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Bioengineering

एक कम बजट लेजर Axotomy प्रणाली के निर्माण में अध्ययन Axon पुनर्जनन सी. एलिगेंस doi: 10.3791/3331 Published: November 15, 2011

Summary

लेजर axotomy समय चूक इमेजिंग के द्वारा पीछा में परिवर्तन के प्रभाव परख के लिए एक संवेदनशील तरीका है

Protocol

1. एक लेजर पृथक प्रणाली का निर्माण

लेजर सुरक्षा काले चश्मे पहन लो और प्रारंभिक संरेखण के दौरान अच्छा लेजर सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग. देखो जब लेजर पर है कभी oculars के माध्यम से.

  1. घटकों के रूप में छवि में दिखाया गया breadboard पर व्यवस्थित. 1 (भी 2 उदाहरण देखें). नीचे लेजर (एक रिसर थाली अगर जरूरत के साथ), पेरिस्कोप पोस्ट, बोल्ट और बुलंद रेल का समर्थन करता है.
  2. अपनी खुर्दबीन स्थिति के लिए रेल अक्ष के साथ संरेखित करें. प्रेषित खुर्दबीन कंडेनसर लेंस से प्रकाश किरण के साथ संरेखित करें. रेल ऊंचाई (एक स्तर का उपयोग करें) और एक समायोज्य एपर्चर या रेल से चिपका लेंस के साथ स्थिति संरेखित करें. एपर्चर या लेंस संघनित्र बीम के लिए रेल के दोनों सिरों पर गठबंधन किया जाना चाहिए. लैब जैक रेल ऊंचाई समायोजन के साथ मदद कर सकता है.
  3. Polarizer Glan थॉम्पसन और लेजर बीम को आधे लहर थाली संरेखित करें. आप इस संरेखण पर लेजर की जरूरत नहीं है. खविदेश मंत्री सिर्फ उनके किनारों से टकराने के बिना दोनों के माध्यम से जाने की जरूरत है. Polarizer घुमाएँ के लिए एक सुविधाजनक और बीम डंप (Fig.1) के लिए उन्मुखीकरण की स्थिति प्रदान करते हैं. आप आधा लहर थाली लेसर शक्ति को समायोजित करने के लिए बारी बारी से होगा. Breadboard के लिए घटकों सुरक्षित.
  4. लेजर पर मुड़ें, 100, सतत मोड पल्स आवृत्ति सेट, और आधे लहर थाली का उपयोग न्यूनतम करने के लिए शक्ति को कम. एक नोट के बाद यह या लेंस कागज का उपयोग करने के लिए लेजर बीम कल्पना.
  5. समायोजित करें और ऊंचा रेल के अंत पर मुहिम शुरू की है दर्पण है कि बीम ऊपर लाने के लिए लेजर से kinematically घुड़सवार अनुक्रम में दर्पण तय. लेजर बीम दर्पण के केंद्र के लिए मोटे तौर पर गठबंधन करना चाहिए. दर्पण लेजर बीम अक्ष (Fig.1) के लिए मोटे तौर पर 45 डिग्री उन्मुख होना चाहिए.
  6. Coarsely पेरिस्कोप के शीर्ष पर और खुर्दबीन से प्रेषित प्रकाश किरण के केंद्र के लिए लेजर बीम संरेखित करने के लिए रेल के अंत पर kinematically घुड़सवार दर्पण समायोजित. दोनों लेजर बीम और टीवह खुर्दबीन से बीम प्रकाश संचारित किरण पथ में कागज सम्मिलित करके एक साथ देखे जा सकते हैं. सुनिश्चित करें कि किसी भी ND मध्यवर्ती मॉड्यूल में फिल्टर और apertures के बाहर या पूरी तरह से खुला है.
  7. पतले शीर्ष पेरिस्कोप और रेल दर्पण पर ठीक समायोजन के साथ प्रेषित प्रकाश किरण के केंद्र के लिए लेजर बीम संरेखित. कागज रेल दर्पण करीब पकड़ो और शीर्ष पेरिस्कोप आईने के साथ प्रेषित प्रकाश किरण के केंद्र के लिए लेजर बीम संरेखित. खुर्दबीन बंदरगाह के निकट कागज पकड़ो और लेजर बीम संचारित प्रकाश किरण के केंद्र के लिए रेल दर्पण समायोजन (Fig.2) के साथ संरेखित.
  8. एक के बाद यह स्थिति गठबंधन कंडेनसर लेंस और खुले उद्देश्य बुर्ज के बीच किरण पथ में ध्यान दें. आप केंद्र के पास छोटे लेजर बीम के साथ प्रेषित प्रकाश किरण देखना चाहिए. रेल दर्पण पर केंद्र लेजर बीम को ठीक समायोजन का उपयोग करें. जगह में clamps के साथ ठीक खुर्दबीन.

चरण 10.9-1.12 वैकल्पिक हैं, लेकिन यह आसान है और उपयोगी है संरेखण बीम विस्तार लेंस जोड़ने से पहले और लेजर पृथक आकलन है.

  1. बंद लेजर मुड़ें और यांत्रिक सुरक्षा शटर संलग्न. 50% किरण पथ के बाहर dichroic घुमाएँ. हालांकि कोई सीधा लेजर प्रकाश oculars पारित करेंगे, परिलक्षित प्रकाश काफी तीव्र किया जा सकता है. ठीक है और 60x तेल उद्देश्य के साथ संरेखण छवि के लिए लक्ष्य स्लाइड माउंट. स्लाइड पर खरोंच पर ध्यान दें. मध्यवर्ती मॉड्यूल में ND4 और ND8 फिल्टर में रखो.
  2. छवि लक्ष्य अपने CLSM के साथ स्लाइड, स्पिनिंग डिस्क, या सीसीडी कैमरा सिस्टम. लेजर मार्ग में 50% dichroic घुमाएँ इस बिंदु से, आप oculars के माध्यम से देखो कभी नहीं जबकि पृथक लेजर पर है. पृथक लेजर पर मुड़ें और ट्रिगर आवृत्ति, 100 के लिए मोड सेट, और नाड़ी की संख्या 10 से. सुनिश्चित करें कि शक्ति अभी भी आधे लहर थाली के साथ न्यूनतम करने के लिए सेट और फिर यांत्रिक सुरक्षा शटर को खोलने के. आप simultaneou कर सकते हैंधूर्त छवि और पृथक लेजर का उपयोग करें.
  3. जबकि लक्ष्य स्लाइड इमेजिंग, पृथक लेजर ट्रिगर. व्यास में एक पृथक हाजिर 1-10 उम के लिए लक्ष्य स्लाइड की जाँच करें. Sequentially एन डी फिल्टर निकाल तक पृथक जगह देखा जाता है. छवि के केन्द्र में रेल आईने के साथ पृथक हाजिर समायोजित करें. तुम वापस एक फिल्टर एन डी के लिए कमरा है पतले आधे लहर थाली के साथ लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए <1 उम पृथक मौके दे जोड़ना चाहते हैं जाएगा. 0.2 उम / पिक्सेल या कम और पतले छवि केंद्र (512X512 छवि के साथ 256,256 स्थिति) के लिए पृथक हाजिर समायोजित छवि.
  4. ध्यान और लेजर बीम की धुरी की गहराई की जाँच करें. फोकस और नीचे 1-2 उम और पृथक स्थिति और पृथक स्थान आकार की जाँच करें. यदि लेजर बीम axially गठबंधन किया है पृथक हाजिर नहीं ले जाएगा. असुविधाजनक लेजर बीम कई उम अधिक शक्ति वितरित (3-5 उम ऊपर से ध्यान के नीचे) के बारे में.

