Summary
אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.
Abstract
מחזורי גיוס של לויקוציטים מזרם הדם אל הרקמה הדלקתית היא תהליך חיוני ומורכב של 1,2 דלקת. ב venules postcapillary של רקמה דלקתית, leukocytes בתחילה לקשור אנד רול על פני השטח של הקיר luminal venular. רולינג מעצר leukocytes על האנדותל ולעבור הידבקות המשרד בתגובה chemokine או chemoattractants אחרים על פני venular. Leukocytes חסיד רבים לעבור מאתר הראשונית של הידבקות לאתר extravasation junctional ב האנדותל, תהליך שמכונה intraluminal זחילה 3. לאחר זחילה, leukocytes לנוע על פני האנדותל (גלגול) ולהעביר ברקמות extravascular לעבר מקור chemoattractant (chemotaxis) 4. מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא in vivo ו חושף מנגנונים תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים 2,5. בדו"ח זה, אנו מספקים תיאור מקיף של באמצעות מיקרוסקופ brightfield intravital לחזות ולקבוע את תהליכי מפורט של גיוס נויטרופילים בשריר cremaster עכבר בתגובה שיפוע של chemoattractant נויטרופילים. כדי לגרום לגיוס נויטרופילים, פיסה קטנה של ג'ל agarose (~ 1-3 מ"מ גודל) המכיל chemoattractant נויטרופילים MIP-2 (CXCL2, chemokine CXC) או WKYMVm (TRP-Lys-Tyr-Val-D-Met, אנלוגי סינתטי של פפטיד חיידקי) מושם על ברקמת השריר הסמוך ורדיד postcapillary ציין. עם הזמן שחלף צילום וידאו במחשב תוכנה ImageJ, זחילה נויטרופילים intraluminal על האנדותל, הגירה transendothelial נויטרופילים ואת הגירה chemotaxis ברקמות הם דמיינו מסומנים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח אמין כמותי של פרמטרים רבים לגיוס נויטרופילים כגון מהירות זחילה intraluminal, גלגול זמן, זמן הניתוק, מהירות העברה, מהירות chemotaxis ומדד chemotaxis ברקמות. אנו מראים כי בפרוטוקול זה, פרמטרים אלה גיוס נויטרופילים ניתן לקבוע ביציבות לבין תנועה תא בודד מעקב נוח in vivo.
Protocol
1. הכנת Chemoattractant ב agarose ג'ל
- פיפטה 10 מ"ל של 2 × PBS בצינור 50 מ"ל חרוטי, ואת לחמם את הצינור על ידי הכנסתו לתוך כוס המכילה מים חמים.
- פיפטה 10 מ"ל של מים מזוקקים ולהוסיף 0.4 גרם אבקת agarose בצינור 50 מ"ל אחר חרוטי (עם הכובע שלו קצת רופף) וחום את התערובת עד רתיחה רק במיקרוגל (דקות 1 ~ בתנור 700 וואט מיקרוגל) .
- מוסיפים את חימם 2 × PBS על צינור agarose פתרון פתרון, מערבולת מעורבת לשמור אותו חם בספל מים חמים.
- Micropipette פתרון chemoattractant (למשל, 10 μl של 0.5 מיקרוגרם של chemokine CXC MIP-2 או 12 μl של WKYMVm 1 mM) לתוך מכסה של שפופרת Eppendorf 1.5-מ"ל המכיל 3 μl דיו הודו ומערבבים היטב על ידי שאיפה באמצעות micropipette (להימנע בועת אוויר).
- חותכים את קצה קצה קצה של 200 μl pipet ו micropipette 110 μl של agarose פתרון (42 ° C) לתוך המכסה ומיד ומערבבים היטב בעזרת פיפטה עוד טיפ (למנוע בועות אוויר).
- חנות chemoattractant ג'ל המכילים בשעה 4 ° C.
2. הכנת שרירים Cremaster מיקרוסקופית Intravital (איור 1)
- הרדימי עכבר זכר בוגר על ידי זריקה ip מתערובת של xylazine מ"ג / ק"ג 10 ו 200 מ"ג / ק"ג hydrochloride קטמין.
