Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Konstruera en låg budget Laser Axotomy systemet studerar Axon Regeneration i C. elegans doi: 10.3791/3331 Published: November 15, 2011

Summary

Laser axotomy följt av tidsförlopp imaging är ett känsligt sätt att analysera effekter av mutationer i

Abstract

Laser axotomy följt av tidsförlopp mikroskopi är en känslig analys för axonet förnyelse fenotyper i C. elegans 1. Den största svårigheten med denna analys är den upplevda kostnaden ($ 25-100K) och teknisk expertis som krävs för genomförande av ett system laser ablation 2,3. Däremot kan solid-state puls lasrar anspråkslösa kostnader (<$ 10K) ger robusta prestanda för laser ablation i transparent preparat för vilka mål axoner är "nära" till vävnaden ytan. Konstruktion och anpassning av ett system kan göras på en dag. Den optiska väglängden som ljuset från fokuserade kondensorn till ablation laser ger en bekväm justeringsledaren. En mellanliggande modul med alla borttagna optik kan ägnas åt ablation laser och försäkrar att inga optiska element behöver flyttas under en laser ablation session. En dikroiskt i mellanliggande modulen tillåter samtidig avbildning och laser ablation. Centrering laserstrålen to den utgående strålen från den fokuserade mikroskopet kondensor lins vägleder den inledande anpassning av systemet. En mängd olika linser används för att kondition och expandera laserstrålen för att fylla upp bländaren på utvalda objektiv. Slutlig anpassning och testning sker med en främre yta spegelglas skjuter mål. Laser strömmen justeras för att ge en minsta strålpunkt ablation (<1um). Ablation platsen är centrerad med finjusteringar av de sista kinematically monteras spegel för hårkors fastställs i bildbehandling fönster. Laser kraft för axotomy kommer att vara cirka 10 gånger högre än nödvändigt för minsta ablation plats på målet bilden (detta kan variera med det mål du använder). Maskar kan vara orörlig under laser axotomy och Time-lapse avbildning av montering på agaros kuddar (eller i mikroflödessystem kammare 4). Agarosen kuddar görs enkelt med 10% agaros i balanserad saltlösning smält i mikrovågsugn. En droppe av smält agaros är placerad på en glasplatta och tillplattat med en annanglasskiva i en rondell ca 200 um tjock (ett enda lager av tid tejp på angränsande bilder används som en spacer). En "Sharpie" cap används för att skära ut en uniformerad diameter rund pad av 13mm. Bedövning (1ul Muscimol 20mm) och Mikrosfärer (Chris Fang-Yen personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vatten) läggs till i mitten av plattan följt av 3-5 maskar orienterade så att de ligger på sin vänstra sida. Ett glas täckglas tillämpas och sedan vaselin används för att täta täckglas och förhindra avdunstning av provet.

Protocol

1. Byggandet av en laser ablation-system

Använd skyddsglasögon Lasersäkerhet och använda goda exempel laser säkerhet under den inledande anpassningen. Aldrig titta igenom okularen när lasern är på.

  1. Ordna komponenterna på bakbord enligt bild. 1 (se även exempel 2). Bolt ner laser (med ett riser platta om det behövs), periskop post och den upphöjda stöder järnväg.
  2. Placera din mikroskop för att anpassa med järnväg axeln. Rikta in sig med den vidarebefordrade ljusstrålen från mikroskopet kondensor lins. Rikta in skena höjd (använd en nivå) och position med en justerbar bländare eller en lins som fästs på järnväg. Bländaren eller objektivet måste anpassas i båda ändarna av skenan till kondensorn strålen. Lab-uttag kan hjälpa till med järnvägen höjdjustering.
  3. Rikta Glan-Thompson polarisator och halv-våg plattan laserstrålen. Du behöver inte lasern på att göra denna anpassning. The bEAM behöver bara gå igenom båda utan att slå sina kanter. Rotera polarisatorn att ge en praktisk orientering och position för balken dump (fig.1). Du kommer att rotera plattan halv våg justera lasereffekt. Säkra komponenter till bakbord.
  4. Sätt på lasern, ställ in pulsfrekvens till 100, kontinuerligt läge och minska strömmen till ett minimum med hjälp av halv-våg plattan. Använd en post-it lapp eller linspapper för att visualisera laserstrålen.
  5. Justera och fixera kinematically monterade speglar i följd från lasern för att få strålen upp till den spegel som är monterad i änden av den upphöjda järnvägen. Laserstrålen bör anpassas ungefär till mitten av speglarna. Speglarna bör inriktas ungefär 45 grader mot laserstrålen axeln (bild 1).
  6. Grovt justera kinematically monterad spegel ovanpå periskop och i änden av järnvägen för att anpassa laserstrålen till mitten av det ljus som strålar från mikroskopet. Både laserstrålen och than överförde ljusstråle från mikroskopet kan samtidigt visualiseras genom att sätta in papper i strålgången. Se till att alla ND filter och öppningar i intermediära modulen är ute eller helt öppet.
  7. Fint rikta laserstrålen till mitten av den utsända ljusstrålen med finjusteringar på toppen periskop och speglar järnväg. Håll papperet nära järnvägen spegeln och rikta laserstrålen till mitten av den utsända ljusstrålen med toppen periskop spegeln. Håll papperet nära mikroskop hamnen och rikta laserstrålen till mitten av den utsända ljusstrålen med de justeringar järnväg spegeln (fig.2).
  8. Placera en post-it lapp i strålgången mellan linje kondensorn objektivet och det öppna målet tornet. Du bör se det ljus som strålar med mindre laserstrålen nära centrum. Använd finjusteringar på skenan spegeln för att centrera laserstrålen. Fäst mikroskop på plats med klämmor.

