Summary
我们描述了一种用于发电使用EB病毒转化的B细胞株的方法。我们也说明了一种新的分析，可以识别注定要进行改造，早在感染后3天的B细胞。
Abstract
B细胞与EB病毒（EBV）的感染导致扩散和随后的永生，致使建立的淋巴母细胞系在体外 （LCL） 。自拼箱潜伏EB病毒感染，他们提供了一个模型系统，以探讨EB病毒潜伏期，病毒驱动的B细胞增殖和肿瘤1。拼箱已用于目前在多种免疫检测2，3抗原。此外，拼箱可用于生成人类单克隆抗体4，5时，访问的主要生物材料是有限的6，7，提供了一个潜在的无限来源。
已被描述的各种方法，生成拼箱。较早的方法包括使用，如植物血凝素， 脂多糖 8有丝分裂原，美洲商陆有丝分裂原 （九）增加的EB病毒介导的永生化的效率。最近，其他人使用immunosuppr如环孢素essive代理商抑制T细胞介导的杀感染的B细胞7，10-12。
相当长的时间从EB病毒感染的细胞株的建立驱动器更快和更可靠的方法EBV驱动的B细胞生长转化的要求。使用高滴度的EB病毒和免疫抑制剂的组合，我们能够始终感染，改造，并从外周血B细胞产生拼箱。此方法使用少量的外周血， 在体外细胞集群感染的单核细胞可以证明。与EB病毒的存在，CD23，T细胞免疫抑制剂FK506的存在。传统上，B细胞增殖的生长约一周后与EB病毒感染的细胞的微观集群可视化监测。几个星期后肉眼可以看到的拼箱团块。我们描述了一个实验，以确定如果EB病毒介导克初rowth改造是成功的，即使在微观的细胞群可以证明。 您好 CD58 +细胞中观察到早3天，感染后的CD23的存在表明一个成功的结果。
Protocol
1。 EB病毒备料
- 继代培养的急剧增长的一个75厘米2组织培养烧瓶使用无菌技术B95 - 8细胞（ATCC CRL，1612; 13）在3 × 10 5细胞/ ml。细胞是含10％热灭活胎牛血清（FBS），，青霉素/链霉素在100U/ml和100微克/毫升，分别增长完全RPMI 1640和两性霉素B在0.5微克/毫升，37 °的存在彗星5％的CO 2。
- 四十八小时后，新鲜完整的RPMI 1640悬浮细胞在1 × 10 6细胞/ ml。为了诱使病毒生产，刺激细胞与20ng/ml tetradecanoyl佛波醋酸1小时（TPA）在一个标准的二氧化碳培养箱。用RPMI 1640洗涤细胞3次，以去除TPA。
- 在原始卷的完全RPMI 1640（1.2）重悬细胞，并将其放置在二氧化碳培养箱96小时烧瓶。这种方法已被证明是产生高滴度的传染性病毒相提并论粒子6。
- 600 X克离心10分钟，4 ° C，从细胞中分离含有EB病毒培养上清。过滤上清液通过0.45微米的过滤器，分装，并存放于-70 ° C超过一年。
另一种方法是获得从B95 - 8细胞从ATCC（VR - 1492）中含有EB病毒上清，ATCC建议使用稀释。
2。分离外周血单核细胞（PBMC）的
- 从捐助绘制成肝素的注射器或肝素化血管10毫升血。在室温下稀释在50毫升的锥形管的血用20 ml PBS。
- 底图稀释血液15毫升聚蔗糖Hypaque淋巴细胞分离液。离心225 × 克 ，在室温下30分钟的制动。
- 删除捉鬼外套和转移到一个新的50 ml锥形管。量提高到50毫升，用PBS，在室温下在600 XG 10分钟旋转。
- 宝R关闭上清。洗resuspending在50毫升PBS颗粒细胞，在室温和纺纱克600 × 10分钟。洗两次以类似的方式。
- 1毫升完全RPMI悬浮洗涤细胞。使用5μL细胞准备在台盼蓝的1 / 10稀释。使用一个血球计数活细胞。
- 在一个25厘米2组织培养瓶使用完全RPMI获得了2 × 10 6 / ml的细胞浓度调节音量。
3。感染EB病毒
- 他克莫司（股份公司科学）的细胞悬液从2.6到终浓度为20纳米。置于容量瓶中， 二氧化碳培养箱在37 ° C为一小时。
- 迅速解冻EB病毒等分。从孵化器中删除的烧瓶中，EB病毒添加到1 / 10稀释的细胞。通常情况下，这种稀释提供MOI 50-100。旋流烧瓶混合和直立放置在二氧化碳培养箱在37 ° C。
注意日在第4步进行预测成功的结果，是一个可选步骤。如果要执行第4步，你会需要孵育2 × 10 6细胞/毫升作为对照未感染者PBMC中的一个额外的烧瓶。
4。确定细胞增殖人口（可选步骤）
- 准备流式细胞仪缓冲区：PBS + 5％FBS。保存在4 ° C。
- 以下抗体各50μL的体积混合染色步骤4.6中的细胞。抗体稀释液应在流式细胞仪含1mg/ml的鼠IgG（Sigma公司）抑制非特异性结合的抗体的缓冲。
- 单染与PE标记的抗CD23抗体（1 / 50的稀释）
- 单染色FITC标记的抗CD58抗体（1 / 50的稀释）
- 单染与PE - Cy5的标记的抗CD19抗体（1 / 50的稀释）
- 三重染色CD23，CD58和CD19（每1 / 50稀释）
- 单PE标记的同型对照染色抗体相匹配（在相同浓度的抗CD23抗体CD23 - PE）
- 单染色FITC标记的同型对照抗体匹配（在相同浓度的抗CD58抗体CD58 - FITC）
- 单染色PE - Cy5的标记的同型对照抗体匹配，以CD19 - PE - Cy5的（在相同浓度的抗CD19抗体）
- 三，与所有三个亚型对照抗体染色。
- 在第三天后接触到EB病毒，轻轻漩涡容量瓶中，以获得更均匀的细胞悬液。卸下成2毫升Eppendorf管从烧瓶2毫升。自旋3分钟，在室温3000 RPM离心管。
- 流式细胞仪缓冲吸上清液和悬浮细胞，在5 × 10 6 1 × 10 7细胞/毫升。
