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Medicine

마우스의 전단 응력 유발 죽상 경화증을 실행을위한 경동맥 혈압계의 주입

doi: 10.3791/3308 Published: January 13, 2012

Summary

이 문서에서 제시 constricting 커프스는 murine 공통 경동맥에서 죽상 경화증을 유발하기 위해 설계되었습니다. 이식 커프스가 다른 염증성 phenotypes의 atherosclerotic 병변의 발전을 게재 낮은 높이 oscillatory 전단 응력의 잘 정의된 영역을 생성하는 자사의 내부 루멘의 원뿔 모양으로 인해.

Abstract

그것은 널리 혈관 전단 응력에 변경이 내피 세포에서 염증성 유전자의 표현를 실행시키고 (1과 2에서 검토) 죽상 경화증을 유발 것을 허용합니다. 전단 응력의 ​​역할은 광범위하게 체외은 교양 내피 세포 1,3,4에 유동 역학의 영향을 조사에서 큰 동물과 인간 1,5,6,7,8의 생체내에서 공부했습니다. 그러나, 상패 개발에 전단 응력의 영향의 체계적인 조사를 허용하는 매우 재현성 작은 ​​동물 모델은 드물다. 최근 남구 외. 9 경동맥 동맥의 가지의 결합이 낮고 oscillatory 흐름 영역을 만들 수있는 마우스 모델을 도입했습니다. 이 모델은 내피 기능 장애 및 hyperlipidemic 마우스에 atherosclerotic 병변의 급속한 형성의 원인이 있지만, 그것은 관찰 염증 반응 결과 O, 적어도 부분 것을 제외 수 없습니다F 내피 및 / 또는 결합에 의한 혈관 손상.

이러한 제한을 피하기 위해, 전단 응력 수정 커프스는 그의 원뿔 모양의 내부 루멘은 일반적인 경동맥 10 시간 낮은 높이 oscillatory 전단 응력의 ​​정의 영역을 만들 선택된 계산 유체 역학,에 따라 개발되었습니다. Apolipoprotein E (ApoE) 녹아웃 마우스에서이 모델을 적용하여 높은 콜레스테롤 서부 유형 음식을 먹이, 혈관 병변은 커프스의 상류 및 하류의 개발. 그들의 표현형은 같은 생체내 자기 공명 영상 (MRI) 12에 의해 확인 지역 유동 역학 11 상관있다 : 낮은 층류 전단 응력 상류 커프스의보다 취약한 표현형의 광범위한 plaques의 형성 원인 반면의 oscillatory 전단 응력의 ​​하류 커프스는 안정 atherosclerotic 병변의에게 11 유도. 높은 전단 응력과 커프스 내에서 높은 층류의 그 지역에서,일반적으로 더 atherosclerotic plaques가 관찰되지 않습니다.

결론적으로, 전단 응력 - 수정 커프스 절차는 ApoE - 결함 마우스에서 phenotypically 다른 atherosclerotic 병변을 생산하기 위해 신뢰할 수있는 수술 방법입니다.

Protocol

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1. 전단 응력 수정자 준비 (커프스)

  1. 전단 응력 수정자 원뿔 모양의 루멘과 함께 실린더의 두 세로 반쪽로 구성되어 있습니다. 반 껍질은 플라스틱 주조 절차에 의해 만들어진 열가 소성 polyetherketone의 만들어집니다. 여전히 주자에 연결된 동안 캐스트 요소가 발송됩니다. 따라서 반 껍질은 사용하기 전에 잘라해야합니다. 300 μm의 (하류 끝에 최저 내경) - 각 캐스트는 150 μm의에 이르기까지 다양한 크기의 절반 껍질이 포함되어 있습니다.
  2. 커프스 준비는 수술 현미경 하에서 수행되어야합니다.
  3. 무딘 포셉와 커프스 반 껍질을 잡고 부드럽게 날카로운 메스를 사용하여 캐스트에서 잘라. 이 절차를 더 진행해야 반쪽 쉘 엽 성의 전구 물질로 이어질 것입니다.
  4. 도 비 미끄러운 접시에 하프 쉘 전구체를 삽입, REM을 위해 무딘 포셉 그것을 수정하고 preformed 절개 따라 정확히 잘라닫힌 끝을 ove. 이것은 사용하기 위해 준비 커프스 반 쉘을 얻을 것입니다.
  5. 현미경 반 껍질을 제어하고 부드럽게 남아있는 날카로운 가장자리를 제거합니다. 원뿔 내부 루멘은 상류와 하류 이식 커프스의 시간 전단 응력의 다양한 자질을 유도를 위해 필수적입니다. 내부 루멘에 직각으로 실행 절반 껍질의 바깥쪽 표면에 홈이 드디어 기능 수갑 형태로 함께 반 껍질을 스틱 스레드에 대한 안내 역할을합니다.
  6. 70 % 에탄올에 크기에 따라 분류 커프스 반 포탄을 보관합니다.