Steg 1,9-1,12 Är valfria, men det är lätt och användbar för att bedöma anpassning och laser ablation innan du lägger strålen expanderar linser.

  1. Stäng av lasern och engagera den mekaniska säkerheten slutare. Rotera 50% dikroiskt ur strålgången. Även om inga direkta laserljus kommer att övergå till okularen kan det reflekterade ljuset vara ganska intensiv. Montera målet skjut för de fina anpassning och bild med 60X olja målet. Fokus på repor på bilden. Sätt i ND4 och ND8 filter i mellanliggande modul.
  2. Bild målet bilden med din CLSM, Spinning disk eller CCD-kamera-system. Rotera 50% dikroiskt in lasern vägen. Från denna punkt, bör du aldrig titta igenom okularen medan ablation lasern är på. Slå på ablation laser och ställa in läget för att utlösas, frekvens till 100, och puls nummer 10. Se till att strömmen fortfarande är inställd på minimum med halv-vågen plattan och sedan öppna den mekaniska säkerheten slutare. Du kan simultaneousmyg bild och använd ablation laser.
  3. Medan avbildning målet skjut, utlösa ablation laser. Kontrollera målet bilden för en ablation plats 1-10 um i diameter. Sekventiellt bort ND-filter till en ablation plats ses. Justera ablation plats till mitten av bilden med järnvägen spegel. Du kommer att vilja lägga tillbaka ett ND-filter för att få utrymme att fint öka lasereffekt med halv-våg plattan för att ge en <1 plats um ablation. Bild på 0,2 um / pixel eller lägre och finjustera ablation plats till bilden centrum (position 256.256 med 512X512 bild).
  4. Kontrollera djupet av fokus och axel laserstrålen. Fokus upp och ner 1-2 um och kolla ablation position och ablation strålpunkt. Om laserstrålen är axiellt linje ablation platsen inte kommer att röra sig. Det obetingade laserstrålen kommer att fördela kraften över flera um (ca 3-5 um från topp till botten i fokus).

2. Lägg linser för att expandera laserstråle för att fylla syftet tillbakabländare och justera konvergensen för att styra fokus

  1. Detta system använder dubbla galileiska balk expanders att expandera laserstrålen för att fylla på baksidan öppning objektiv (10 mm). Montera 4 linser på bärare och ansluta dem till järnväg (L1f1 + L2f2 och L3f1 '+ L4f2 "). Justera positioner så att alla objektiv är på samma optiska axeln och exakt vinkelrätt mot laserstrålen (Fig. 2).
  2. Sätt på lasern och anpassa den till minimal energiförbrukning och kontinuerligt läge. Ungefär justera ljushöjden genom varje lins med hjälp av papper för att se laserstrålen och överförs ljusstrålen från mikroskop kondensor. Stäng och slutartid lasern.
  3. Ta bort klämmorna från ena sidan av mikroskop och skjut mikroskop av laserstrålen vägen. Sätt på lasern och ta bort säkerheten slutare.
  4. Den fina anpassning av linser och laserstrålen kan utföras genom att visa den utökade laserstrålen på en närliggande vägg. Balken ska expandera och symmetriskt när lenses flyttas. Justera de två sista kinematically monterade speglar för att justera strålen (fig.3).
  5. Den linje och utökade balk profil ska vara rund och enhetlig ljusstyrka (fig.3). Storleken och enhetlighet i balken kan ses med en post-it lapp vid den beräknade positionen för målet tillbaka bländare.
  6. Strålen bör justeras till noll konvergens för oändligheten optiska system. Konvergens kan uppskattas genom att notera hur förändringarna strålen storlek som du flyttar en post-it lapp längre från linser. Stäng av lasern och engagera mekanisk slutare.
  7. Skjut mikroskop tillbaka in i laserstrålen banan med hjälp av fasta klämmor att fastställa den rätta inriktningen. Byt ut klämmorna på den fria sidan av mikroskop, men dra inte åt ner.
  8. Sätt på lasern och ta bort säkerheten slutaren. Rotera målet torn till ett öppet läge. Placera en post-it lapp på scenen. Du bör se ut och enhetligt laserstråle centrerad på ljus bEAM från kondensorn (fig. 4). Du kan behöva centrera den genom att lossa mikroskop klämmorna och försiktigt puffa på mikroskopet.
  9. Engagera säkerhet slutaren och ställa in lasern för att utlösa läge. Rotera 60X objektiv på plats och bilden ytan repor på målet bilden.
  10. Ta säkerheten slutaren, utlösa ablation laser och justera lasereffekten för minsta ablation plats. Ablation plats bör vara rund och inom 5-10 um i bilden centrum.
  11. Centrera ablation plats med finjustering av kinematically monterade järnväg spegel. Du måste iterativt justera skena och topp periskop spegel till både centrum ablation platsen och upprätthålla en enhetlig stråle profil.
  12. Utvärdera Z fokus lasern genom att flytta fokus systematiskt upp och ner i en um steg och utlöser ablation laser. Den utökade, anpassat, och konvergens justerat balk bör ablate maximalt på bilden fokus och svagt eller inte alls 1 um above eller under fokus (fig 5).
  13. Justera Z fokus för den utökade balken genom att flytta objektivet L3 av den galileiska kikaren (fig.2).

