Summary
Vi beskriver en metode for generering forvandlet B-cellelinjer med Epstein-Barr virus. Vi illustrerer også en roman analyse som kan identifisere B-celler bestemt til å gjennomgå transformasjon så tidlig som tre dager etter smitte.
Abstract
Infeksjon av B-celler med Epstein-Barr virus (EBV) fører til spredning og påfølgende immortalization, som resulterer i etablering av lymfoblastoid cellelinjer (LCL) in vitro. Siden LCL er latent infisert med EBV, gir de en modell for å undersøke EBV ventetid og virus-drevet B-celleproliferasjon og tumorigenesis 1. LCL har blitt brukt til å presentere antigener i en rekke immunologiske analyser 2, 3. I tillegg kan LCL brukes til å generere humant monoklonalt antistoff 4, 5 og gi et potensielt ubegrenset kilde når tilgang til primære biologiske materialer er begrenset 6, 7.
En rekke metoder har blitt beskrevet å generere LCL. Tidligere metoder har omfattet bruk av mitogens som phytohemagglutinin, lipopolysakkarid 8 og pokeweed mitogen 9 for å øke effektiviteten av EBV-mediert immortalization. Mer nylig har andre brukt immunosuppressive midler som ciklosporin A hemmer T celle-mediert drap av infiserte B-celler 7, 10-12.
Den betydelige tidsperioden fra EBV smitte til etablering av cellelinjer stasjoner kravet til raskere og mer pålitelige metoder for EBV-drevet B-celle vekst transformasjon. Ved hjelp av en kombinasjon av høy titer EBV og et immundempende middel, er vi i stand til å konsekvent infisere, transform, og generere LCL fra B-celler i perifert blod. Denne metoden bruker en liten mengde perifert blod mononukleære celler som er infisert in vitro klynger av celler kan påvises. Tilstedeværelse av CD23 med EBV i nærvær av FK506, en T celle immunsuppressiv. Tradisjonelt er utvekst av prolifererende B-celler overvåkes ved visualisering av mikroskopiske klynger av celler omtrent en uke etter infeksjon med EBV. Klumper av LCL kan ses med det blotte øyet etter flere uker. Vi beskriver en analyse for å avgjøre tidlig hvis EBV-mediert growth transformasjon er vellykket selv før mikroskopiske klynger av celler kan påvises. Tilstedeværelsen av CD23 hi CD58 + celler observert så tidlig som tre dager etter smitte indikerer et vellykket resultat.
Protocol
1. EBV lager forberedelse
- Subkultur eksponentielt voksende B95-8 celler (ATCC # CRL 1612; 13) på 3 x 10 5 celler / ml i en 75cm 2 vev kultur kolbe med steril teknikk. Cellene dyrkes i fullstendig RPMI 1640 inneholder 10% varme-inaktiverte føtale bovin serum (FBS), Penicillin / Streptomycin ved 100U/ml og 100 mikrogram / ml, henholdsvis, og amfotericin B på 0,5 mikrogram / ml ved 37 ° C i nærvær 5% CO 2.
- Førti-åtte timer senere, resuspender celler i frisk komplett RPMI 1640 ved 1 x 10 6 celler / ml. Å indusere virus produksjon, stimulerer celler med 20ng/ml tetradecanoyl phorbol acetat (TPA) for 1 time i en standard CO 2 inkubator. Vask cellene tre ganger med RPMI 1640 å fjerne TPA.
- Resuspender celler i den opprinnelige volum av komplette RPMI 1640 (fra 1,2) og plasser kolbe i CO 2 inkubator for 96 timer. Denne metoden har vist seg å produsere høy titere av smittsomme virus pariticles 6.
- Sentrifuger ved 600 x g i 10 min ved 4 ° C for å skille EBV inneholder kultur supernatant fra cellene. Filter supernatanten gjennom et 0,45-mikron filter, delmengde, og oppbevar ved -70 ° C for over et år.
Et alternativ er å skaffe supernatanten fra B95-8 celler som inneholder EBV fra ATCC (VR-1492) og bruk ved fortynning anbefalt av ATCC.
2. Isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMC)
- Tegn 10 ml blod fra giver til en heparinisert sprøyte eller en heparinisert blod tube. Fortynn blod med 20 ml PBS ved romtemperatur i 50 ml konisk tube.
- Underlag fortynnet blod med 15 ml Ficoll Hypaque lymfocytt separasjon medium. Sentrifuger ved 225 x g uten brems i romtemperatur i 30 minutter.
- Fjern Buffy Coat og overføre til en ny 50 ml konisk tube. Heve volumet til 50 ml med PBS og spinn ved 600 xg ved romtemperatur i 10 minutter.
- Pour av supernatanten. Vask cellene ved resuspending pellet i 50 ml PBS og spinning på 600 x g ved romtemperatur i 10 minutter. Vask to ganger mer i en lignende måte.