2. 오른쪽 경동맥 주위에 수갑 이온 주입

  1. ApoE의 녹아웃 마우스는 시대의 10주 주위와 최소한 20g의 무게로한다. 플라크의 개발은 이러한 서부 형식 다이어트를 시작, 높은 콜레스테롤 음식에 따라 조사해야한다면 사주 전에 커프스 주입을 권장합니다.
  2. 전체 수술해야적어도 반 무균 조건 하에서 수행 : 수술 가운, 마스크와 모자와 멸균 장갑을 착용한다. 비드 악기 살균기 30 초 동안 악기를 소독하고 멸균 불투명한 시트에 그들을 놓으십시오. 주의! 장비는 사용하기 전에 진정 해요!
  3. 완전히 anesthetized 때까지 isoflurane 3퍼센트 가득 마취 유도 실에서 마우스를 놓습니다. 발가락 공략하기 위해 응답 마취 심도를 확인합니다. 또한, 마취가 케타민을 (80 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg) 또는 IACUC 승인한 다른 anesthetics의 intraperitoneal (IP) 주입을 수행할 수 있습니다. IP 사출 들어, 부정사 위치에 마우스를 누른 상태에서 복부의 왼쪽 하단 사분면에 마취 주사.
  4. 부정사 위치, 온수 수술 접시에 마우스를 놓으십시오. 눈 연고 (예 : Bepanthen 눈과 코 로션)으로 그들을 축축하게하다 마른 실행의 눈을 방지하기 위해. 접시에 이물 및 뒷다리 - 발 및 테이프를 아래로 확산. isoflurane 마취, 마약 가스 흐름 (2 % isoflurane)를 수행하는 것은 작은 설치류 마스크를 통해 공급되고있다면.
  5. 중 적용 depilatory 에이전트 (예 : Pilca 클럽메드) 또는 고급 전기 면도기 (예 : Wella Contura)을 사용하여 mandible과 흉골 사이에 머리카락을 제거합니다. 면도는 피부 자극을 피하기 위해주의와 수행되어야한다. 모든 머리 depilatory 에이전트가 제거될 때까지 depilatory 에이전트를 사용하는 경우, 그것을 머리를 관통 1-2 분주고, 그 이후, 부드럽게 문지 르세요.
  6. 다른 크기 (각 사이즈의 두)와 상호에 대한 6-0 실크 봉합사의 2.5 cm 길이의 조각 경동맥 폐색의 사이트에있는 반 껍데기의 준비 이전에 준비 커프스 반 껍질 있습니다.
  7. Betadine의 자유로운 금액으로 운영 필드를 소독. 흉골 (manubrium)의 상단부터 4~5mm 중간 절개하여 피부와 목의 기본 근막을 열 날카로운 작은 가위를 사용하십시오.
  8. 오프닝, S를 확장옆으로 오른쪽 귀밑샘 선을 hift하고 수술 확장기를 삽입합니다. 당신은 pulsating 오른쪽 공통 경동맥을 식별할 수있을 때까지 다음 퉁명스럽게, 그냥 오른쪽 sternomastoideus 근육이 오른쪽 근육 omohyoid 교차 기관 (외과보기에서)의 왼쪽, 깊은로 해부하다.
  9. 아주 좋은 직각 또는 곡선 포셉 (예 : 뒤몽 # 45분의 5)를 사용하여 부드럽게 주변의 결합 조직을 제거하여 바로 일반적인 경동맥을 절개하다. 경동맥 따라 직접 실행 흰색, 힘줄 객체 - - 미주 신경에서 경동맥 별도의이 단계는 완전히 혈관을 노출하는 데 필요한 때문입니다. 주의 역시 미주 신경이나 경동맥에 가까운 연결 또한 왼쪽 내부 경정맥 정맥의 지점을 해칠 수 있습니다.
  10. 오른쪽 커프스 크기를 선택하기 위해 커프스 반 포탄의 내부 지름과 노출 경동맥의 직경을 비교 : 수갑의 루멘의 최대 너비는 경동맥의 외경을 충족해야합니다. 이제 조심스럽게, 경동맥 아래 포셉의 팁을 넣어 포셉를 열고 스레드 경동맥에 따라 6-0 실크 봉합사의 조각과 루프를 형성합니다. 경동맥 아래의 루프와 경동맥 놓으 커프스 반 껍질 사이. 가장 큰 범위를 좁히려의 측면은 하류되어야한다.
  11. 경동맥의 상단에있는 루프 내에서 두 번째 커프스 반 껍질을 놓습니다.
  12. 부드럽게 suturing의 집게와 노드 스레드를 사용하여 봉합 루프를 조입니다. 이렇게하면 작동하는 전단 응력 수정자이 형성됩니다. 커프스의 정확한 피팅을 위해 그것은 봉합은 커프스의 바깥쪽 표면에 preformed 홈 내에서 바로 실행하는 것이 중요합니다.
  13. 대략 원래 위치에 다시 오른쪽 귀밑샘 선을 이동하고 6-0 prolene 봉합사의 소량을 사용하거나, 또는, 당신이 상처 클립을 사용할 수있는 하나의 피부를 닫습니다.
  14. subcutaneously 예방 통증 치료과 장소를 제공하는 5 밀리그램 / kg Carprofen (예 : Rimadyl)의 하나 복용량을 주사마우스는 온난 화 챔버에서 그것은 복구까지. 케타민을 / Xylazine 마취를 사용할 때 일반적으로, 이것은 30-60 분 정도 소요됩니다. isoflurane 흡입 마취 회복 기간을 사용하면하면 (10-20 분) 크게 단축됩니다.
  15. 우리의 경험에서는, 동물은 경험 외과 의사에 의해 수행되고있는 개입과 커프스 주입 후 첫 24 시간 이내에 정상적인 악센트가없는 활동을 회복. 동물도 일일 수술을 고민하는 것으로 판단되는 경우 단, 진통제 치료를 반복하고 수의학 직원에게 문의하십시오.