3. Laser axotomy och Time-lapse mikroskopi av Axon förnyelse

  1. Mikrovågsugn 10% agaros (RPI Molecular Biology Grade EMO 0,1 A20090) i balanserad saltlösning tills helt smält. Beläget på en värmeplatta för att hålla den smält under användning för montering.
  2. En droppe av smält agaros är placerad på en glasplatta och tillplattat med en annan glasplatta i en rondell ca 200 um tjock (ett enda lager av tid tejp på angränsande bilder används som en spacer).
  3. En "Sharpie" markör cap används för att skära ut en uniformerad diameter rund pad av 13mm.
  4. Bedövning (1ul Muscimol 20mm) och Mikrosfärer (Chris Fang-Yen, personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vatten) läggs till i mitten av plattan följt av 3-5 maskar orienterade så att de ligger på sin vänstra sida . Ett glas täckglas appliceras och sedan Vaseline används för att täta täckglas och förhindra avdunstning av provet (fig. 6).
  5. Ablation laser är anpassad till hårkors, som beskrivs ovan, i början av varje session. Engagera slutaren lasersäkerhet.
  6. Ta bort målet laseruppriktning och bild en monterad vuxna masken med en lämplig fluorescerande markör i målet nervceller. Bild axoner på ungefär samma förstoring (0,2 um / pixel eller högre förstoring) och placera i hårkorset (fig. 7).
  7. Öppna slutaren lasersäkerhet och utlösa ablation lasern medan avbildning. Utvärdera axonet efter utlöser laser och sakta öka lasereffekt tills axonet kapas. Du behöver ca 10X mer lasereffekt att skära axoner än att bilda en ablation plats på anpassning målet bilden (ca 1uJ / NS puls). Vi skär vanligen med 100 pulser på 2,5 kHz och makt satt till ca 0.27mW (genomsnittlig effekt mätt på prov med sammanhållen FieldMaxII wattmetern och laser inställd på kontinuerlig vid 2500 Hz). Ablationlasereffekt inställningen vara konsekvent för att skära axoner i framtida experiment (fig. 7).
  8. Ett framgångsrikt skära axon kommer att visa en paus på ca 0,5-1 um utan en förlust av ljusstyrka i två skär ändarna (fig. 7). En stor förlust av ljusstyrka eller ett stort gap (2-10 um) innebär ofta omfattande skador efter axonet genom en kavitation bubbla. Den proximala och distala axoner kommer att separera och bilda retraktion lökar under de kommande 30 minuter (fig. 8 och film).
  9. Jämvikta din monteras maskar med mikroskop scenen i 30 minuter innan inspelningstiden förfaller. Detta minimerar drift på grund av temperaturskillnader och agaros kontraktion.
  10. ) Time-lapse avbildning parametrar ställs in med hjälp av bildbehandlingsprogram i samband med ditt system. Vi brukar bild 10-20 Z steg (1um/step) på 0,1-0,2 um / pixel med hjälp av förstärkning, hål, skanna takt, och bildhantering laser inställningar makt för att minimera exponeringen och samtidigt ge den önskade rumslig upplösning. Provtagning intervaller är typiskaly 1-5 minuter över 15 timmar beroende på önskad temporala upplösning (fig. 8 och film).
  11. Time-lapse bilddata konverteras till filmer med NIS Elements eller ImageJ.