- לגלח את האזור על וריד הצוואר הימני חיצוני ההיבט הקדמי של כיס האשכים עם סכין גילוח חשמלי. לאחר הרדמה, חשוב לתת תשומת לב טיפול מיוחד לעכבר בהרדמה. מנורת החום עלול לשמש כדי למנוע את העכבר מן היפותרמיה. העכבר צריך להיות חופשי מן רפלקס הכאב.
- ביצוע חתך אופקי, למצוא קטטר וריד הצוואר באמצעות צינורות PE-10 מלאים מלוחים U / ml 100 הפרין. צנתור של וריד הצוואר נדרש לניהול הרדמה ותרופות נוספות בעת הצורך.
- תקן הרגליים האחוריות עכבר עם הקלטת הטבור עם העכבר שוכב עם הפנים כלפי מעלה על לוח תוצרת בית cremaster השריר (איור 1).
- חבר את הלוח ל circulator 37 מעלות צלזיוס מים כדי לשמור על השריר cremaster גוף העכבר חם.
הערה: כל הנהלים 2.6-2.14 חייב להתבצע בעדינות רבה 5.
- עושים חתך בעור האשכים כדי לחשוף את השרירים cremaster שמאל. בזהירות לנתח את השרירים fascia המשויכת.
- Superfuse השריר cremaster עם 37 ° C-חימם ביקרבונט שנאגרו מלוחים (131.9 NaCl, KCl 4.7, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, מ"מ, pH 7.4) באמצעות המשאבה peristaltic.
- עניבה תפר 4-0 לסוף הדיסטלי של שריר cremaster להחזיק אותו על בסיס זכוכית שקופה לצפייה של הלוח שריר cremaster.
- לצרוב את השריר cremaster longitudinally. עם תפר 4-0, להחזיק בדירה שרירים לאבטח אותו בשולי על הכן. הפרד את האשך ואת יותרת האשך של שריר הבסיס ולהעביר אותם לתוך חלל הבטן.
- Superfuse השריר ב ~ 0.6 מ"ל / דק 'עם החיץ 37 C-חימם זלוף ° ו לכסות את שריר חשוף עם 22 × coverslip 22 מ"מ זכוכית.
- מניחים את לוח שריר cremaster על הבמה מיקרוסקופ, לבחון את השריר מתחת למיקרוסקופ, למצוא ורדיד postcapillary מתאים (בחר את ורדיד כי הוא ישר unbranched ויש לו קצב גזירה רגיל בקוטר של 25-40 מיקרומטר) ולהתאים את מצלמת הוידאו כדי לאפשר ורדיד להיות דמיינו במצב אנכי על צד ימין או שמאל של צג הטלוויזיה.
- לאחר שיווי משקל של 30 דקות, שיא את תמונות הווידאו של ורדיד postcapillary נבחרו 5 דקות כמו בקרת נתונים בסיסית באמצעות וידיאו.
- עצור את superfusion ולהסיר את coverslip על השריר.
- הצב ~ 1-3 מ"מ בגודל chemoattractant המכילים ג'ל על פני השטח של שריר cremaster באזור שנבחרו מראש 350 מיקרומטר מן ובמקביל ורדיד postcapillary ציין, להוסיף coverslip להחזיק את הג'ל במקום ו superfuse רקמת השריר בבית מאוד קצב איטי (≤ 10 μl / min), כדי לאפשר את הקמתה של שיפוע של chemoattractant כי הוא שוחרר לאט נוצר הג'ל.
- הקלט את תמונת וידאו של 90 דקות אחרי תוספת של ג'ל המכיל chemoattractant. במהלך ההקלטה, לשנות ולשמור על המיקוד מיקרוסקופ על עמידה, זחילה, transmigrating ו chemotaxing leukocytes בתוך ורדיד ו ברקמת השריר.
- לאחר הניסוי, לייבא את קובץ הווידאו למחשב לניתוח.
3. Cell מעקב באמצעות ImageJ
- במחשב, לחלץ להמיר וידאו בפורמט AVI (למשל, להשתמש bitRipper חינם תוכנת מחשב להמיר סרט DVD לקובץ AVI).
