가능성이 일부 질병 모델로서보다 생물학적으로 관련성이 높은 모델 결과와 바다표범 16을 알아내기 위해 높은 셀 보안을위한 다른 메커니즘. 그러나, 세포 현탁액과 대조적으로 흡인 cannoT는 프로브의 셀을 배치하는 데 사용됩니다. 달팽이 뉴런은 다른 대형 세포로 프로브의 꼭대기에서 수동 위치 결정 의무가 있습니다. 에서 세포의 이상 문화 시간을 필요로하는 작은 세포 들어, 우리는 어떠한 조작에 대한 필요성을 obviated와 프로브 위에 세포를 배치하는 프로브 위에 patterning의 유착 polypeptides에 의해 도장을 얻기의 높은 확률을 유지하고, 증명 배치 프로브 17,18.
NRCC 또한 유리 피펫의 비교 용량으로 microfluidic 패치 - 클램프 칩 19 polyimide 개발하고있다. 그 프로젝트의 궁극적인 목적은 허용 개별 이온 채널 14 해상도에서 네트워크 행동에 종사하는 여러 뉴런의 electrophysiological 활동의 동시 모니터링.에게 여러 프로브 패치 - 클램프 칩입니다 이 방법은 다중 전극 배열 20 ~ 고해상도 보완적인 방법입니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 어셈블리와 도움을 패치 - 클램프 CPFC에서 칩, 그리고 색조 트란, 탁구 조 및 마태복음 Shiu의 제조를 위해 알렉세이 Bogdanov을 인정하고 싶습니다. Naweed 셰야드는 보건 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 학회에 의해 지원되었다. 콜린 도르바은 NSERC과 의학 연구 (AHFMR) studentships 대한 알버타 헤리티지 재단의 수상자이다.
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