- 删除8成单独的Eppendorf管50μL等分或96孔V型底板。旋管或盘在1500 × 克3分钟。
- 丢弃上清和涡管/板。每管中的悬浮细胞/孔50μL流式细胞仪4.2编写包含相应的抗体稀释缓冲。
- 就在30分钟的暗冰孵育管/板。在3分钟3000转离心细胞，取出上清液，加入200μL流式细胞仪缓冲。细胞再次离心，去除上清液完成洗。重复两个洗。
- 悬浮细胞在200μL，流式细胞仪缓冲和采集数据，使用流式细胞仪，获得20000事件/管。
- 使用WinMDI（流式细胞仪数据分析在PC免费）分析数据。门上使用正向和侧向散射配置的活细胞。然后，门活细胞表达CD19 +后与抗CD19抗体相匹配的同型对照抗体染色的细胞比较（B细胞标记）。剧情CD19 +生活乙Y轴X轴和CD58的荧光强度的细胞CD23的荧光强度。确定CD23 +和CD58 +细胞相匹配的同型对照抗体染色的细胞EB病毒暴露。 CD23 您好 CD58 +细胞（图2C）在EB病毒暴露的文化存在预测EB病毒感染的增长转化细胞的成功产物。相比之下，CD23 您好 CD58 +细胞不出现当细胞暴露于EB病毒（图2A）或接触到的EB病毒（图2B）非名垂千古的应变。 CD23 您好 CD58 +细胞已被实验证明经过扩散，并随后建立拼箱（14）。
5。扩建和冷冻保存的拼箱
- 可视光镜细胞：由EB病毒感染后一周，光镜下可见细胞簇。图3显示了一个早期微观集群的烧瓶中（图3B）的例子。
- 随着时间的推移，微观集群成为较大等，团块可见宏观在烧瓶中。图3C建立拼箱细胞光镜显示更大的集群。
- 喂养细胞：双12日在培养瓶中的培养液量。随后，扩大其体积用增加2-3倍，使用完全RPMI文化。
- 喂养细胞周期的确定应基于细胞的生长速度。当培养基变成黄色，这是一般的时间，以取代上述媒体。通常情况下，发生这种情况，每周一次。然而，某些细胞株可能需要美联储或多或少频繁。在未来数周内展开文化75-100毫升。
- 超低温冷冻保存：当冷冻细胞，离心600 × 克细胞在室温下10分钟。冷冰寒含90％FBS的培养基和10％二甲基亚砜取出上清，重悬细胞沉淀在1 × 10 7细胞/毫升。将管在液氮中。
6。代表性的成果：
成功的结果是预测CD23 您好 CD58 +细胞的存在。大约2-3％的活细胞接触到EB病毒后3-4天，应该有此配置文件（图2C）。其他子群CD23 +，CD23 - ，CD58 +，和CD58 -细胞观察到EB病毒暴露后显示最小的扩散14。未感染的细胞（图2A）和暴露从HH514 - 16细胞（图2B），EB病毒窝藏非名垂千古的应变，EB病毒的细胞没有表现出CD23您好CD58 +细胞。
您也可以可视化细胞光镜监视成功的结果：正如前面提到的一个星期内，EB病毒感染后，烧瓶中的小群细胞是通过光镜（图3B）可见。随着时间的推移和细胞发展到拼箱，微观集群变大（图3C），团块肉眼可见烧瓶。
图1。淋巴细胞系的产生和冷冻保存的工作流程。外周血是通过聚蔗糖梯度离心。外周血单核细胞在一个既定的梯度巴菲大衣目前暴露FK506的EB病毒除了。在37 ° C在5％CO 2，建立和随后扩大为冻存拼箱存在EB病毒的细胞生长。
图2：一个预计接受暴露后，以EB病毒扩散的B细胞亚群的鉴定。联合国感染外周血单个核细胞（A）或外周血单核细胞暴露于EB病毒HH514 - 16细胞（B）或从B95 - 8细胞中存在的FK506（三）派生的第3天收获。细胞对CD19，CD23和CD58的荧光标记抗体染色。经过对活细胞的浇注S，未感染的（A）和EB病毒暴露（B和C），CD19 + B细胞CD23和CD58的表达研究。表达CD58和高水平的CD23（CD23 您好 CD58 +），B细胞的一个亚群指出，只有在细胞暴露改造主管EB病毒（B95 - 8细胞的），是描述。
图3。EB病毒感染细胞的细胞团的可视化。 PBMC中均采用FK506和与EB病毒感染。联合国感染（A）和EB病毒暴露（二）细胞研究的一个星期后感染相衬显微镜（10X放大倍率）。五老周淋巴母细胞线是在C
Discussion
本文中所描述的方法生成拼箱从捐助者外周血快速永生和冷冻保存时间。通过使用FK506的，我们是能够促进外周血单核细胞的EB病毒感染的B细胞的增殖T细胞的免疫抑制剂，和传染性病毒的高滴度。这些干预使描述更有效的方法，导致在随后的实验细胞快速扩张。
传统上，增长方式已经由约一个星期暴露后EB病毒6，15光学显微镜的细胞群的可视化监控。然而，细胞集群EB病毒介导的生长转型不是一个具体的指标。之前我们已经证实通过流式细胞仪检测14细胞增殖人口的一致鉴定，提供准确和具体的方法来确定成功的结果早3天船尾ER曝光B细胞的EB病毒。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院授予K08 AI062732，K12的HD001401，并1UL1RR024139 - 02和儿童健康，从查尔斯H ·胡德基金会研究资助SB - M。在纽约州立大学石溪分校的研究基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Fisher Scientific | BP 928-250 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D 2650 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma-Aldrich | F 4135 | |
| Ficoll Hypaque lymphocyte separation media | Mediatech, Inc. | 25-072 | |