- Resuspender vasket cellene i 1 ml av komplette RPMI. Bruk 5 mL av celler til å forberede en 1 / 10 fortynning i Trypan blått. Count levende celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Juster volumet ved hjelp komplett RPMI i en 25 cm 2 vev kultur kolbe å få en celle konsentrasjon på 2 x 10 6 / ml.
3. Infeksjon med EBV
- Legg FK506 (AG Scientific) til cellesuspensjonen fra 2,6 til en endelig konsentrasjon på 20 nM. Plasser kolbe i CO 2 inkubator ved 37 ° C i én time.
- Raskt tine en delmengde av EBV. Fjern kolbe fra inkubator og legge EBV til cellene på 1 / 10 fortynning. Vanligvis gir denne utvanning en MOI på 50-100. Swirl kolbe å blande og plassere den stående i CO 2 inkubator ved 37 ° C.
Merk thi trinn 4, som utføres for å forutsi vellykket resultat, er et valgfritt trinn. Hvis Trinn 4 skal utføres, må du ruge en ekstra kolbe av un-infiserte PBMC på 2 x 10 6 celler / ml som kontroll.
Fire. Identifisere prolifererende populasjon av celler (valgfritt trinn)
- Forbered FACS buffer: PBS + 5% FBS. Oppbevares ved 4 ° C.
- Gjør følgende antistoff blander i 50 mL volum hver for farging celler i trinn 4.6. Antistoff fortynninger bør gjøres i FACS buffer som inneholder 1mg/ml av mus IgG (Sigma) hemmer ikke-spesifikk binding av antistoffer.
- single-farget med PE-konjugert anti-CD23 antistoff (1 / 50 fortynning)
- single-farget med FITC konjugert anti-CD58 antistoff (1 / 50 fortynning)
- single-farget med PE-Cy5 konjugert anti-CD19 antistoff (1 / 50 fortynning)
- trippel-farget for CD23, CD58 og CD19 (1 / 50 fortynning hver)
- single-farget med PE-konjugert isotype kontrollantistoff matchet til CD23-PE (på samme konsentrasjon som anti-CD23 antistoff)
- single-farget med FITC konjugert isotype kontroll antistoffet matchet til CD58-FITC (på samme konsentrasjon som anti-CD58 antistoff)
- single-farget med PE-Cy5 konjugert isotype kontroll antistoffet matchet til CD19-PE-Cy5 (på samme konsentrasjon som anti-CD19 antistoff)
- trippel-farget med alle tre isotype kontroll antistoffer.
- I dag tre etter eksponering for EBV, forsiktig virvel kolbe å få en mer ensartet celle suspensjon. Fjern 2ml fra kolbe til en 2ml Eppendorf rør. Spin tube i en mikrosentrifuge ved 3000 rpm i romtemperatur i 3 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i FACS buffer på 5 x 10 6 til 1 x 10 7 celler / ml.
- Fjern åtte 50μl alikvoter i individuelle Eppendorf rør eller en 96-godt V-bunn plate. Spin rør eller plate på 1500 x gi 3 minutter.
- Kast supernatanten og vortex rør / plate. Resuspender celler i hvert rør / brønn i 50 mL av FACS buffer som inneholder riktig antistoff fortynninger utarbeidet i 4.2.
- Inkuber rør / plate på is i mørke i 30 minutter. Sentrifuger cellene ved 3000 rpm i 3 minutter, fjern supernatanten, og legge til 200 mL av FACS buffer. Sentrifuger cellene igjen og fjern supernatanten å fullføre vask. Gjenta to vasker.
- Resuspender celler i 200 mL FACS buffer og skaffe data ved hjelp av et flowcytometer, skaffe 20 000 hendelser / tube.
- Analysere data ved hjelp WinMDI (freeware for FACS dataanalyse på PC). Gate på levende celler ved hjelp fremover og side scatter profiler. Deretter gate levende celler for uttrykk av CD19 + (B-celle merke) etter å sammenligne med celler farget med isotype kontroll antistoff matchet til anti-CD19 antistoff. Plot CD19 + leve B-celler med fluorescensintensitet for CD23 på x-aksen og fluorescensintensitet for CD58 på y-aksen. Bestem CD23 + og CD58 + celler ved å sammenligne til EBV-eksponerte celler farget med matchet isotype kontroll antistoffer. Tilstedeværelse av CD23 hi CD58 + celler i EBV-eksponerte kultur (Figur 2C) spår vellykket utvekst av EBV-infiserte vekst forvandlet celler. I kontrast, gjøre CD23 hi CD58 + celler ikke oppstår når cellene ikke blir utsatt for EBV (Figur 2A) eller utsettes for en ikke-immortalizing stamme av EBV (figur 2B). CD23 hi CD58 + celler har blitt eksperimentelt vist å gjennomgå spredning og deretter etablere LCL (14).
5. Utvidelse og nedfrysing av LCL
- Visualisering av cellene ved lysmikroskopi: Ved en uke etter EBV infeksjon, klynger av celler er synlig ved lysmikroskopi. Figur 3 viser et eksempel på tidlig mikroskopiske klynger (Figur 3B) i en kolbe.