3. 수갑을 채워 경동맥 동맥을 Explanting

  1. histological 분석을위한 경동맥 동맥은 관찰 기간의 끝에 수확해야합니다. explantation를 시작하기 전에, 동물 IACUC 지침에 따라 사망되어야합니다.
  2. 커프스 반 껍질이 재사용하기위한 경우, 조심스럽게 플라스틱 요소, 창피 모든 조직의 파편과 연결하는 봉합을 제거경동맥 동맥에서 secting, 씻고 70 % 알코올 용액의 절반 껍질을 저장합니다. 하나는 커프스가 주입의 몇 주 후 한 그릇 벽을 손상하지 순서에주의 수갑 해부하다하는 것을 결합 조직 adhesions에 포함된 것을 염두에 두어야합니다.
  3. 또는, 커프스는 explanted 수 있으며 경동맥과 함께 임베디드. 커프스의 플라스틱 재료는 파라핀에 포함에 사용되는 일반적인 고정 솔루션 및 용제에 강한 것입니다. 또한, 포함된 샘플은 정상적인 블레이드를 갖춘 정상적인 마이크로톰를 사용하여자를 수 있습니다.

4. 대표 결과

커프스는 동물의 일반적인 두 가지 경동맥 동맥 (그림 1A, 1B) 중 하나 항상 주위에 배치한다 - contralateral 사이드는 컨트롤 역할을합니다. 커프스 (그림 1B)의 두 반 껍질을 제시 이미지에 내부 루멘의 원뿔 모양 표시됩니다. 이 원뿔 형태는 말이지을 위해 필수적이며,뚜렷한 흐름 역학과 함께 세 가지 영역을 tablishing. 위상 대조 속도 MR 이미징 12에 따라 도플러 측정 11 해당 흐름 판매율에서 계산 캐스트에 의해 유도된 일반 전단 응력 패턴은 그림 2에 부여됩니다.