4. Representativa resultat:

Laser axotomy använder detta system är en tillförlitlig och rutin. Resultatet visas i figur 7 är typiska. Time-lapse avbildning av Axon förnyelse är mycket robust med detta protokoll. Vi skär rutinmässigt och bild upp till 5 axoner i 5 olika maskar på en enda bild med hjälp av en motordriven skede. Den enda begränsningen är den tid det tar att samla bilder av varje axonet, t ex om det tar 20 sekunder för att samla in en stack för ett axon då som mest kan du provsmaka 9 axoner (9 stackar) om du provtagningen var 180 sekunder. Exemplet som visas i figurerna 8 och 9 är ett bra representativt resultat. Ungefär 10% av experiment ger resultat av denna kvalitet. Resterande experiment ger bra data om förnyelse fenotypen, men är estetiskt unappealning på grund av små bilden darrar rörelser masken som i allmänhet börjar efter 5-8 timmar av immobilisering.

Figur 1
Figur 1 System Laser Ablation. Den 532 nm Nd: YAG laser är monterad på en stamledning tallriken för att få det till höjden på andra komponenter och skruvade i bakbord. (Optisk isolator är frivilligt och förmodligen inte behövs). Den Glan-Thompson polarisator och halv-våg plattan används för att fint styra lasern makt. De är i fint kalibrerade rotation fästen. Var försiktig inställning strålen soptipp. Hörnet spegel styr laserstrålen till den lägre periskop spegeln. Den övre periskop Spegeln styr balken till järnväg spegeln. Skenan är monterad på två stöds spö plattformar. Dubbla Galilean linser är knutna till glidande järnväg fästen. Observera den extra mellanliggande modul tillägnad ablation laser. Systemet kan göras mer kompakt genom att ta bort den optiska isolaTor och hörnet spegeln, och flytta lasern, Glan-Thompson polarisator och halv-våg plattan i bakkant breadboard.

Figur 2
Figur 2 Dubbla galileiska Conditioning linser används för att expandera 300 um TEMoo laserstråle till noll konvergens enhetlig 10 mm storlek. Ett labb jack placeras under en av de plattformar som håller rälsen. Detta hjälper till att justera skena höjd under inriktningen steg. Grovt justera skena höjd genom att montera L1 linsen till järnväg och med hjälp av kondensorn strålen som en anpassning guide. Justera järnvägen så att kondensorn strålen riktas till mitten av linsen i båda ändarna av skenan. Detta kommer att säkerställa att järnvägen är i linje parallell med den optiska axeln i mikroskop. Du kan behöva att först justera mikroskopet för att matcha den optiska axeln av skenan. Använd klämmor för att fixera positionen för mikroskop (se bild. 1). Ta bort the spårgående lins. Nu rikta laserstrålen till mitten av kondensorn balken i båda ändarna av skenan. Ett papper i strålens väg är ett bekvämt sätt att se båda balkarna samtidigt. Använd den översta periskopet spegeln för att anpassa laserstrålen till kondensorn balken nära den spårgående spegel. Använd skenemonterad spegeln för att anpassa laserstrålen till kondensorn balken vid den bortre änden av skenan (närmast mikroskop). Nu montera alla fyra objektiv på skenan så som visas i figuren. Längden på järnväg, brännvidd av linserna, och arrangemangen objektivet kommer att variera beroende på din mikroskop och fysiska inrättas. Kritiska parametrar är laserstrålen diameter och storleken på den bakre öppningen av det valda målet. Infinity optiska system kommer att fokusera en perfekt parallell laserstråle (noll konvergens). Avstånd mellan L1 och L2 ska vara summan av linserna brännvidder, F1 + F2, och avståndet mellan L3 och L4 motsvarande bör f1 '+ f2 ". Avståndet mellan the dubbel Galilean par är inte kritisk. Placering av L3 kan finjusteras för att styra strålen konvergens, <1mm justeringar kommer att behövas för att justera fokus på laser för att bildens fokus. Var noga med att ta bort alla objektiv, filter, bländare, etc. från de mellanliggande modul som kan finnas i strålens väg (eller vara medveten om vad de gör och anpassa ditt system därefter).

Figur 3
Figur 3 Anpassning av laserstrålen genom dubbla galileiska linser. Ta bort mikroskop klämmor från ena sidan av mikroskop så mikroskop kan flyttas ut ur strålgången, men de återstående klämmorna gör det möjligt för mikroskop för att vara exakt flyttas. Tänk lasersäkerhet. Se till att lasereffekten justeras till ett minimum med Glan-Thompson polarisationsfiltret. Sätt på lasern och se mönstret laserstrålen på väggen. Du kan hitta ett papper tejpat på väggen hjälper till att visa laserplats. Systematiskt justera placeringen av linser för att få en känsla för vad de gör på balken storlek och utseende. Du bör se någonting som ser ut som panel A, där en intensiv plats excentriskt ligger i en dimmer profil. Använd spårgående spegel för att justera den intensiva plats till centrum som visas i panelen B. Använd nu upp periskopet monteras spegel för att ge en enhetlig perifer profil. Om allt är åt rätt ska du nu hitta att flytta linserna gör att strålen kan expandera och symmetriskt. Flytta linser tillbaka till utgångslägen som visas i figur 2. Nu avlyssna strålen på ett avstånd av målet tillbaka bländare. Det bör vara runt, åtminstone stor nog att fylla din rygg bländare och en enhetlig ljusstyrka. Det är OK om den är större, så länge du har tillräckligt lasereffekt för din ablationer. Utvärdera konvergens genom att jämföra balk diameter på ett avstånd av målet tillbaka bländare och väggen. Beam diameter skavara lika för en nolla konvergens balk. Skala bar är 10mm.