- Etter hvert som tiden går, mikroskopiske klynger bli er større slik at klumper synligmakro i kolben. Figur 3C viser større klynger av celler i etablerte LCL ved lysmikroskopi.
- Fôring celler: Double volumet av kultur medium i kultur flaska på dag 12. Deretter utvider kultur ved å øke sitt volum 2-3 ganger med komplett RPMI.
- Periodisitet av fôring celler bør fastsettes basert på frekvensen av cellevekst. Når kulturen medium blir gul, er det generelt på tide å erstatte media som ovenfor. Vanligvis skjer dette en gang per uke. Imidlertid kan noen cellelinjer trenger å bli matet mer eller mindre hyppig. Expand kultur til 75-100 ml i løpet av de neste ukene.
- Kryokonservering: Når frysing ned celler, sentrifuger celler på 600 x gi 10 minutter i romtemperatur. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i kaldt fryser medium som inneholder 90% FBS og 10% Dimetylsulfoksid ved 1 x 10 7 celler / ml. Plasser røret i flytende nitrogen.
Seks. Representative resultater:
Vellykket utfallet er spådd av tilstedeværelsen av CD23 hi CD58 + celler. Ca 2-3% av levende celler på dag 3-4 etter eksponering for EBV bør ha denne profilen (Figur 2C). Andre sub-bestander av CD23 +, CD23 -, CD58 + og CD58 - celler observert etter eksponering for EBV vise minimal spredning 14. Un-infiserte celler (Figur 2A) og celler utsatt for EBV fra HH514-16 celler (figur 2B), husing en ikke-immortalizing stamme av EBV, ikke demonstrere CD23 hi CD58 + celler.
Du kan også visualisere cellene ved lysmikroskopi å overvåke vellykket resultat: Som nevnt tidligere, innen en uke etter EBV infeksjon, små klynger av celler i flaska er synlig ved lysmikroskopi (Figur 3B). Etter hvert som tiden går og celler utvikler seg til LCL, mikroskopiske klynger blitt større (Figur 3C) slik at klumpene er synlige makro i kolben.
Figur 1. Arbeidsflyt for generering og nedfrysing av lymfoblastoid cellelinjer. Perifert blod er sentrifugeres gjennom en Ficoll gradient. PBMC stede i Buffy Coat av en etablert gradient blir utsatt for FK506 etterfulgt av tilførsel av EBV. EBV-eksponerte celler dyrkes ved 37 ° C i nærvær av 5% CO 2 for å etablere og senere utvide LCL for nedfrysing.
Figur 2. Identifisering av en sub-populasjon av B-celler forventes å gjennomgå spredning etter eksponering for EBV. Un-infiserte PBMC (A) eller PBMC utsatt for EBV avledet fra HH514-16 celler (B) eller fra B95-8 celler (C) i nærvær av FK506 ble høstet på dag tre. Cellene ble farget med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer rettet mot CD19, CD23 og CD58. Etter gating på live-cells, un-infiserte (A) og EBV-eksponert (B og C) CD19 + B-celler ble undersøkt for uttrykk av CD23 og CD58. En sub-populasjon av B-celler uttrykker CD58 og høye nivåer av CD23 (CD23 hi CD58 +), observert bare i celler eksponert for transformasjon kompetent EBV (avledet fra B95-8 celler), er avbildet.
Figur 3. Visualisering av celle klynger i EBV-infiserte celler. PBMC ble behandlet med FK506 og infisert med EBV. Un-infiserte (A) og EBV-eksponert (B) celler ble undersøkt én uke etter infeksjon med fasekontrast mikroskopi (10X forstørrelse). Fem uker gamle lymfoblastoid cellelinje er vist i C.
Discussion
Metoden er beskrevet i denne artikkelen genererer LCL fra donor perifert blod med rask immortalization og nedfrysing ganger. Gjennom bruk av FK506, en T-celle immunosuppressiv, og høy titere av smittsomme virus vi er i stand til å fremme spredning av EBV-infiserte B-celler fra perifert blod mononukleære celler. Disse tiltakene gjør den beskrevne metoden mer effektiv, noe som resulterer i rask ekspansjon av celler for senere eksperimenter.
Tradisjonelt har veksten transformasjon blitt overvåket ved visualisering av klynger av cellene ved lysmikroskopi ca en uke etter eksponering til 6 EBV, 15. Imidlertid er clustering av celler ikke en spesifikk indikator på EBV-mediert vekst transformasjon. Vi har tidligere vist konsistent identifisering av proliferating celle befolkningen via flowcytometri 14, som gir en nøyaktig og spesifikk metode for å avgjøre vellykket resultat så tidlig som tre dager akteruter eksponering av B-celler til EBV.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NIH bevilgninger K08 AI062732, K12 HD001401 og 1UL1RR024139-02 og en Child Health Research Grant fra Charles H. Hood Foundation til SB-M. og ved Research Foundation ved State University of New York ved Stony Brook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
