Summary

Отслеживание нейтрофилов внутрипросветный Crawling, трансэндотелиальной миграции и Хемотаксис в ткани Прижизненное микроскопии видео

Published: September 24, 2011
doi:

Summary

Мы опишем протокол светлое прижизненной микроскопии для измерения динамических нейтрофилы, эндотелиальные клетки при взаимодействии нейтрофилов вербовки в ответ на источник нейтрофилов хемоаттрактант в естественных условиях. Нейтрофилов внутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграцию и хемотаксис в мышечной ткани мышей кремастер визуализируются с временем истек фотографии видео и отслеживается с ImageJ.

Abstract

Вербовки циркулирующих лейкоцитов из крови к воспаленной ткани является важным и сложным процессом воспаления 1,2. В посткапиллярных венул воспаленных тканей, лейкоцитов первоначально троса-н-ролл на просвета поверхности венул стене. Роллинг лейкоцитов ареста на эндотелий и пройти фирмы адгезии в ответ на хемокинов или других хемоаттрактантов на венул поверхности. Многие приверженцем лейкоцитов переселиться из начальном участке адгезией к соединительного сайт кровоизлияние в эндотелия, процесс, который называют внутрипросветный ползком 3. После сканирования, лейкоциты перемещаются по эндотелия (переселение) и мигрировать в ткани внесосудистое к источнику хемоаттрактант (хемотаксис) 4. Прижизненные микроскопия является мощным инструментом для визуализации лейкоцитов эндотелиальных взаимодействий клетка в естественных условиях и выявление клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки 2,5. В этом докладе, мы предоставляем полное описание использования светлого прижизненной микроскопии для визуализации и определяет конкретные процессы нейтрофилов набора мышечной мыши кремастер в ответ на градиент нейтрофилов хемоаттрактант. Для стимулирования нейтрофилов найма, небольшой кусок геля агарозы (~ 1 мм, 3 размера), содержащие нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 (CXCL2, хемокинов CXC) или WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, синтетический аналог бактериальных пептид) помещается на мышечной ткани, прилегающих к наблюдали посткапиллярных венулы. С течением времени, истек фотографии видео-и компьютерные программы ImageJ, нейтрофилов внутрипросветный ползет по эндотелия, нейтрофилов трансэндотелиальной миграция и миграция и хемотаксис в ткани визуализируются и отслеживаться. Этот протокол позволяет надежно и количественного анализа многих нейтрофилов параметры набора таких как внутрипросветный скорость сканирования, переселение время, отряд время миграция скорости, хемотаксис скорости и хемотаксис индекса в ткани. Мы показываем, что с помощью этого протокола, эти параметры набора нейтрофилов может быть стабильно и определяется одним передвижения ячейки удобно отслеживать в естественных условиях.

Protocol

1. Подготовка хемоаттрактант в агарозном геле Внесите 10 мл 2 х PBS в 50-мл коническую трубку, и согреться трубке, поместив его в стакан с горячей водой. Внесите 10 мл дистиллированной воды и добавляют 0,4 г порошка агарозы в другой 50-мл коническую трубку (с ее вершины слегка ослаблен?…

Discussion

Прижизненные микроскопия является существенным инструментом для выявления клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки во время воспаления. Количественные визуализации для определения лейкоцитов эндотелиальных клеток взаимодействий в микроциркуляторном русле полупр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана исследовательский грант Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС-86749). Л. Лиу является получателем CIHR Новая премия следователя (MSH-95374).

Materials

Table: Materials, Specific Reagents and Equipment

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Polyethylene tubing, PE10 Becton Dickinson 427401 I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm
India ink Speedball Art Super Black 100% carbon black pigment-no dyes
Cautery Aaron Medical AA03  
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592  
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529  
Murine recombinant MIP-2 R&D Systems 452-M2  
WKYMVm Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 072-12  
Agarose Invitrogen 15510-027 Ultrapure
Heparin Sigma H-3393  
Upright microscope Olympus BX61WI  
3CCD color video camera SONY DXC-990  
HD-DVD video recorder LG Electronics Inc. RH398H-M  
TV monitor LG Electronics Inc. 22LG30  
Water circulator Thermo Scientific HAAKE DC10  
Peristaltic pump Gilson; Pharmacia Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3  
Cremaster muscle board University of Saskatchewan   Home-made

References

  1. Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
  2. Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
  3. Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
  4. Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
  5. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  6. Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
  7. Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
  8. Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
  9. Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
  10. Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
  11. Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).

Play Video

Cite This Article
Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296, doi:10.3791/3296 (2011).

View Video