- השתמש בתוכנת עריכת וידאו כדי ליצור את הסרט בזמן שחלף. לדוגמה, השתמש ב-Windows Movie Maker לעשות סרט זמן בטלה (עד 1 / 512 או 1 / 1024 זמן לשגותלא שיעור של 30 fps) מן הווידאו המקורי בזמן אמת. המר ולשמור את הסרט לא דחוס בזמן שחלף לפורמט DV-AVI.
- הקלט את התמונות של מיקרומטר כיול תחת ההגדרה מיקרוסקופ עם זאת, לייבא תמונות למחשב, לפתוח את התמונות עם ImageJ. ב ImageJ, הפיקסלים הכולל להופיע בפינה השמאלית העליונה של המסך (למשל, 720 × 480 פיקסלים). מדוד את גודל המסך בשני צירי X ו-Y (למשל, 200 × 150 מיקרומטר). מכאן, לחשב את מספר פיקסלים לכל מיקרומטר (למשל x = 720/200 = 3.6 פיקסלים / מיקרומטר, ו-y = 480 / 150 = 3.2 פיקסלים / מיקרומטר).
- כדי לייבא את הסרט, לפתוח ImageJ שוב, לחץ על "קובץ, יבוא באמצעות QuickTime סרטים Plug-in", לבחור את הסרט כדי להיות מנותח ולחץ על "אישור" על הממשק של "פותחן QT Movie".
- לחץ על "Plugins-Manual מעקב" כדי לעקוב אחר תאים. מלא את הפרטים הרלוונטיים בשדות בתחתית לפני תחילת המעקב. בקצרה,
- מרווח הזמן (sec) = fold-time-lapse/30 (לדוגמה, 1020 × זמן לשגות יהיה 1020/30 = 34 שניות / מסגרת אינטרוולים).
- X / Y = כיול המדידה מיקרומטר / פיקסל באמצעות כיול התמונה של מיקרומטר.
- כיול z = 0 (כמו שריר cremaster העכבר הוא שכבה דקה מאוד של זחילה רקמות תאים ההגירה 2D כ תחת שקוף בהיר שדה).
- חיפוש מרובע בגודל של מרכוז = 1.
- גודל נקודה / קו רוחב / גודל גופן: הם יכולים להיות מותאמים במידת הצורך.
- בחר נקודת יציב וברור כנקודת התייחסות. זו נקודת ההתייחסות יכולה להיות כל נקודה מבנית ברורה קטן נשאר ללא שינוי ויציבה לאורך הניסוי כולו. לחץ על "הוסף מעקב" כדי לעקוב אחר נקודת ההתייחסות של הראשונים המסגרת האחרונה ולחץ על "סוף מסלול". הנתונים המופיעים בטבלת התוצאות באופן אוטומטי.
- עקוב אחר זחילה נודדות נויטרופילים אחד אחד: לחץ על "הוסף מעקב" כדי לעקוב אחר התא מן המראה שלה ברקמת להיעלמות שלה בכל מסגרת ולחץ על "סוף מסלול" לסיים ולשמור את התוצאות ב-Microsoft Excel.
4. ניתוח פרמטרים גיוס נויטרופילים
- פתח את קובץ התוצאות ב-Microsoft Excel, ולנתח את הנתונים (לקחת את השינויים של נקודת התייחסות אל ניתוח).
- Intraluminal זחילה
- זחילה מרחק: את המרחק הכולל התא זוחל לומן מהאתר חסיד הראשונית לאתר גלגול אופטימלי (מיקרומטר).
- מהירות זחילה: זחילה מרחק / זמן (מיקרומטר / min).
- Transendothelial הגירה
- זמן גלגול נשמות: מעת התא מתחיל מתגלגלות לאורך האנדותל לזמן שבו גוף התא כולו הוא מחוץ ורדיד ועל שום גוף התא ניתן לראות את לומן (דקות או שניות).
- זמן פלוגת: מרגע גוף התא כולו הוא מחוץ ורדיד (מיד לאחר גלגול) לנקודת הזמן שבו התא מאבד קשר עם ורדיד (חזר בו הזנב) (דקות או שניות).
- Chemotaxis ברקמות
- מרחק הגירה: סכום של המרחק התא נע מנקודת ההתחלה לנקודת הסיום של הגירה ברקמות (מיקרומטר).