Figur 4
Figur 4 Anpassningen av den utökade laserstrålen till kondensorn strålen. Shutter lasern och flytta mikroskopet tillbaka i banan av laserstrålen med klämmor som anpassning stannar. Slå på, rikta in och fokusera kondensorn strålen med hjälp av ett objektiv. Tejpa papper över okularen att hindra någon från att se det intensiva reflekterade laserljuset. Rotera målet torn till ett öppet läge. Lägg ett papper på scenen för att täppa till kondensorn strålen. Sätt på lasern på att kontinuerligt läge och ta bort den mekaniska säkerheten slutare. Du borde se några laserljus kommer dock mikroskopet. Lossa mikroskop klämmorna och försiktigt knuffa mikroskop för att rikta laserstrålen med kondensorn balken. Laserstrålen ska vara rund och enhetlig ljusstyrka. Det är ibland bra att anpassar sig efter typenst järnvägs-linser. Du ska kunna expandera och kontrakt laserstrålen jämnt Om inriktningen är korrekt. Du kan centrera kontrakterade laserstrålen till ett minimum centrerad kondensorn balk med spårgående spegel och sedan utöka den till önskad storlek. När du justera placeringen av den avtalade balk med järnväg spegeln, måste du justera om toppmonterade periskopet spegel för att upprätthålla en jämn ljusstyrka utökade balken. Om du inte kan få en rund centrerad laserstråle så måste du gå tillbaka till tidigare justering steg.

Figur 5
Figur 5 Center ablation plats och justera konvergensen laserstrålen för optimal fokus. Stäng och slutartid lasern. Ta bort papperet och montera speglade målet bilden (du kan också använda märkpenna bläck på ett täckglas som mål 2). Bild repor på spegelblank yta med 60X 1.4na olja objektiv) Nu bild av ytan med en konfokala eller CCD. Titta inte genom okularen medan lasern är på. Slå på och unshutter lasern. Ställ lasern att utlösa läge, lägsta makt och 100 Hz. Trigger ca 10 pulser. Du bör se en ablation plats på 1-5 um i diameter inom 10 um i mitten av vyn. Om du inte ser en ablation plats kan du öka lasern makten i 5-10% steg. När du har identifierat en ablation plats, centrera den till synfältet. Placera hårkorset på 256, 256 koordinater om du visar 512X512 bild. Om du justerar laserpunkt till centrum då det inte kommer att ändra läge med zoomning. Använd skenemonterad spegeln för att flytta ablation plats till centrum hårkorset. Omvärdera enhetligheten i laserstrålen genom att titta på balken med målet bort som beskrivs ovan i Figur 4. Justera strålen enhetlighet med de bästa periskopet monterad spegel. Upprepa utvärdering av ablation avistapositionen. Detta är iterativ ett process som bör upprepas tills ablation plats är centrerad och den utvidgade strålen är enhetlig. Om gjort rätt ablation plats kommer vara cirkulär som sett i ablation plats på Fokus i figuren. Nästa utvärdera fokus laserstråle i Z-axeln. Trigger lasern för att producera en ablation plats på ca 1 um i centrum. Nu flyttar bilden ungefär 5 um sidled och fokusera 1 um under ytan av målet bilden. Trigger lasern med samma laser inställningar som du använde för första ablation plats. Upprepa efter fokusering 1 um ovanför målet bilden. Om laserstrålen är fokuserad till bildens fokus så ska du se ett liknande mönster som visas i denna siffra. Den största ablation plats bör motsvara bilden fokus och fläckarna ablation ovan och nedan fokus bör få mindre symmetriskt. Justera objektivet L3 att anpassa fokalplan. Flytta objektivet L3 bort från mikroskopet kommer att göra strålen mer konvergerande och ablation plats kommer att närma sigmålet. Liten <1mm justeringar kommer att behövas nära fokus. Du är nu redo att skära axoner. Skala bar är 1 um.