2. जोड़ें लेंस उद्देश्य वापस भरने के लिए लेजर बीम का विस्तारएपर्चर और समायोजित करने के लिए ध्यान केंद्रित नियंत्रण अभिसरण

  1. इस प्रणाली का उपयोग करता है दोहरी गलीली बीम विस्तारक लेजर बीम का विस्तार करने के लिए उद्देश्य के पीछे एपर्चर (10 मिमी) भरने. वाहक करने के लिए पर 4 लेंस माउंट और उन्हें रेल के लिए संलग्न (L1f1 + L2f2 और L3f1 '+ L4f2'). पदों को समायोजित करें ताकि सभी लेंस एक ही ऑप्टिकल अक्ष पर हैं और वास्तव में लेजर बीम (छवि 2) के लिए orthogonal.
  2. लेजर पर मुड़ें और इसे न्यूनतम शक्ति और सतत मोड को समायोजित. मोटे तौर पर प्रत्येक कागज का उपयोग करने के लिए लेजर बीम को देखने के लेंस के माध्यम से बीम संरेखण समायोजित और माइक्रोस्कोप संघनित्र से प्रकाश किरण संचरित. बंद करें और लेजर शटर.
  3. माइक्रोस्कोप के एक तरफ से clamps निकालें और माइक्रोस्कोप लेजर किरण पथ के बाहर स्लाइड. लेजर पर मुड़ें और सुरक्षा शटर हटायें.
  4. लेंस और लेजर बीम के ठीक संरेखण के पास में एक दीवार पर विस्तार लेजर बीम को देखने के द्वारा किया जा सकता है. बीम का विस्तार और अनुबंध संतुलित चाहिए ले जबnses ले जाया कर रहे हैं. पिछले दो kinematically घुड़सवार दर्पण को समायोजित करने के लिए बीम (fig.3) संरेखित.
  5. गठबंधन और विस्तार किरण प्रोफ़ाइल परिपत्र और समान चमक (fig.3) होना चाहिए. आकार और किरण की एकरूपता के साथ देखा जा सकता है के बाद यह उद्देश्य वापस एपर्चर की अनुमानित स्थिति पर ध्यान दें.
  6. किरण अनन्तता ऑप्टिकल प्रणाली के लिए शून्य अभिसरण करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. कन्वर्जेंस बीम कैसे आकार परिवर्तन टिप्पण द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है के रूप में आप एक के बाद यह चाल लेंस से आगे से ध्यान दें. बंद लेजर मुड़ें और यांत्रिक शटर संलग्न.
  7. लेजर बीम तय clamps का उपयोग करने के लिए सही संरेखण को परिभाषित के मार्ग में खुर्दबीन वापस स्लाइड. खुर्दबीन से मुक्त तरफ clamps बदलें, लेकिन कस नीचे नहीं है.
  8. लेजर पर मुड़ें और सुरक्षा शटर हटायें. एक खुले स्थान के उद्देश्य बुर्ज घुमाएँ. एक के बाद यह प्लेस मंच पर ध्यान दें. आप विस्तार और वर्दी लेजर प्रेषित प्रकाश ख पर केंद्रित बीम देखना चाहिएसंघनित्र से विदेश मंत्री (fig.4). आप ढीला खुर्दबीन clamps और ध्यान खुर्दबीन परोक्ष दबाव डाल द्वारा यह केंद्र की आवश्यकता हो सकती है.
  9. सुरक्षा शटर व्यस्त हैं, और लेजर सेट करने के लिए मोड ट्रिगर. जगह और लक्ष्य स्लाइड पर सतह खरोंच छवि में 60x उद्देश्य घुमाएँ.
  10. सुरक्षा शटर निकालें, पृथक लेजर ट्रिगर और न्यूनतम पृथक स्थान के लिए लेसर शक्ति को समायोजित. पृथक हाजिर परिपत्र और छवि केन्द्र के 5-10 उम के भीतर होना चाहिए.
  11. केंद्र kinematically घुड़सवार रेल आईने के ठीक समायोजन के साथ पृथक स्थान. आप iteratively दोनों पृथक हाजिर केंद्र रेल घुड़सवार और शीर्ष पेरिस्कोप दर्पण समायोजित करने और बनाए रखने के एक समान किरण प्रोफ़ाइल की आवश्यकता होगी.
  12. ध्यान केंद्रित व्यवस्थित 1 उम चरणों में ऊपर और नीचे और बढ़ पृथक लेजर ट्रिगर द्वारा लेजर की Z ध्यान का मूल्यांकन. विस्तार, गठबंधन, और अभिसरण समायोजित बीम छवि ध्यान केंद्रित करने में ज़्यादा से ज़्यादा ablate और सभी 1 उम अब चाहिए कमजोर है या नहींove या नीचे ध्यान केंद्रित (अंजीर 5).
  13. गलीली दूरबीन (Fig.2) के लेंस L3 हिल द्वारा विस्तारित बीम के Z ध्यान समायोजित करें.