- מהירות הנדידה: מרחק הגירה ברקמה / שעה (מיקרומטר / min).
- המרחק Chemotaxis: סכום של תא נודד למרחק של ציר ה-x ברקמות (מיקרומטר).
- מהירות של chemotaxis: chemotaxis מרחק / זמן (מיקרומטר / min).
- Chemotaxis אינדקס: היחס של חלוקת המרחק chemotaxis ידי מרחק ההגירה ברקמות.
5. נציג תוצאות:
למרות מיקרוסקופיה bightfield intravital משמש ללימוד ליקוציט-אנדותל האינטראקציות התא לא יכול להיות בהכרח נויטרופילים, אנו מאשרים כי, על ידי מחקרים היסטולוגיה שלנו, יותר מ -95% של התאים שגויסו chemoattractant שטופלו השרירים נויטרופילים cremaster אכן נויטרופילים . בדו"ח זה, באמצעות נויטרופילים סלקטיבית chemoattractants, אנו מציגים את נהלי המעקב הגיוס של נויטרופילים in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול של זחילה מעקב intraluminal נויטרופילים, הגירה transendothelial ו chemotaxis ברקמת השריר cremaster בעכברים מורדמים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו intravital ו ImageJ. Chemoattractant ג'ל המכילים agarose על השריר cremaster לאט משחרר chemoattractant ומאפשר שיפוע chemoattractant שתוקם רקמות. Chemoattractant נויטרופילים גורם נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות תא venules postcapillary cremasteric בעכברים. הניסוי כולו דמיינו תחת מיקרוסקופ brightfield זקוף intravital עם תמונות וידיאו המוקרנת על ידי מצלמת צבע וידאו כדי לפקח טלוויזיה נרשמו על ידי וידיאו. אנחנו נקבע נויטרופיליםזחילה intraluminal, הגירה transendothelial והגירה ו chemotaxis ברקמת השריר בתגובה נויטרופילים chemoattractant MIP-2 ו WKYMVm שהוכנו agarose ג'ל (איור 2). מצאנו כי MIP-2 (ב 0.5 מיקרומטר) ו WKYMVm (ב 0.1 מ"מ) שהושרו זחילה intraluminal נויטרופילים במהירות דומה, הגירה transendothelial נויטרופילים וניתוק מן ורדיד לאורך זמן דומה, נדידת נויטרופילים ו chemotaxis ברקמת השריר על כמעט ובאותה מהירות עם מדדים דומים נויטרופילים chemotaxis (P> 0.05 הבדיקה, סטודנט t).
באיור 1. האיור סכימטי של מערכת מיקרוסקופ intravital. שריר העכבר cremaster הוא exteriorized על הכן צפייה ברורה של הלוח שריר cremaster על הבמה מיקרוסקופ superfused עם 37 ° C-חימם ביקרבונט שנאגרו מלוחים. המיקרוסקופ מחובר זקוף עם מצלמת וידאו CCD צבע עבור מיקרוסקופיה intravital brightfield. המצלמה בצבע עמוק מקורר CCD דיגיטלי קשור גם ליציאת מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital עבור מיקרוסקופיה, תמונות שממנו מעובדים ישירות על ידי מחשב.