Figur 6
Figur 6 Montering maskar för laser axotomy och time-lapse avbildning. Agaros 10% saltlösning värms tills helt smält. En liten droppe placeras på ett glas objektglas och sedan tillplattat med en annan bild för att bilda en plan fot. Tjockleken på plattan är satt med tejp på två intilliggande bilder. Dynan är tillåtet att sätta i ca 1 minut och sedan bilderna är separerade. En "Sharpie" Top används som en cookie cutter för att bilda en enhetlig storlek pad på ca 13mm. 1 ul 10 mM Muscimol och 1 ul av mikrosfärer läggs till i mitten av pad (Fang-Yen personlig kommunikation). Maskar läggs till 2 ul droppe och orienterade innan du sätter på glaset täckglas. Vaselin tillämpas sedan från en spruta (20-25 GA. Nål) till kanten av täckglaset att täta den.


Figur 7 Typiska resultat av laser axotomy i C. elegans. I A kan du se intakt axon strax före och efter laser axotomy. Gapet är normalt ca 0,5-1um. B visar laser axotomy av ett axon utan att skada en närbelägen axonet ca 1 um bort. Laser var satt till ca 10% effekt (0,3 mW genomsnitt 2500 Hz) och 100 pulser. Skala bar är 5 um.

Figur 8
Figur 8. Typiska vild typ L4 förnyelse. Detta är en tidsserie som visar ablation och Time-lapse inspelning av Axon förnyelse. Kort efter laser axotomy på 0 minuter kan du se indragning glödlampa. Med 138 minuter indragning lampa har dragit tillbaka sitt yttersta omfattning och nu börjat omforma. Sporadiska membran utbuktningar (mircospikes eller filopodia) kan ses längs axonet axeln (pilarna 138 och 324). Denrätt stubbe sträcker en välformad kompakt tillväxt konen på 360 minuter. På 414 minuter både stubbar har förlängt tillväxt kottar. Den initiala embryonala-like growth kottar blir dystrofa som de sträcker sig mot rygg nerv sladd (414, 519 och 597 minuter). Den dystrofa tillväxt koner stall kort i rygg nerv sladden (960 minuter). Pilspetsar påpeka proximala stubbe och kottar tillväxt. Pilarna pekar på membranet utbuktningar längs den proximala axonet axeln. Skala bar 20um.

Film 1. Film på vild typ Axon förnyelse. Denna film går längs med tidpunkter visas i Figur 8. Worms var monterade som beskrivs i protokollet och axoner var avbildade var tredje minut i ca 10 timmar. Z stackar (20 x 1um) togs vid varje tidpunkt och slås samman till enstaka bilder med högst projektion algoritm (NIS Elements). Klicka här för att se filmen.

Discussion

Det finns flera bra diskussioner med laser mikrokirurgi med olika lasersystem 3,5-11. Femtosekund IR-lasrar är den "gyllene standarden" för subcellulära laser ablation 12 och bekvämt om i samband med en avbildning anläggning, men de är ofta för dyrt för enskilda användare. Om du behöver en femtosecond IR-laser för avbildning ditt prov på grund av djupet i bildhantering då du kommer förmodligen behöva en för laser axotomy. Transparent vävnader med målet axoner inom 30-50 um av ytan är nog genomförbart med blå och gröna puls lasrar i 20 UJ / puls rad riktade genom en hög na nedsänkning lins. Det kommer att bli mer följdskador med nano och pico second lasrar jämfört med femtosecond laser, särskilt som djup ökar målet axonet. C. elegans är transparent och alla axoner är inom 20-30 um av ytan. Vi skär rutinmässigt motoriska axoner som ligger inom 5 um av ytan. Vi har också lätt att skära yxaons inom nerv ring som är ca 20 um från nagelbanden ytan. Vi fann gränsen för kapning axoner till ca 30-50 um genom diametern på en vuxen mask. Det är troligt att lasern ablation som beskrivs här skulle fungera bra med många olika preparat som passar kriterierna öppenhet och djup mål axoner. Ändå är det lite förvånande med tanke på de teoretiska fördelarna med femtosecond IR-laser, som nano-och pikosekund 355 nm och 532 nm lasrar utföra så bra för laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser inga skillnader i axonet förnyelse som svar på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm och femtosecond IR-lasrar.

Solid state 355 nm UV-lasrar är ungefär samma kostnad som 532 nm diod pumpas passivt Q-switchade solid state laser, men kräver antingen högre makter eller optik som effektivt passerar dessa kortare våglängder. De flesta optik är utformade för att fungera bra med synliga 400 -700 nm ljus. 355 nm lasrar skulle ge några fördelar 6 exempel minskad plasma tröskeln, mindre plats storlek, och en lång passning dikroisk skulle effektivt direkt 100% av ablation laser för att målet och tillåter samtidig avbildning av GFP utan förlust av prov signal. Blå 440 nm lasrar skulle behålla fördelarna med att arbeta med ett synligt ljus laser (bra prestanda med standard optik och säkerhet). Tyvärr är kostnaden för en DPP Q-switchade solid state 440 nm laser 3 gånger kostnaden för en 355nm eller 532 nm laser liknande effekt vid denna tid. Om vi skulle utforma ett nytt system för C. elegans, där målet djup är minimal, skulle vi välja en UV-transparent lins (kosta ungefär $ 3,000 för en 40X 1.3na olja objektiv med 50-70% transmittans vid 355nm) och en 355 nm laser som producerar 5-10 UJ / puls vid 1 -20 kHz.