3. लेजर axotomy माइक्रोस्कोपी और अक्षतंतु उत्थान के समय चूक

  1. माइक्रोवेव 10% संतुलित खारा में agarose (आरपीआई आण्विक जीवविज्ञान ग्रेड 0.1 EEO A20090) तक पूरी तरह पिघल. एक गर्म थाली पर बढ़ते के लिए प्रयोग के दौरान यह पिघला रखने सेट.
  2. पिघला हुआ agarose की एक बूंद एक गिलास स्लाइड पर रखा है और लगभग 200 मोटी उम (आसन्न स्लाइड पर एक समय टेप की एक परत एक स्पेसर के रूप में प्रयोग किया जाता है) एक पैड में एक गिलास स्लाइड के साथ चपटे.
  3. एक Sharpie मार्कर "टोपी के लिए बाहर 13mm का एक वर्दीधारी व्यास परिपत्र पैड में कटौती करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  4. (1ul Muscimol 20mm) संवेदनाहारी और microspheres (क्रिस फेंग - येन, व्यक्तिगत संचार) (1ul 2.65% Polystyrene पानी में 0.1 उम) 05/03 उन्मुख कीड़े द्वारा बाद पैड के केंद्र के लिए जोड़ रहे हैं ताकि वे अपनी बाईं तरफ झूठ बोल रहे हैं . एक गिलास coverslip लागू तो Vaseline coverslip मुहर और नमूने के वाष्पीकरण (fig.6) को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. पृथक लेजर क्रॉसहेयर गठबंधन किया है, जैसा कि ऊपर वर्णित प्रत्येक सत्र की शुरुआत में. लेजर सुरक्षा शटर व्यस्त हैं.
  6. लेजर संरेखण और लक्ष्य न्यूरॉन्स में एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ एक घुड़सवार वयस्क कीड़ा छवि लक्ष्य निकालें. एक समान (0.2 उम / पिक्सेल या उच्च आवर्धन) आवर्धन और क्रॉसहेयर (fig.7) के तहत स्थिति में छवि axons.
  7. लेजर सुरक्षा शटर खुला और पृथक जबकि इमेजिंग लेजर ट्रिगर. लेजर ट्रिगर करने के बाद अक्षतंतु का मूल्यांकन करें और धीरे धीरे लेजर शक्ति में वृद्धि जब तक अक्षतंतु काट रहा है. आप 10X अधिक लेजर शक्ति के बारे में की जरूरत संरेखण लक्ष्य स्लाइड (1uJ / एनएस नाड़ी के बारे में) पर एक पृथक स्थान के रूप में की तुलना में axons में कटौती करने के लिए होगा. हम आम तौर पर 2.5 kHz और शक्ति 0.27mW के बारे में (औसत सुसंगत FieldMaxII बिजली मीटर और लेजर 2500 हर्ट्ज पर निरंतर के लिए सेट के साथ नमूना पर मापा शक्ति) सेट पर 100 दालों के साथ काट. पृथक्करणलेजर बिजली सेटिंग भविष्य प्रयोगों (fig.7) में axons काटने के लिए संगत हो जाएगा.
  8. अक्षतंतु सफलतापूर्वक काट दो कटौती समाप्त होता है (fig.7) में चमक के एक हानि के बिना एक को तोड़ने के बारे में 0.5-1 उम के दिखाएगा. चमक या एक बड़ा अंतर (2-10 उम) की एक बड़ी हानि अक्सर एक cavitation बुलबुला द्वारा अक्षतंतु से परे व्यापक क्षति का प्रतीक है. अलग प्रॉक्सिमल और डिस्टल axons और त्याग बल्ब के रूप में अगले 30 मिनट में (8 छवि और मूवी).
  9. अपने खुर्दबीन मंच के साथ अपने समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए अपने घुड़सवार कीड़े समभार बनाना. यह तापमान मतभेद और agarose संकुचन के कारण बहाव को कम कर देंगे.
  10. ) समय चूक इमेजिंग पैरामीटर सेट कर रहे हैं आपके सिस्टम के साथ जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग. हम आम तौर पर 0.1-0.2 उम / पिक्सेल में छवि 10-20 जेड कदम (1um/step) लाभ, pinhole, स्कैन दर, और इमेजिंग लेजर शक्ति सेटिंग्स है कि जोखिम को कम का उपयोग करते हुए वांछित स्थानिक संकल्प दे. नमूनाकरण अंतराल ठेठ हैंly 15 घंटे से अधिक 1-5 मिनट वांछित अस्थायी समाधान (8 छवि और मूवी) पर निर्भर करता है.
  11. समय चूक छवि डेटा एनआईएस तत्वों या ImageJ का उपयोग फिल्मों में परिवर्तित कर रहे हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

लेजर axotomy इस प्रणाली का उपयोग कर एक विश्वसनीय और नियमित है. 7 आंकड़े में दिखाया गया है परिणामों ठेठ हैं. समय चूक अक्षतंतु पुनर्जनन की इमेजिंग बहुत मजबूत है इस प्रोटोकॉल का उपयोग. हम नियमित कटौती और छवि एक motorized मंच का उपयोग किसी एकल स्लाइड पर 5 अलग अलग कीड़े में 5 axons. केवल सीमा समय यह प्रत्येक अक्षतंतु, जैसे की छवियों को इकट्ठा करने के लिए लेता है, अगर यह 20 सेकंड लेता है एक अक्षतंतु के लिए एक ढेर इकट्ठा है तो आप ज्यादा से ज्यादा 9 axons (9 ढेर) नमूना है अगर आप हर 180 सेकंड नमूना हो सकता है. उदाहरण के आंकड़े 8 और 9 में दिखाया गया है एक अच्छा प्रतिनिधि परिणाम है. प्रयोगों के बारे में 10% इस गुणवत्ता के परिणाम दे. शेष प्रयोगों उत्थान phenotype पर अच्छा डेटा प्रदान करते हैं, लेकिन esthetically unappealआईएनजी क्योंकि कीड़ा है कि आम तौर पर स्थिरीकरण के 5-8 घंटे के बाद शुरू की छोटी jittering आंदोलनों.

चित्रा 1
1 लेजर पृथक प्रणाली चित्रा. 532 एनएम एन डी: Yag लेजर एक रिसर प्लेट पर मुहिम शुरू की है इसे अन्य घटकों की ऊंचाई करने के लिए लाने और breadboard के लिए bolted. (ऑप्टिकल अलगाने वैकल्पिक है और शायद जरूरत नहीं है). Polarizer Glan थॉम्पसन और आधे लहर प्लेट पतले लेजर सत्ता पर नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है. वे पतले कैलिब्रेटेड रोटेशन mounts में हैं. ख्याल रखना बीम डंप सेटिंग. कोने दर्पण कम पेरिस्कोप दर्पण लेजर बीम निर्देशन. ऊपरी पेरिस्कोप दर्पण रेल दर्पण किरण का निर्देशन. रेल दो रॉड समर्थित प्लेटफार्मों पर मुहिम शुरू की है. दोहरी गलीली लेंस फिसलने रेल mounts से जुड़े होते हैं. सूचना जोड़ा मध्यवर्ती पृथक लेजर को समर्पित मॉड्यूल. प्रणाली ऑप्टिकल इसोला को हटाने के द्वारा और अधिक कॉम्पैक्ट बना सकताटो और कोने, दर्पण, और breadboard के वापस किनारे करने के लिए लेजर, Glan थॉम्पसन polarizer और आधे लहर थाली repositioning.