커프스가 ApoE 녹아웃 마우스에 이식하면 서부 형식 다이어트 먹이 변경된 흐름 역학 도발 전단 응력 유도 atherosclerotic 상패 증착 (그림 3) : 상류 원뿔 수축 낮은 판상 전단 응력의이 이상의 atherosclerotic plaques의 대규모 개발로 연결됩니다 가까운 중앙 루멘에 지질 코어 특징으로 취약 표현형은 얇은 섬유 뚜껑 (그림 3A1)에 의해서만 있었다. 커프스의 원추형 내부 루멘은 유속의 증가로 연결됩니다. 거의 아무 플라크 증착이 지역에서 관찰되지 않습니다. 바로이 vortices과 oscillatory 플로의 영역에있는 동맥 결과의 확대 병목 사이트의 직접 스트림보다 안정적인 표현형 (미디어에 더 가까운 언어 아르 즉, 적은 지질 코어)의 확장 적은 플라크 개발의 원인이 w 매개 변수.

그림 1
그림 1 전단 응력의 ​​수정자 - 조립 및 게재 위치는 (A) 이식 커프스의 도식 그림 :.. 커프스는 바로 일반적인 경동맥 (RCCA) 주위에 위치 - contralateral 측면 (LCCA = 왼쪽 일반 경동맥) 제어 역할 . (B) 마우스의 생체내 MRI 혈관 조영술에서 : 최대 강도 프로젝션에서는 3 차원 시간 기내의 MR 혈관 조영술 캐스트 (흰색 화살표)에 의해 유도된 원뿔 수축합니다 (자세한 내용은 12 참조)을 볼 수 있습니다. (H = 머리, F = 피트, R = 오른쪽 L = 왼쪽). 오른쪽 상단 모서리에있는 내부 루멘와 커프스 반 껍질의 바깥 표면에 매크로보기가 주어집니다. 조립하면 두 반 껍질은 수정 원추형 실린더를 형성정의된 방식으로 선박 내의 유동 역학. 오른쪽에 맞게을 보장하기 위해, 커프스 버튼 (노란색 화살표)의 바깥쪽 표면에 홈이 연결 봉합에 대한 안내 역할을합니다.

그림 2
그림 2. 다른 유동 역학 및 전단 응력의 ​​지역별. 정의된 방식으로 죄이고 경동맥의 커프스 바꿀지도 모르겠어 유동 역학 및 이후 전단 응력의 ​​주입. 위 회로도 일러스트에서 다른 흐름 속성이 표시되며 전단 응력에 대한 로컬 대략적인 값 (도플러 측정 11 기준)이 제공됩니다. 아래의 이식 커프스의 MRI 상류로 측정 단일 동물에 대한 대응 흐름 판매율은 목 T1 - 가중 크로스 - 단면 MRI 이미지 (자세한 내용은 12를 참조에 대한 위상 대비 속도 이미징)에 표시됩니다.


그림 3. 전단 응력은 ApoE 녹아웃 마우스에서 플라크 개발을 유도. 좌측 상단 모서리가 열린 목에 매크로보기를 보여주는 8 주간 전단 응력의 ​​이식 후 높은 지방 (서양식 타입) 식단에 따라 ApoE의 녹아웃 마우스의 경동맥 동맥을 노출 오른쪽 일반적인 경동맥 (RCCA) 주위 수정자. 커프스의 상류 그릇 (*)의 불투명한 흰색 영역은 광범위한 atherosclerotic 플라크 증착의 사이트에 해당합니다. 노란색 화살표는 두 커프스 반쪽을 결합하여 스레드를 나타냅니다. 반면, 상패 증착의 흔적은 왼쪽 일반 관상 동맥 (LCCA)에 없습니다.
(A) - (C) 대표 그가 8 주 커프스의 주입 후 서쪽 타입 식단에 따라 ApoE 녹아웃 마우스의 오른쪽 일반적인 경동맥의 교차 부분을 얼룩. 회로도 그림은 해당 비행기 (점선에게) wher를 제공합니다E 섹션이 위치하고 있었다. (A) 커프스 죽상 경화증의 업스트림는 대규모 플라크 증착 발생합니다. 부분에 가까운 중앙 루멘 (세부 A1)에있는 대형 지질 코어 (빨간색 화살표), 이러한 plaques의 취약한 성격을 특징. 커프스의 직접 스트림 (C) oscillatory 흐름이보다 안정적인 유형 (예 : 이하 또는 전혀 지질 코어)의 플라크 개발을 중간에 이르게 반면 (B) 커프스 병목의 비행기에서 거의 아무런 상패 개발은 분명하지 않습니다. (C1, C2 커프스의 = 반 껍질, P = plaques, 별표 = 선박 루멘)