2. איור גיוס נויטרופילים פרמטרים של מיקרוסקופיה brightfield intravital. גיוס נויטרופילים היה המושרה על ידי שחרור הדרגתי של chemoattractant נויטרופילים MIP-2 או WKYMVm בהכנת agarose ג'ל להציב 350 מיקרומטר הסמוכים ורדיד postcapillary. זמן נושן נתוני וידאו נותחו על ידי ImageJ לאחר עיבוד בזמן אמת, הקלטת וידאו של הניסוי. זחילה נויטרופילים intraluminal (A), גלגול זמן וזמן ניתוק (ב), מהירות ההעברה ומהירות chemotaxis ברקמות (C), ומדד chemotaxis בשריר cremaster (ד) נקבעו לאחר מתן של MIP-2 או WKYMVm agarose ג'ל על cremaster השריר בעכברים C57BL / 6 (n = 3, # של תאים מסומנים = 22 (ב A ו-B) ו 27 (ב C ו-D) בהתאמה MIP-2, ו = 26 (ב A ו-B) ו 44 ( ב C ו-D) בהתאמה WKYMVm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי חיוני לחשוף את מנגנוני תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים במהלך דלקת. ויזואליזציה כמותיים לקביעת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא microvasculature transluscent של רקמות כמו שריר cremaster ו mesentery נותר תקן הזהב עבור היישום של הטכניקה 1,5. מיקרוסקופיה קונבנציונאלי intravital brightfield יש הרבה תכונות טכניות ייחודי מנגנוני גיוס גילה ברקמות אלה החלים על רוב הרקמות in vivo 1,2,6. עם זאת, המנגנונים של גיוס לויקוציטים מסוימים ברקמות אחרות כגון הריאות, הכבד והמוח נמצאו שונה לגמרי מאלו שהתגלו שריר cremaster ו mesentery 1. בנוסף, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יש להשתמש בכמה רקמות שקופות פחות.
בהשוואה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אשר ידועה נזקי לפונקציות של תאים חיים, מיקרוסקופיה brightfield intravital הוא פיזיולוגי יותר ומזיק פחות של תאים ורקמות (ולכן עם חפצים פחות), כאשר זמן רב הדמיה על קיום התנהגויות הסלולר הדינמי בבעלי חיים הוא הכרחי 7. זה גם נוח יותר, פחות יקר ואין תיוג פלורסנט הוא זקוק. מצד שני, עם הדמיה שקוף במיקרוסקופ intravital, תנועה מעקב אוטומטי הסלולר בלתי אפשרי עם תוכנות הדמיה מסחרי זמין כרגע בשוק. עם זאת, קל מאוד להקים מערכת נפרדת הקרינה intravital הדמיה (למשל, על ידי הקרנת התמונות אל המחשב מצלמת CCD פלואורסצנטי) על המיקרוסקופ brightfield אותו intravital (איור 1). זה מספק את הנוחות של המעבר בין מיקרוסקופיה brightfield ו דימות פלואורסצנטי על הכנת מדגם זהה בניסוי אחד. זה גם מאפשר לעקוב באופן אוטומטי אחר תנועת תאים שכותרתו fluorescently תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital כאשר הניגוד בין עוצמת הקרינה של תאים שכותרתו הרקע הוא גדול מספיק ומתאים תוכנת הדמיה מותקן במחשב.
כפי המתואר כאן במצגת שלנו, אנחנו מדגימים את הערך של זה טכניקה vivo להסתכלות ישירה של כל תהליך גיוס נויטרופילים ו להגדרה של הפונקציות של תאים ומולקולות בכל שלב הגיוס. עם chemoattractant הכלול הכנת ג'ל agarose והחזיק על הרקמה, שיפוע חד כיווני chemotactic ניתן להקים ברקמה שגורם לתגובות גיוס לויקוציטים הדומים לאלו המתרחשים באופן טבעי במהלך דלקת מקומית 8,9. התנועה ליקוציט כיוונית מן ורדיד postcapillary לעבר מקור chemoattractant ניתן דמיינו בבירור במיקרוסקופ intravital brightfield וצילום וידאו. עם עיבוד זמן לשגות וידאו, תנועה התא יכול להיות מועבר על ידי ImageJ סדרה של פרמטרים מאוד לשחזור ניתן למדוד. עם העכברים הטרנסגניים, מעכבים ספציפיים chemoattractants סלקטיבית, מערכת assay עוזרת לנו לגלות את הפונקציות של חלבונים ספציפיים בגיוס ליקוציט. לדוגמה, טכניקה זו סייעה לנו לזהות את תפקיד LSP1 בתאי האנדותל כמו שומר הסף בוויסות הגירה transendothelial נויטרופילים 10, תפקיד עבור Mac-1 (αMβ2 integrin) ב זחילה intraluminal נויטרופילים, צעד חיוני עבור הגירה transendothelial אופטימלי 3, ואת תפקידו של PI3Kγ ב chemotaxis נויטרופילים ברקמות 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר קנדי Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). ל ליו הוא חתן פרס החוקר CIHR חדש (MSH-95374).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment, no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