चित्रा 2
चित्रा 2 दोहरी गलीली कंडीशनिंग लेंस एक शून्य अभिसरण वर्दी 10 मिमी आकार के लिए 300 उम TEMoo लेजर बीम का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक प्रयोगशाला जैक रेल पकड़े प्लेटफार्मों के तहत तैनात है. यह संरेखण चरणों के दौरान रेल ऊंचाई का समायोजन करने में मदद करता है. Crudely रेल L1 लेंस बढ़ते और एक संरेखण गाइड के रूप में संघनित्र बीम का उपयोग करके रेल ऊंचाई समायोजित करें. रेल समायोजित इतना है कि संघनित्र बीम रेल के दोनों सिरों पर लेंस के केन्द्र के लिए संरेखित करता है. इससे यह सुनिश्चित होगा रेल समानांतर खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष के लिए गठबंधन किया है. आप पहले माइक्रोस्कोप समायोजित करने की आवश्यकता करने के लिए रेल के ऑप्टिकल अक्ष मैच हो सकता है. Clamps माइक्रोस्कोप की स्थिति ठीक (अंजीर देखने के 1.) का प्रयोग करें. वें निकालेंई लेंस रेल घुड़सवार. अब रेल के दोनों सिरों पर संघनित्र बीम के केंद्र के लिए लेजर बीम संरेखित . किरण पथ में एक कागज करने के लिए दोनों एक साथ मुस्कराते हुए देख एक सुविधाजनक तरीका है. शीर्ष पेरिस्कोप दर्पण का उपयोग करने के लिए संघनित्र बीम करीब रेल घुड़सवार दर्पण के लिए लेजर बीम संरेखित. का प्रयोग करें रेल दर्पण घुड़सवार रेल के अंत तक (माइक्रोस्कोप निकटतम) संघनित्र बीम लेजर बीम संरेखित. अब रेल के रूप में आंकड़े में दिखाया गया करने के लिए सभी चार लेंस माउंट. रेल की लंबाई लेंस के फोकल लम्बाई, और लेंस की व्यवस्था अपने खुर्दबीन और शारीरिक सेट अप के आधार पर अलग अलग होंगे. क्रिटिकल पैरामीटर लेजर बीम व्यास और चुना उद्देश्य के पीछे एपर्चर के आकार के हैं. इन्फिनिटी ऑप्टिकल प्रणाली एक पूरी तरह से समानांतर लेजर बीम (शून्य अभिसरण) ध्यान दिया जाएगा. L1 और L2 के बीच दूरी लेंस के योग के फोकल लंबाई, f1 + F2, और L3 और L4 के बीच की दूरी को तदनुसार f1 'F2 +' होना चाहिए चाहिए. वें के बीच की दूरीई दोहरी गलीली जोड़े महत्वपूर्ण नहीं है. L3 की स्थिति पतले बीम अभिसरण नियंत्रण समायोजित कर सकते हैं, <1mm समायोजन करने के लिए छवि ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर का ध्यान समायोजित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. मध्यवर्ती मॉड्यूल है कि किरण पथ (या वे क्या कर के बारे में पता होना और अपने सिस्टम को तदनुसार समायोजित) में हो सकता है से सभी लेंस, फिल्टर, apertures, आदि को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.

चित्रा 3
लेजर बीम की दोहरी गलीली लेंस के माध्यम से 3 संरेखण चित्रा. माइक्रोस्कोप के एक तरफ से खुर्दबीन clamps निकालें तो खुर्दबीन किरण पथ के बाहर स्थानांतरित कर सकते हैं, लेकिन शेष clamps खुर्दबीन ठीक हो repositioned अनुमति देगा लेजर सुरक्षा सोचो. यकीन है कि लेजर शक्ति Glan - थॉम्पसन polarizer के साथ एक न्यूनतम करने के लिए निकाला जाता है. लेजर पर मुड़ें और दीवार पर लेजर बीम पैटर्न देखने. आप पा सकते हैं एक दीवार को टेप कागज लेजर देखने में मदद करता हैहाजिर. व्यवस्थित लेंस के पदों को समायोजित करने के लिए वे क्या बीम आकार और स्वरूप के लिए के लिए एक महसूस हो. तुम कुछ देखना चाहिए कि पैनल की तरह लग रहा है एक, जहां एक गहन जगह बहकते हुए एक dimmer प्रोफ़ाइल में स्थित है. रेल - घुड़सवार दर्पण का प्रयोग केंद्र तीव्र हाजिर समायोजित के रूप में पैनल बी अब शीर्ष पेरिस्कोप का उपयोग दिखाया दर्पण मुहिम शुरू करने के लिए एक समान परिधीय प्रोफ़ाइल दे. यदि सब कुछ सही ढंग से गठबंधन किया है अब आप पाते हैं कि चलती लेंस बीम का विस्तार और संतुलित अनुबंध का कारण बनता है चाहिए. लेंस पीछे हटो शुरू पदों के रूप में आंकड़ा 2 में दिखाया गया है. अब उद्देश्य वापस एपर्चर की दूरी पर बीम अवरोधन. यह कम से कम काफी बड़े के लिए अपनी पीठ एपर्चर को भरने, और एक समान चमक के परिपत्र होना चाहिए. यह ठीक है अगर यह बड़ा है, के रूप में लंबे समय के रूप में आप अपने ablations के लिए पर्याप्त लेजर शक्ति है. अभिसरण उद्देश्य वापस एपर्चर और दीवार की दूरी पर बीम व्यास की तुलना द्वारा मूल्यांकन. बीम व्यास चाहिएएक शून्य अभिसरण बीम के लिए समान होना. स्केल बार 10mm है.

चित्रा 4
संघनित्र बीम विस्तार लेजर बीम का संरेखण चित्रा 4. लेजर शटर और माइक्रोस्कोप लेजर संरेखण बंद हो जाता है के रूप में clamps का उपयोग बीम के रास्ते में कदम वापस. पर मुड़ें, संरेखित करें, और संघनित्र बीम oculars से अधिक एक उद्देश्य लेंस. टेप कागज का उपयोग करने के लिए तीव्र परिलक्षित लेजर प्रकाश को देखने से किसी को रोकने पर ध्यान केंद्रित. एक खुले स्थान के उद्देश्य बुर्ज घुमाएँ. मंच पर कागज का एक टुकड़ा रखो संघनित्र बीम रोक देना. लेजर सतत मोड पर मुड़ें और यांत्रिक सुरक्षा शटर हटायें. आप कुछ लेजर खुर्दबीन हालांकि आने वाले प्रकाश देखना चाहिए. खुर्दबीन clamps ढीला और धीरे कुहनी से हलका धक्का खुर्दबीन संघनित्र किरण के साथ लेजर बीम संरेखित. लेजर बीम परिपत्र और वर्दी चमक होना चाहिए. यह कभी कभी adju के लिए उपयोगी हैसेंट लेंस रेल घुड़सवार. आप विस्तार और लेजर बीम अनुबंध समान संरेखण अगर सही है सक्षम होना चाहिए. आप न्यूनतम केंद्रित संघनित्र बीम रेल घुड़सवार दर्पण के साथ अनुबंधित लेजर बीम केंद्र और तब इच्छित आकार करने के लिए विस्तार कर सकते हैं. एक बार जब आप रेल आईने के साथ अनुबंधित बीम की स्थिति को समायोजित करने के लिए, आप शीर्ष घुड़सवार पेरिस्कोप दर्पण रद्दोबदल करने के लिए विस्तारित किरण के समान चमक बनाए रखने की आवश्यकता होगी. यदि आप एक परिपत्र केंद्रित लेजर बीम नहीं प्राप्त कर सकते हैं तो आप पहले संरेखण कदम के माध्यम से वापस जाने की आवश्यकता होगी.