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Discussion

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실험 편차를 최소화하기 위해서는 그것은 거의 같은 시대의 동물과 같은 다이어트의 역사에서 작동하도록 권장합니다. 최근에 출판된 조사 wildtype 생쥐에 적용 전단 응력 수정자이 변경 유동학 13 유도된 내피 기능 장애와 초기 염증 반응의 조사를위한 좋은 모델이 될 수도 보여줍니다. 그러나, atherosclerotic 상패 개발 형질 전환 hyperlipidemic 마우스 모델의 조회에 대한 (ApoE 녹아웃 마우스 등)가 필요합니다. 각각의 마우스 모델에서 진행 및 상패 증착 범위는 사용하는 다이어트의 종류에 따라 달라집니다. 일반적으로식이 요법의 높은 콜레스테롤 / 지방 콘텐츠, 더 빠른 질병의 진행입니다.

커프스 주입 동안 외과 의사가이 부상으로 인한 염증 반응을 낮출 것이다, 조직 손상 및 조작을 최소​​화하기 위해 노력해야한다. 부상을 최소화하는 것이 특히 중요 경우죽상 경화증의 과정에서 염증 프로세스가 연구의 초점에 있습니다. 이후 수술 염증의 정도를 추정하기 위해서는 그것은 매우 어떤 동물이 아닌 수축 제어 수갑을 삽입하는 것이 좋습니다. 제어 커프스는 같은 소재로 만든 실린더 수 있지만 지속 아닌 수축 내부 직경해야합니다.

또한 항상 경동맥의 동일한 위치에 수갑 곳으로 항상 같은 편이를 선택하는 것이 필수적입니다, 그렇지 않으면 흐름 판매율은 재현할 수 없습니다. 의사는 두 커프스 반 껍질을 결합하면 커프스의 오른쪽에 끼워 맞춤 큰주의를 가져야하기 때문에 차례로 예측할 수없는 흐름을 매개 변수로 연결하지 쉽게 형성 원뿔 내부 루멘의 부적 절한 맞는 결과.

전단 응력 수정자의 큰 장점은 (FI가 동일한 선박 내의 유동 판매율의 특징과 패턴을 재현할 세 잘 정의된 영역을 만드는 것입니다G. 2, 표 1). hyperlipidemic 환경에서 이러한 흐름 패턴의 각 인간에 취약하고 안정적​​인 plaques과 유사한 특성 표현형 (그림 2)의 플라크 증착의 원인이됩니다.

따라서 제시 마우스 경동맥을 재는 완은 전단 응력의 ​​조사 유도 상패의 phenotypes (안정과 불안정)의 생체내 모델에서 중요합니다. 또한, 그것은 또한 초기 죽상 경화증의 사이트를 식별하기위한 새로운 분자 이미징 프로브의 개발을위한 이상적인 작은 동물 모델도 전에 진행 상패 증착이 협착증 또는 상패의 파열에 이르게로 상승을주는 최초의 이벤트 생명을 위협하는 심혈관 사건을 수도 있습니다 혈전 형성과 심근 경색 좋아요.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG), 프로젝트 따라서 그럴 경우에는 filename PI 771/1-1에 의해 부분적으로 지원되었다; SFB 656 "순환기 분자 이미징,"뮌스터, 독일 (프로젝트 C6, Z2, B3, 그리고 PM3), 유럽 연합 (EU) 가지고와 "진단 분자 이미징 - DIMI "(WP 11.1과 11.2). 이번 연구는 영국 심장 재단, 영국에 의해 부분적으로 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shear stress modifier (polyetherketone) Promolding BV

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References

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Kuhlmann, M. T., Cuhlmann, S., Hoppe, I., Krams, R., Evans, P. C., Strijkers, G. J., Nicolay, K., Hermann, S., Schäfers, M. Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (59), e3308, doi:10.3791/3308 (2012).More

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