Axon ablation tros bero på plasma bildas. Kortare pulser kommer att producera plasma gränsvärden på en lägre effekt och vilka volymer plasma w sjuk vara mindre 6. Målet är att producera den minsta och kortaste livslängd plasma genom att justera pulsenergi till den lägsta makten. Större långlivade plasmor kommer att generera kavitation bubblor som skadar omgivande celler. Vi har generellt funnit att ablation med ca 5-10 pulser på högsta frekvens (dvs 2.5kHz) ger bäst resultat. Detta tyder på att skador kan gradvis integreras över en serie av pulser för att bättre kontrollera omfattningen av skadorna. Lasern ablation som beskrivs här är mycket förlåtande om strålen är anpassad och utökad korrekt. Vi börjar skära axoner till vuxna maskar på 10% lasereffekt (genomsnitt 0,3 mW mäts vid 2500 Hz och uppskattningsvis 1 UJ / puls) och kan skära med begränsade lokala skador med 14% effekt. Du kan observera större områden av skador från 15 till 39% laser effekt, men endast över 40% effekt (ca 1 mW genomsnitt mätt vid 2500 Hz) inte maskarna explodera på grund av stora kavitation bubblor och skador på maskens nagelbanden.

e_content "> Den Steinmeyer et al. 2010 2 papper är en utmärkt resurs för att bygga ett system laser ablation. Leon Avery har även en fin praktisk beskrivning av en laser ablation system baserat på en billig N2 gas 337 nm laser och han ger några stora praktiska råd (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). När du utformar ditt eget system bör du först tala med din mikroskop representant för att avgöra hur man ska rikta ablation laser för mikroskop målet. Din mikroskop skall monteras på en vibrationsisolering bord (Newport, TMI, Thor). En bakbord toppen är optimal, men en massiv stål topp kan fortfarande användas med magnetiska lägesställare. En dedikerad mellanliggande modul på en upprätt omfattning är trevligt eftersom alla optiska element kan lämnas kvar på plats. Men det kan vara billigare och bekvämare att använda en kamera port (inverterad) eller en "combiner" som bifogas ett epi-fluorescerande port. Du behöver veta storleken på ryggen bländare och transmittans (på en blation laser våglängd) av objektiv du tänker använda. När du bestämmer dig för en laser (t.ex. Crylas, ÖSREGNA, Crystal, eller barnkonventionen) bör du kontakta Thor eller Newport för hjälp med att välja rätt optiska element, hårdvara och säkerhetsutrustning. Vi bestämde oss för en dubbel galileiska strålar Expander för att spara utrymme, men en enklare Keplerian Expander är ett alternativ (f2/f1 = expansionsfaktor). En anpassad balk expander kommer att vara den billigaste, men Newport, Thor, och flera av laser tillverkare erbjuder utmärkt kvalitet kommersiella balk expandrar. Vissa laser tillverkare erbjuder också manuella och elektroniskt styrda dämpare som kan vara kostnadseffektiv och utrymmessnål, men inte lika mångsidig som den Glan-Thompson polarisator och halv våg plattan. Du måste också bestämma hur man styr lasern. Du kan designa en LabView baserat styrsystem, använda ett kommersiellt TTL-generator, eller programvara som tillhandahålls av lasern företaget. Diskutera alternativen med den specifika laser tillverkaren.

tält "> Vi har lämnat en förteckning över den hårdvara vi använt endast som en allmän vägledning. Systemet beskrivs här kostar ca $ 15.000 när de läggs till våra befintliga Imaging System. Din lokala fysik avdelning kommer ofta någon som är villig att ge en praktisk introduktion till tryggt att arbeta med fri stråle laser.

Alternativa metoder för fixering och time lapse avbildning av C. elegans har nyligen beskrivits. 14

Felsökning

Den svåraste och kritiska steget är anpassning av den utvidgade centrerad balk till den optiska axeln i mikroskop. När du har strålen centrerad och expanderat genom Galiléen linser du ska arbeta hårt för att få det anpassat till inom 5 um av mikroskopet optiska axel Innan du använder Speglar som kan styra för den slutliga anpassningen till centrum. Överdriven användning av styrningen speglar för att justera strålen till mikroskop kommer att flytta bort axel genom strålenExpander. ANVÄNDA EXTREME VARNING du kan dämpa laserstrålen med lämpliga ND-filter och direkt visa profilen laserstrålen på ett reflekterande mål (framsidan spegel). Du kan lätt knuffa mikroskop för att exakt centrera balk i 60X objektiv synfältet (om det inte kan vara centrerad i upp / ned intervall du behöver justera rälsen höjd). Strålen profilen kan användas för att exakt justera mikroskopet optiska axeln för att ge en centrerad balk som är rund och "bloss" symmetriskt. En asymmetrisk flare är en indikation på att mikroskopet axeln inte är helt är i linje (eller tåg är inte nivå). Slutligen bör du justera L3 och se en jämn och symmetrisk expansion och kontraktion av strålen. Fokusera mikroskop exakt på målet ytan och sedan justera L3 att fokusera laserstrålen till den minsta fläck. Du bör nu hitta att laserstrålen är inom 5 um i mitten när avbildas via LSCM eller CCD-systemet och ablation platsen ligger inom1um av Z fokus.

