Spårning neutrofila intraluminal Krypande, Transendothelial migration och kemotaxi i vävnad genom Intravital Video Mikroskopi
Summary
Vi beskriver ett protokoll för brightfield intravital mikroskopi för att mäta dynamiska neutrofil mot endotel interaktioner under neutrofila rekrytering som svar på källan till en neutrofila chemoattractant in vivo. Neutrofila intraluminal krypande, transendothelial migration och kemotaxi i mus cremaster muskelvävnad visualiseras med tiden förföll video fotografering och spåras med ImageJ.
Abstract
Rekryteringen av cirkulerande leukocyter från blodbanan till inflammerad vävnad är en viktig och komplicerad process av inflammation 1,2. I postcapillary venoler av inflammerad vävnad, leukocyter början tjuder och rulla på luminala yta venular vägg. Rullande leukocyter gripande på endotelet och genomgå starka adhesion som svar på kemokinreceptorantagonist eller andra chemoattractants på venular ytan. Många anhängare leukocyter flytta från den ursprungliga platsen för vidhäftning till Junktional extravaseringsstället i endotel, kallas en process intraluminal krypande 3. Efter krypande, leukocyter flyttar över endotelet (själavandring) och vandrar i extravaskulära vävnaden mot källan chemoattractant (chemotaxis) 4. Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att visualisera leukocyt mot endotel interaktioner in vivo och avslöjande cellulära och molekylära mekanismer av leukocyt rekrytering 2,5. I denna rapport ger vi en övergripande beskrivning av att använda brightfield intravital mikroskopi för att visualisera, och fastställa närmare processer neutrofila rekrytering i mus cremaster muskler som svar på gradient av en neutrofil chemoattractant. Att inducera neutrofila rekrytering, en liten bit av agarosgel (~ 1-mm 3 storlek) innehåller neutrofila chemoattractant MIP-2 (CXCL2, en CXC chemokine) eller WKYMVm (TRP-Lys-Tyr-Val-D-Met, en syntetisk analog av bakteriell peptid) är placerad på muskelvävnaden i anslutning till den observerade postcapillary venule. Med tiden förföll video fotografi och datorprogram ImageJ, neutrofila intraluminal kryper på endotel, neutrofila transendothelial migration och migration och kemotaxi i vävnad visualiseras och spåras. Detta protokoll möjliggör tillförlitlig och kvantitativ analys av många neutrofila rekrytering parametrar som intraluminal krypa hastighet, själavandring tid, avskildhet tid, vandringshastigheten, chemotaxis hastighet och kemotaxi index i vävnad. Vi visar att användningen av detta protokoll, kan dessa neutrofila rekrytering parametrar stabilt bestämmas och det enda cell rörelseorganen enkelt spåras in vivo.
Protocol
Discussion
Intravital mikroskopi är det viktigt verktyg för att avslöja de cellulära och molekylära mekanismer av leukocyt-rekrytering vid inflammation. Kvantitativa visualisering för bestämning av leukocyt-endotel interaktioner i mikrocirkulation av genomskinligt vävnader såsom cremaster muskler och tarmkäx kvar guldmyntfoten för tillämpning av tekniken 1,5. Den konventionella brightfield intravital mikroskopi har många unika tekniska egenskaper och rekrytering mekanismer som avslöjas i dessa vävnader ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86.749). L. Liu är mottagare av CIHR New Investigator Award (MSH-95.374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