| FK506 | A.G Scientific | F 1030 | |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | I 8765 | |
| Mouse anti-human CD23 conjugated to PE | BD Biosciences | 555711 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE | BD Biosciences | 554680 | |
| Mouse anti-human CD58 conjugated to FITC | Pierce, Thermo Scientific | MA1-82159 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to FITC | BD Biosciences | 550616 | |
| Mouse anti-human CD19 conjugated to PE-Cy5 | BD Biosciences | 555414 | |
| Mouse isotype IgG1 conjugated to PE-Cy5 | Dako | X 0955 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R 8758 | |
| Tetradecanoyl phorbol acetate (TPA) | Calbiochem | 407952 | |
| FACS Buffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% Fetal Bovine Serum) |
References
- Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas. N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).
- Kubuschok, B. Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model. Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).
- Kuppers, R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).
- Traggiai, E. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat. Med. 10, 871-875 (2004).
- Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298, 2199-2202 (2002).
- Oh, H. -M. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).
- Ventura, M. Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island. Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).
- Henderson, E. Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus. Virology. 76, 152-163 (1977).
- Bird, A. G. Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes. J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).
- Neitzel, H. A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines. Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).
- Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A. In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).
- Pressman, S., Rotter, J. I. Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).
- Miller, G. Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes. Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).
- Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus. Virol. J. 8, 84-84 (2011).
- Tosato, G., Cohen, J. Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines. Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).