Om du upptäcker att du är "blåser upp" maskar eller konsekvent generera stora kavitation bubblor för att klippa axoner ditt problem är förmodligen den fina anpassningen av ablation laser. Se till att den minsta (<500nm) ablation plats är lokaliserad till Z fokus (justera konvergensen med L3-objektiv) och XY-förvaltare plats (justera med förra kinematically monterad spegel).

Inriktning axoner närmare ytan kräver mindre lasereffekt. På samma sätt kommer mindre djur (L1 och L2) kräver mindre lasereffekt för axotomy jämfört med inriktning på samma axoner till vuxna.

Om din vildtyp axoner inte regenerera eller axoner blekmedel bör du försöka minska avbildning lasereffekt eller minska samplingsfrekvensen. Om dina maskar dör eller blir sjuka försök att minska procent agaros i steg om 1%. Kontrollera att du inte flyttar täckglas efter monteringen maskar eftersom detta kommer ofta få dem att dö när du använder höga percentage agarosen och mikrosfärer.

Om dina maskar spricka eller dör under ett tidsförlopp sessionen Det beror på: 1. Andel agarosen är för hög. 2. Skador på nagelbanden med ablation laser. 3. Förflyttning av täckglas efter montering. Om skador på nagelbanden är fel det påverkar endast monteras maskar som har riktat med ablation laser.

Om din mask rör sig för mycket under en time-lapse session försöka öka andelen agaros i 0,5% steg. Friska axoner friska maskar är alltid "aktiva" och visar en jämn fluorescens. Om du ser en plötslig minskning av fluorescens eller aktivitet masken är döende eller döda. Flera pärlstav eller fragmenterade axoner är ett säkert tecken på en döende eller döda mask.

Om du har problem att hålla din axoner i fokus under hela tiden förfaller sessionen det kan finnas flera olika problem. Kontrollera först din scen glida genom avbildning ett inert prov på en glasplatta under 10 hRS. Några mikrometer drift kan bero på termisk instabilitet, men större än 5 um är förmodligen på grund av mekaniska problem med din mikroskop. Problem med montering är vanligare. Låt din monteras maskar jämvikt med mikroskop scenen i 30 minuter innan din tid förfaller. Kontrollera att din vaselin tätningen inte läcka under din tid förfaller session.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av National Science Foundation, McKnight Endowment Fund for Neuroscience, den Christopher och Dana Reeve Foundation och Amerisure Charitable Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
535 nm Laser Crylas FDSS532Q3 (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers)
All optics and hardware (Thor offers comparable optics and hardware)
SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter Newport Corp. SS100-F2KN 2
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm Newport Corp. 10RP52-1 1
Rotation Stage, 1" Aperature Newport Corp. RSP-1T 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm Newport Corp. 10GL08AR.14 1
Polarizer Rotation Mount Newport Corp. RM25A 1
¼" spacer for 1" diameter post Newport Corp. PS-0.25 1
½" height, 1"diameter post Newport Corp. PS-0.5 1
Fork, 1" diameter post Newport Corp. PS-F 1
Beam Dump Newport Corp. PL15 1
Microscope Objective Lens Mount Newport Corp. LH-OBJ1 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm Newport Corp. 10Q20HE.2 4
SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole Newport Corp. SN100C-F 2
High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI Newport Corp. AJS100-0.5K 4
Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female Newport Corp. SS-1-B 2
Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 340-RC 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 1
Rail carrier for X26, square 40mm length Newport Corp. CN26-40 4
Steel Rail, 384mm (15") length Newport Corp. X26-384 1
Rod Platform for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 300-P 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 2
Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPC025AR.14 2
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX082AR.14 1
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX085AR.14 1
Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-0.5 2
Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-1 2
Microspheres 0.1um Polysciences, Inc. 00876
Agarose Research Products International Corp. A20090 EEO matters
Muscimol Sigma-Aldrich M1523

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  2. Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
  3. Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
  4. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
  5. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
  6. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
  7. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
  8. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
  9. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
  10. Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  11. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
  12. Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
  13. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
  14. Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
Konstruera en låg budget Laser Axotomy systemet studerar Axon Regeneration i<em> C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).More

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter