GENPLAT(GLBRC酶纲要“)是一个生物质降解酶鸡尾酒的发现和优化的自动化平台。它可适应多种原料和包含多个组件的酶的混合物。
酶的生物质解构的成本高,木质纤维原料的液体运输燃料如乙醇的经济转换的一个主要障碍。我们已经开发了一个集成的高通量平台,为来自不同的预处理/生物组合的糖释放的发现和开发新的酶和酶鸡尾酒GENPLAT。 GENPLAT包括四个要素:个人纯酶,统计设计的实验,生物泥浆和酶的机器人pipeting,并自动发布GLC和木糖colorimeteric决心。个人酶在毕赤酵母或里氏木霉 ,中的表达,或从商业鸡尾酒或新型微生物提取物的色谱净化生产。单纯格(部分因子)混合模型设计商业设计实验统计软件的使用。高度复杂的酶混合物性构造成96格式的机器人pipeting。发布GLC和木糖的测量是采用酶联比色法自动化。已经过测试,对各种原料和预处理组合优化酶的混合物,含有多达16个组件。
GENPLAT是适应纯酶,商业产品的混合物(例如,1000 Accellerase和Novozyme 188),新型微生物的提取物,或组合的混合物。为了使测试〜10纯酶的混合物,要求小于100微克每一个蛋白质和少于100人的总反应,蛋白质15毫克/ G葡聚糖在最后的总负荷运行时。我们使用从多个来源的酶。纯化的酶可以从天然来源,如真菌文化(如黑曲霉(Aspergillus niger),Cochliobolus carbonum,Galerina marginata),或他们可以通过编码基因的表达(从增加numbe获得R的微生物基因组序列)在诸如E.主机大肠杆菌,毕赤酵母 ,或如T.丝状真菌瑞氏木霉 。蛋白质也可以从商业酶鸡尾酒(例如,Multifect木聚糖酶,Novozyme 188)的纯化。越来越多的纯酶,包括糖基水解酶,细胞壁积极酯酶,蛋白酶,和裂合酶,可从商业来源,例如,Megazyme公司(www.megazyme.com),NZYTech(www.nzytech.com) PROZOMIX(www.prozomix.com)。
设计专家软件(STAT – EASE,公司)是用于创建单纯晶格的设计和分析响应(在这种情况下,GLC和木糖发布)。混合物含有4-20组件,它可以在0和100%之间的比例不同。检测点通常包括足够数量的干预点,以产生一个有效的模型的极端顶点。在实验设计的术语,我们的研究大多是“混合”的实验,这意味着一笔将组件添加到一个全社会固定资产蛋白加载(毫克/克葡聚糖表示)。单纯晶格的混合物的数量依赖于混合物中的元件数目和多项式(二次或三次)的程度。例如,6组件的实验将需要63增强特殊的立方模型不同的反应,它可以检测三个双向互动,而只有23个人的反应是必要的增强二次模型。对于包含超过八个组成部分的混合物,二次实验设计更实用,而且在我们的经验,这种模型通常是统计学上有效的。
所有的酶负荷,最后总负荷(我们的实验通常是15毫克蛋白质/ G葡聚糖)的百分比表示。对于“核心”的酶,较低的百分比限制设置为5%。此限制是来自我们的经验,GLC和/或木糖的产量非常低,如果任何核心酶是目前在0%。不良模型结果从太多的样品表现出非常低的GLC或木糖产量。依次设置下限,确定一个上限。也就是说,一个六分量的实验,如果设置为5%的下限为每个单独的组件,然后将各单项组件的上限75%。被视为“附件”的所有其他酶的下限设置为0%。 “核心”和“附件”的名称有点乱,将基板上的不同而有所不同,但在我们的研究从玉米秸秆释放GLC的核心酶包括以下酶从T 瑞氏木霉 :CBH1(也被称为Cel7A),CBH2(Cel6A),EG1(Cel7B),BG(β-葡萄糖苷酶),EX3(远藤-β1,4 -木聚糖酶,GH10),和BX(β-木糖苷酶)。
人们普遍认识到,降低酶的成本经济的木质纤维素乙醇产业的发展是很重要的。目前可用的商业酶鸡尾酒复杂不清的许多蛋白质(Nagendran等人,2009年)的混合物,他们主要是为适应酸预处理的玉米秸秆使用。为了加快发展更好的酶鸡尾酒,一些实验室已经开发出高通量平台,酶的发现和鉴定。在这方面的努力已纳入也发现在GENPLAT以下属性的一个或多个:配药机器人的酶和生物量的泥浆,统计,实验设计,和/或GLC自动化的决心和木糖(柏林等,2007;德克尔等。人,2009年;金等,1998; King等,2009)。 GENPLAT扩展这些早期的努力,最显著最多6个组件,可以从分析的复杂性,在酶的混合物早期的研究在我们的最新作品,以超过16(班纳吉等人,2010C)。 GENPLAT其它关键特性是珠混合室(桨水库)的使用,可以保持在配药暂停秸秆泥浆;温柔消化在年底高端旋转混合;和自动化比色法测定谷氨酸和木糖。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国能源部能源大湖生物能源研究中心“(能源部办公室科学的BER DE – FC02 – 07ER64494),并授予DE – FG02 – 91ER200021中的一部分,美国能源部基础能源科学,科办公室化学科学,地球科学和生物科学。我们感谢他们的物质和概念贡献的John Scott Craig和梅丽莎Borrusch。
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