चित्रा 5
चित्रा 5 पृथक जगह सेंटर और अधिकतम ध्यान देने के लिए लेजर बीम अभिसरण समायोजित. बंद करें और लेजर शटर. अखबार निकालें और माउंट नजर आता है लक्ष्य स्लाइड (आप भी एक लक्ष्य के रूप में 2 coverslip पर स्थायी मार्कर स्याही का उपयोग कर सकते हैं). 60 के साथ नजर आता है सतह पर खरोंच छविएक्स 1.4na तेल) लेंस छवि एक confocal या सीसीडी के साथ सतह. Oculars के माध्यम से नहीं लग रही है जबकि लेजर पर है. पर मुड़ें और लेजर खोलना. लेजर मोड, सबसे कम बिजली, और 100 हर्ट्ज ट्रिगर सेट. 10 दालों के बारे में उत्प्रेरक. आप देखने के केंद्र के 10 उम के भीतर व्यास में 1-5 उम के एक पृथक स्थान देखना चाहिए. यदि आप एक पृथक स्थान नहीं देखते हैं आप 5-10% चरणों में लेजर की शक्ति में वृद्धि कर सकते हैं. एक बार जब आप एक पृथक जगह है, यह देखने के क्षेत्र के लिए केंद्र की पहचान. 256, 256 निर्देशांक पार बाल रखो अगर 512X512 छवि को देखने. यदि आप केंद्र के लिए लेजर हाजिर समायोजित तो यह स्थिति zooming के साथ नहीं बदल जाएगा. रेल दर्पण का प्रयोग करें घुड़सवार केंद्र क्रॉसहेयर पृथक हाजिर कदम. लेजर बीम की एकरूपता को हटा के रूप में चित्रा 4 में ऊपर वर्णित उद्देश्य के साथ किरण को देख द्वारा reevaluate. शीर्ष पेरिस्कोप घुड़सवार दर्पण के साथ किरण एकरूपता समायोजित करें. पृथक मौके की स्थिति के मूल्यांकन को दोहराएँ. यह एक पी चलने का हैrocess है कि जब तक पृथक हाजिर केंद्रित है और विस्तार बीम वर्दी है दोहराया जाना चाहिए. यदि सही ढंग से किया पृथक हाजिर परिपत्र के रूप में पृथक आकृति में फोकस में हाजिर में देखा जाएगा. अगले z अक्ष में लेजर बीम का ध्यान केंद्रित का मूल्यांकन. लेजर ट्रिगर करने के लिए केंद्र में के बारे में 1 उम के एक पृथक हाजिर उत्पादन. अब 5 उम के बारे में स्लाइड पार्श्व चाल और लक्ष्य स्लाइड की सतह के नीचे एक उम ध्यान केंद्रित. एक ही लेजर सेटिंग्स के रूप में आप पहली पृथक स्थान के लिए प्रयोग किया जाता का उपयोग लेजर ट्रिगर. लक्ष्य स्लाइड की सतह से ऊपर 1 उम ध्यान केंद्रित करने के बाद दोहराएँ. यदि छवि ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर बीम ध्यान केंद्रित है तो आप इस आंकड़े में दिखाया गया है कि एक समान पैटर्न देखना चाहिए. सबसे बड़ा पृथक हाजिर छवि ध्यान केंद्रित करने और पृथक ऊपर और नीचे स्पॉट ध्यान केंद्रित संतुलित छोटे हो जाना चाहिए के अनुरूप होना चाहिए. लेंस L3 समायोजित फोकल विमानों संरेखित करें. लेंस L3 खुर्दबीन से दूर चल रहा बीम अधिक संसृत बनाने के लिए और पृथक हाजिर करने के लिए करीब कदम होगाउद्देश्य. लघु <1mm समायोजन ध्यान केंद्रित के पास की जरूरत होगी. अब आप axons में कटौती के लिए तैयार हैं. स्केल बार है 1 उम.

चित्रा 6
चित्रा लेजर axotomy और समय चूक इमेजिंग के लिए 6 बढ़ते कीड़े . Agarose खारा में 10% पूरी तरह से पिघल तक गरम किया जाता है. एक छोटी सी बूंद एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर रखा जाता है और फिर एक और स्लाइड के साथ चपटा एक फ्लैट पैड के रूप में. पैड की मोटाई टेप के द्वारा दो आसन्न स्लाइड्स पर सेट कर दिया जाता है. पैड के बारे में 1 मिनट के लिए सेट करने की अनुमति दी है और तब स्लाइड्स को अलग कर रहे हैं. एक कुकी कटर के रूप में एक "Sharpie" शीर्ष 13mm के बारे में एक समान आकार के पैड के रूप में प्रयोग किया जाता है. 10mm Muscimol के 1 उल और microspheres की 1 उल पैड के केंद्र (फेंग येन व्यक्तिगत संचार) करने के लिए जोड़ रहे हैं. कीड़े 2 उल और गिलास coverslip पर डालने से पहले ड्रॉप उन्मुख करने के लिए जोड़ रहे हैं. वेसिलीन तो यह मुहर coverslip के किनारे करने के लिए एक सिरिंज (20-25 गा सुई) से लागू किया जाता है.


सी एलिगेंस में लेजर axotomy के 7 ठेठ परिणाम चित्रा. एक में आप पहले और बाद में लेजर axotomy बरकरार अक्षतंतु शीघ्र ही देख सकते हैं. अंतर के बारे में 0.5-1um सामान्य है. बी के बारे में 1 उम दूर पास अक्षतंतु को नुकसान पहुँचाए बिना एक अक्षतंतु के लेजर axotomy दिखाता है. लेजर के बारे में 10% (2500 हर्ट्ज में 0.3 मेगावाट औसत), बिजली, और 100 दालों के लिए स्थापित किया गया था. स्केल बार 5 उम है.

8 चित्रा
8 चित्रा. ठेठ जंगली प्रकार उत्थान L4. यह एक समय पृथक और अक्षतंतु उत्थान के समय चूक रिकॉर्डिंग दिखा श्रृंखला है. 0 मिनट पर लेजर axotomy के फौरन बाद आप त्याग बल्ब देख सकते हैं. 138 मिनट तक त्याग बल्ब अपनी दूर हद तक वापस खींच लिया है और अब फिर से तैयार करने के लिए शुरू कर दिया. छिटपुट झिल्ली protrusions (mircospikes या filopodia) अक्षतंतु शाफ्ट (138 और 324 तीर) के साथ देखा जा सकता है है.सही स्टंप 360 मिनट पर एक अच्छी तरह से बनाई कॉम्पैक्ट विकास शंकु फैली हुई है. 414 मिनट के दोनों स्टंप विकास शंकु बढ़ाया है. प्रारंभिक भ्रूण की तरह विकास शंकु dystrophic बन के रूप में वे पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड (414, 519 और 597 मिनट) की ओर विस्तार. dystrophic विकास शंकु पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड (960 मिनट) के कम स्टाल. Arrowheads प्रॉक्सिमल स्टंप और विकास शंकु बिंदु. तीर बाहर प्रॉक्सिमल अक्षतंतु शाफ्ट के साथ झिल्ली protrusions बिंदु. स्केल बार 20um.

1 मूवी मूवी जंगली प्रकार अक्षतंतु पुनर्जनन के. इस फिल्म बार 8 चित्र में दिखाया गया है अंकों के साथ साथ चला जाता है. कीड़े के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है और axons के बारे में 10 घंटे के लिए हर तीन मिनट में imaged थे घुड़सवार थे. जेड के ढेर (20 ​​एक्स 1um) हर समय बिंदु पर ले जाया गया और अधिकतम प्रक्षेपण एल्गोरिथ्म (एनआईएस तत्वों) द्वारा एकल छवियों में विलय फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

वहाँ अलग अलग लेजर प्रणाली 3,5-11 के साथ कई अच्छे लेजर microsurgery की चर्चा कर रहे हैं. Femtosecond आईआर लेज़रों subcellular 12 और सुविधाजनक अगर एक इमेजिंग सुविधा के साथ जुड़े लेजर पृथक के लिए "सोने के मानक 'कर रहे हैं, लेकिन वे अक्सर व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं के लिए बहुत महंगा है. यदि आप इमेजिंग की गहराई की वजह से एक femtosecond IR लेजर इमेजिंग के लिए अपने नमूना की आवश्यकता है तो आप शायद एक लेजर axotomy के लिए की आवश्यकता होगी. सतह के 30-50 उम के भीतर लक्ष्य axons के साथ पारदर्शी ऊतकों शायद 20 / UJ नाड़ी एक उच्च ना विसर्जन लेंस के माध्यम से लक्षित रेंज में नीले और हरे रंग पल्स लेज़रों के साथ संभव है. नैनो और femtosecond लेजर के साथ तुलना पिको दूसरा लेज़रों के साथ संपार्श्विक क्षति, लक्ष्य अक्षतंतु बढ़ की गहराई के रूप में विशेष रूप से सी.. एलिगेंस पारदर्शी है और सभी axons सतह के 20-30 उम के भीतर हैं . हम नियमित रूप से मोटर axons कि सतह के 5 उम के भीतर हैं काटा. हम भी आसानी से कुल्हाड़ी कटौतीतंत्रिका अंगूठी के भीतर ons है कि छल्ली सतह से लगभग 20 उम हैं. हम axons को काटने के लिए एक वयस्क कृमि के व्यास के माध्यम से के बारे में 30-50 उम के लिए सीमा मिला. यह संभावना है कि लेजर पृथक यहाँ वर्णित व्यवस्था अच्छी तरह से कई अलग अलग तैयारी है कि लक्ष्य axons की पारदर्शिता और गहराई के मापदंड फिट के साथ काम करेगा. फिर भी, यह थोड़ा आश्चर्य की बात है femtosecond पराबैंगनीकिरण आईआर कि नैनो और picosecond 355 एनएम और 532 एनएम लेज़रों के सैद्धांतिक लाभ दिया, सी. में लेजर axotomy के लिए इतनी अच्छी तरह से प्रदर्शन 6,13 एलिगेंस. हम साथ 440 एनएम nanosecond nanosecond 532 एनएम, और आईआर femtosecond पराबैंगनीकिरण लेजर axotomy के जवाब में अक्षतंतु पुनर्जनन में कोई मतभेद देखते हैं.

ठोस राज्य के 355 एनएम यूवी लेज़रों के रूप में एक ही लागत के बारे में हैं 532 एनएम क्यू स्विचड ठोस राज्य लेजर डायोड निष्क्रिय पंप, लेकिन या तो उच्च शक्तियों या प्रकाशिकी कि कुशलतापूर्वक इन छोटे तरंगदैर्य से गुजारें की आवश्यकता है. अधिकांश प्रकाशिकी के लिए 400 दिखाई के साथ अच्छा प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं -700 एनएम प्रकाश. कम प्लाज्मा दहलीज, छोटे स्थान आकार, और एक लंबे पास dichroic कुशलता से लक्षित करने के लिए पृथक लेजर के 100% प्रत्यक्ष और नमूना संकेत की हानि के बिना GFP के युगपत इमेजिंग की अनुमति के रूप में जैसे 6 355 एनएम लेज़रों कुछ लाभ की पेशकश करेगा. ब्लू 440 एनएम लेज़रों एक दृश्य प्रकाश लेजर (मानक प्रकाशिकी और सुरक्षा के साथ अच्छा प्रदर्शन) के साथ काम करने के फायदे बनाए रखने होगा. दुर्भाग्य से, एक DPP Q बंद ठोस राज्य के 440 एनएम लेजर की लागत 3 बार एक 355nm या इसी तरह की सत्ता के इस समय में 532 एनएम लेजर की लागत है. यदि हम सी. के लिए एक नई प्रणाली डिजाइन कर रहे थे एलिगेंस, जहां लक्ष्य गहराई कम है, हम 1 पर एक यूवी पारदर्शी (355nm पर 50-70% के संप्रेषण के साथ लागत के बारे में एक 40x 1.3na तेल लेंस के लिए 3,000 डॉलर) लेंस और एक 355 एनएम 5-10 UJ / नाड़ी उत्पादन लेजर के लिए चुनते हैं -20 kHz.

Axon पृथक प्लाज्मा गठन के लिए कारण माना जाता है. छोटा दालों कम बिजली और प्लाज्मा मात्रा w प्लाज्मा थ्रेसहोल्ड उत्पादन होगा बीमार 6 छोटे हो. लक्ष्य के लिए सबसे कम बिजली पल्स ऊर्जा समायोजन करके छोटी और कम से कम रहते प्लाज्मा का उत्पादन होता है. बड़े लंबे समय रहते plasmas cavitation बुलबुले उत्पन्न होगा कि क्षति कोशिकाओं के आसपास. हम आम तौर पर पाया है कि सर्वोच्च आवृत्ति (यानी 2.5kHz) में 5-10 के बारे में दालों का उपयोग पृथक सबसे अच्छा परिणाम देता है. यह पता चलता है कि नुकसान धीरे - धीरे बेहतर क्षति की सीमा पर नियंत्रण के लिए दालों की एक श्रृंखला पर एकीकृत किया जा सकता है कि. लेजर पृथक यहाँ वर्णित प्रणाली बहुत क्षमा है अगर बीम और गठबंधन का विस्तार सही. हम 10% लेसर शक्ति (0.3 मेगावाट की औसत 2500 हर्ट्ज में मापा और अनुमान 1 UJ / नाड़ी) में वयस्क कीड़े में axons काटने शुरू है और 14% बिजली के माध्यम से सीमित स्थानीयकृत क्षति के साथ में कटौती कर सकते हैं. आप 15-39% लेसर शक्ति से क्षति के बड़े क्षेत्रों का निरीक्षण कर सकते हैं, लेकिन केवल 40% बिजली (के बारे में 1 मेगावाट औसत 2500 हर्ट्ज में मापा) के ऊपर कीड़े बड़े cavitation बुलबुले और कीड़ा छल्ली को नुकसान की वजह से विस्फोट.

e_content "> Steinmeyer एट अल 2010 2 कागज एक लेजर पृथक प्रणाली के निर्माण के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है. लियोन एवरी भी एक लेजर पृथक एक सस्ती N2 गैस 337 एनएम लेजर पर आधारित प्रणाली का एक अच्छा वर्णन व्यावहारिक है और वह कुछ महान व्यावहारिक प्रदान करता है (elegans.swmed.edu / / Worm_labs एवरी /) सलाह. जब अपनी खुद की प्रणाली डिजाइन आप पहली बार अपने खुर्दबीन के प्रतिनिधि के साथ बात करने के लिए निर्धारित कैसे खुर्दबीन उद्देश्य के लिए पृथक लेजर लक्षित करने के लिए चाहिए आपका माइक्रोस्कोप एक कंपन अलगाव की मेज पर रखा होना चाहिए. (न्यूपोर्ट, TMI, थोर) एक breadboard शीर्ष इष्टतम है, लेकिन अभी भी एक ठोस इस्पात शीर्ष चुंबकीय positioners के साथ प्रयोग किया जा सकता है एक ईमानदार गुंजाइश पर एक समर्पित मध्यवर्ती मॉड्यूल अच्छा है क्योंकि सभी ऑप्टिकल तत्वों जगह में छोड़ा जा सकता है है. लेकिन यह, कम खर्चीला और अधिक करने के लिए एक कैमरा (उल्टे) बंदरगाह या एक "combiner" एक महामारी फ्लोरोसेंट बंदरगाह से जुड़ी का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक हो सकता है. तुम वापस एपर्चर और संप्रेषण के आकार पता है की जरूरत है (एक में उद्देश्य लेंस के blation लेजर) तरंगदैर्ध्य आप उपयोग करना चाहते हैं. एक बार जब आप (जैसे, Crylas, कुलबुलाना, क्रिस्टल, या सीआरसी) लेजर आप सही ऑप्टिकल तत्वों, हार्डवेयर और सुरक्षा उपकरणों का चयन के साथ मदद के लिए थोर या न्यूपोर्ट से संपर्क करना चाहिए पर फैसला. हम एक दोहरी गलीली बीम अंतरिक्ष को बचाने के विस्तारक पर फैसला किया है, लेकिन एक सरल Keplerian विस्तारक (f2/f1 = विस्तार कारक) एक विकल्प है. एक कस्टम बीम विस्तारक कम से कम महंगी हो जाएगा, लेकिन न्यूपोर्ट, थोर, और लेजर निर्माताओं में से कई उत्कृष्ट गुणवत्ता वाणिज्यिक बीम विस्तारक प्रदान करते हैं. कुछ लेजर निर्माताओं भी है कि लागत प्रभावी और अंतरिक्ष की बचत हो सकता है मैनुअल और इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित attenuators का प्रस्ताव है, लेकिन polarizer Glan थॉम्पसन और आधे लहर थाली के रूप में के रूप में बहुमुखी नहीं है. आप यह भी तय कैसे लेजर को नियंत्रित करने के लिए की आवश्यकता होगी. आप एक LabVIEW आधारित नियंत्रक डिजाइन, एक वाणिज्यिक टीटीएल जनरेटर, या सॉफ्टवेयर लेजर कंपनी द्वारा प्रदान का उपयोग कर सकते हैं. विशिष्ट निर्माता के साथ लेजर विकल्पों पर चर्चा करें.

"तम्बू> हम प्रणाली यहाँ वर्णित है के बारे में 15,000 डॉलर की लागत जब हमारे मौजूदा इमेजिंग प्रणाली के लिए जोड़ा. अपने स्थानीय भौतिकी विभाग अक्सर करने के लिए एक व्यावहारिक परिचय प्रदान करने के लिए तैयार किसी को होगा हार्डवेयर हम केवल एक सामान्य गाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है की एक सूची उपलब्ध कराई है. सुरक्षित रूप से मुक्त बीम लेज़रों के साथ काम कर रहा है.

स्थिरीकरण और सी. के समय चूक इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तरीकों एलिगेंस हाल ही में वर्णित किया गया है. 14

समस्या निवारण

सबसे कठिन और महत्वपूर्ण कदम केन्द्रित विस्तार खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष बीम के संरेखण है. एक बार जब आप बीम केंद्रित और गलीली लेंस तुम कठिन काम करने के लिए गठबंधन से पहले केंद्र को अंतिम संरेखण के लिए स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग करना चाहिए खुर्दबीन ऑप्टिकल अक्ष के उम 5 के भीतर के माध्यम से विस्तार किया है. स्टीयरिंग दर्पण के अत्यधिक उपयोग के लिए खुर्दबीन के लिए बीम संरेखित बंद बीम के माध्यम से यह कदम होगा अक्षविस्तारक अत्यधिक सावधानी का उपयोग आप उचित एन डी फिल्टर के साथ लेजर बीम attenuate और एक चिंतनशील लक्ष्य (सामने की सतह दर्पण) पर सीधे लेजर बीम प्रोफ़ाइल देख सकते हैं . तुम धीरे कुहनी से हलका धक्का देखने के 60x उद्देश्य क्षेत्र में ठीक बीम केंद्र माइक्रोस्कोप (अगर यह ऊपर / नीचे रेंज आप रेल ऊंचाई को समायोजित करने के लिए की जरूरत में केंद्रित नहीं कर सकते हैं कर सकते हैं). किरण प्रोफ़ाइल करने के लिए ठीक खुर्दबीन ऑप्टिकल अक्ष संरेखित करने के लिए एक केंद्रित बीम है कि परिपत्र है और संतुलित "flares" दे इस्तेमाल किया जा सकता है. एक असममित भड़क एक संकेत है कि खुर्दबीन अक्ष पूरी तरह से (या रेल स्तर नहीं है) गठबंधन नहीं है. अंत में, आप L3 समायोजित और एक भी और सममित और बीम के विस्तार और संकुचन देखने चाहिए. खुर्दबीन ठीक लक्ष्य की सतह पर फोकस तब समायोजित L3 छोटी हाजिर करने के लिए लेजर बीम ध्यान केंद्रित. अब आप पाते हैं कि लेजर बीम के केंद्र उम 5 भीतर है जब LSCM या सीसीडी प्रणाली के माध्यम से imaged और पृथक हाजिर भीतर हैजेड ध्यान के 1um.

यदि आप पाते हैं आप "उड़ाने" कर रहे हैं कीड़े या लगातार बड़े cavitation बुलबुले पैदा axons आपकी समस्या को सबसे अधिक संभावना पृथक लेजर के ठीक संरेखण में कटौती. सुनिश्चित करें कि कम से कम (<500nm) पृथक जगह जेड (L3 लेंस के साथ अभिसरण समायोजित) ध्यान केंद्रित करने के लिए और XY प्रत्ययी हाजिर (पिछले kinematically घुड़सवार दर्पण के साथ समायोजित) स्थानीयकृत है.

Axons की सतह के लिए करीब लक्ष्यीकरण कम लेसर शक्ति की आवश्यकता होगी. इसी तरह, छोटे जानवरों (L1 और L2) axotomy के लिए कम लेजर शक्ति वयस्कों में एक ही axons लक्षित करने के लिए तुलना की आवश्यकता होगी.

यदि आपके जंगली प्रकार axons पुनर्जन्म या नहीं axons ब्लीच आप लेजर इमेजिंग शक्ति को कम करने या कम नमूना दर के प्रयास करना चाहिए. यदि आपके कीड़े मर जाते हैं या बन रोगीवत चरणों में 1% प्रतिशत agarose को कम करने की कोशिश करो. जब प्रति उच्च का उपयोग सुनिश्चित करें कि आप बढ़ते कीड़े के बाद coverslip नहीं बढ़ रहे हैं के रूप में इस बार उन्हें मरने के लिए कारण होगाcentage agarose और microspheres.

यदि आपके कीड़े फट या एक समय चूक सत्र के दौरान मरने की वजह से है: 1. प्रतिशत agarose बहुत अधिक है. 2. पृथक लेजर द्वारा छल्ली नुकसान पहुंचा. 3. Coverslip के बढ़ते के बाद आंदोलन. यदि छल्ली को नुकसान गलती है, यह केवल कि पृथक लेजर के साथ लक्षित किया गया है घुड़सवार कीड़े को प्रभावित करेगा.

यदि आपके कीड़ा एक समय चूक सत्र के दौरान बहुत ज्यादा चलता चरणों में 0.5% प्रतिशत agarose बढ़ाने का प्रयास करें. स्वस्थ कीड़े में स्वस्थ axons हमेशा से रहे हैं "" सक्रिय है और प्रतिदीप्ति का एक सुसंगत स्तर प्रदर्शित. यदि आप प्रतिदीप्ति या गतिविधि में अचानक कमी देखते कीड़ा मर या मर चुका है. एकाधिक मनके या खंडित axons एक मरते हुए या मृत कीड़ा की एक निश्चित संकेत हैं.

यदि आप मुसीबत ध्यान केंद्रित करने में पूरे समय चूक सत्र के दौरान अपने axons रखने है वहाँ कई अलग अलग समस्याओं का हो सकता है. इमेजिंग द्वारा पहले 10 घंटे पर अपने चरण बहाव एक गिलास स्लाइड पर एक आभ्यांतरिक नमूने की जांचरु. एक microns कुछ बहाव थर्मल अस्थिरता के कारण हो सकता है, लेकिन अधिक से अधिक 5 उम शायद अपने खुर्दबीन के साथ यांत्रिक मुद्दों के कारण. बढ़ते के साथ कोई समस्या अधिक आम है. चलो अपने घुड़सवार कीड़े 30 मिनट के लिए अपने खुर्दबीन मंच के साथ संतुलित करना से पहले अपने समय व्यतीत हो शुरू. जाँच करें कि आपके वेसिलीन सील लीक अपना समय व्यतीत हो जाने के सत्र के दौरान विकसित नहीं था.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, तंत्रिका विज्ञान के लिए McKnight बंदोबस्ती कोष, क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन और Amerisure चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
535 nm Laser Crylas FDSS532Q3 (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers)
All optics and hardware (Thor offers comparable optics and hardware)
SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter Newport Corp. SS100-F2KN 2
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm Newport Corp. 10RP52-1 1
Rotation Stage, 1" Aperature Newport Corp. RSP-1T 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm Newport Corp. 10GL08AR.14 1
Polarizer Rotation Mount Newport Corp. RM25A 1
¼" spacer for 1" diameter post Newport Corp. PS-0.25 1
½" height, 1"diameter post Newport Corp. PS-0.5 1
Fork, 1" diameter post Newport Corp. PS-F 1
Beam Dump Newport Corp. PL15 1
Microscope Objective Lens Mount Newport Corp. LH-OBJ1 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm Newport Corp. 10Q20HE.2 4
SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole Newport Corp. SN100C-F 2
High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI Newport Corp. AJS100-0.5K 4
Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female Newport Corp. SS-1-B 2
Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 340-RC 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 1
Rail carrier for X26, square 40mm length Newport Corp. CN26-40 4
Steel Rail, 384mm (15") length Newport Corp. X26-384 1
Rod Platform for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 300-P 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 2
Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPC025AR.14 2
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX082AR.14 1
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX085AR.14 1
Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-0.5 2
Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-1 2
Microspheres 0.1um Polysciences, Inc. 00876
Agarose Research Products International Corp. A20090 EEO matters
Muscimol Sigma-Aldrich M1523

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References

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एक कम बजट लेजर Axotomy प्रणाली के निर्माण में अध्ययन Axon पुनर्जनन<em> सी. एलिगेंस</em
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Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).More

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).

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