Summary
腸間膜動脈カスケードに子宮組織の自動移植によるマウスおよびラットにおける子宮内膜症の外科的誘導の説明。
Abstract
子宮内膜症は、その病因は不明のまま慢性、痛みを伴う病気です。さらに、子宮内膜症の治療は、腹腔鏡病変の除去、および/または痛みや不妊の症状の慢性的な医薬品管理を必要とすることができます。子宮内膜症に関連するコストは、米国で1年間あたり22億ドルと推定されている。この謎めいた病気の根底にあるメカニズムの理解を促進するために、動物モデルが採用されている。霊長類では、自発的に子宮内膜症を開発するため、霊長類モデルに最も近い女性の病気に似ています。齧歯類のモデルは、しかし、よりコスト効果と2すぐに利用できます。我々はここに記述するモデルは、腸の腸間膜（図1）への子宮組織の自家移転を伴いますし、最初のラット3で開発され、後でマウス4に転送されました。外科的に誘発された子宮内膜症の自家齧歯類モデルの目的は、模倣することです。女性の病気。我々と他の人は以前にマウスやラットの疾患5,6と女性で観察されたミラーをから子宮内膜症の病変で観察される遺伝子発現のパターンが示されている。マウスで手術を行うことの利点の一つは、利用可能なトランスジェニックマウス系統の豊富な子宮内膜症の確立と成長に重要な特定のコンポーネントの役割を決定する上で研究者を助けることができるということです。摘出したヒト子宮内膜断片は、免疫不全マウスの腹膜に導入されている別のモデルにも広く使用されていますが、子宮内膜症2,7に重要であると考えられている正常な免疫システムの不足によって制限されます。重要なのは、外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデルでは、免疫系8、ホルモン9,10および環境要因11,12が FERTで子宮内膜症だけでなく、子宮内膜症の影響をどのように影響するか研究するために使用されている汎用性の高いモデルです。ility 13と痛み14。
Protocol
1。ライブ動物手術のための計画
- 適切な承認が実験動物で動作するように受信されたことを確認してください。
- オーダーマウスとその新しい環境に順化の少なくとも一週間を許可する。
- 男性フェロモンへの曝露がない状態で収容された雌マウスは、サイクリング、ウィッテン効果15,16と呼ばれる現象を停止することができます。 5日ごとにメスのケージに転送尿に浸した男性のベッドをサイクリングマウスを保つために。また、オープントップケージが使用されている場合、定期的にサイクリング女性を保つために男性の二つのケージの間に女性のケージを置きます。
- そのマウスは（表1）、手術前に少なくとも1週間、毎日膣細胞診を分析することで17を循環していることを確認します。
- 複数のマウスからの膣スメアが収集できるように、スライドガラス上に8個のパーティションを作成するためにワックスの鉛筆を使用してください。
- スポイトを使って0.2から0.25 mLの生理食塩水または蒸留水で膣をフラッシュします。のであるスポイトで子宮頸刺激が偽妊娠を引き起こす可能性があるので、ちょうど膣口でスポイトを置くものをいい、ラベルにより表示。細胞の種類の分析用ガラススライド上に膣洗浄を置きます。スライドは、新鮮な読み取り（ウェット）あるいは固定の方法により、標準的な光顕微鏡17を使用して調べることができます。
- 成功した無菌手術に必要なすべての外科手術機器（材料の項を参照）18を清掃、収集し、滅菌する。
- PBSで鎮痛が0.2 mg / kgの最終的な投与量を提供するために無菌テクニックを使用するためのブプレノルフィン溶液を調製します。ブプレノルフィン溶液の濃度は、平均的な成人のC57BL / 6マウスは、約0.025キロとマウス0.15 mlを皮下注射の量を推し量ることもできると仮定して0.0333 mg / mlのはずです。ブプレノルフィンは、事前の準備やアリコートとして保存することができます。ブプレノルフィンは、DEAのライセンスや詳細なインベントリログを必要とするスケジュールIII規制薬物であることに注意してください。
- ペニシリン（100 U / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）で滅菌PBSを準備します。
- 誘導前15〜メスケージ72時間に尿に浸した男性のベッドを転送することにより、発情周期を同期させます。
2。生きている動物の手術のため外科領域を準備します
- 以前に18を説明するように外科領域を準備します。
- 電気バリカン、眼軟膏、および手術スクラブを設定することで、準備領域を準備します。
- 手術中、体温を維持するために外科領域で循環温水暖房パッドを配置することにより、外科領域を準備します。循環温水暖房パッド上に滅菌防水パッドを置きます。手術器具、縫合糸、滅菌ガラスシャーレ、生検パンチ、滅菌ガーゼ、創傷クリップや滅菌手術野での創傷クリップアプリケーターを手配する。
- 途中ウント循環温水暖房パッドを配置することによって、リカバリ領域を準備するERので、必要に応じてマウスは、熱から離れて移動できるように、空のケージ。
3。麻酔と手術のためにマウスを準備
- マウスの体重を記録して、膣細胞診を評価することによって、発情段階を決定する。
- 麻酔導入の場合は、空の麻酔チャンバー（イソフルランのためのポータルを含む固体の蓋付きの空のケージ）にマウスを置きます。イソフルラン非再呼吸麻酔システムの電源をオンにし、イソフルラン四パーセント（0.5〜1 L /分の酸素流量を持つ）に気化器を設定します。
- マウスは、麻酔下イソフルランコーンへの流れ（30〜60 mlの注射器のシース）と準備のテーブルの上に円錐の場所をマウスの鼻と口を切り替えているときに。適切な麻酔は手術（〜2.5から3.5パーセントイソフルラン）の残りの部分でイソフルランの低濃度で維持することができます。麻酔の適切な深さはつま先のピンチ刺激に対する否定的な応答によって決定されるべきである。
- 眼軟膏Tを適用するOは、手術中に目の乾燥を避けてください。
- 小さな電気バリカンを使用して、手術部位を削る。
- 消毒三クロルヘキシジンスクラブの交互スワイプや70％エタノールで手術サイトを準備する。
- 滅菌野で動物を羽織る。
4。子宮ライゲーション
- 膣開口の吻側1.0センチメートル - 小さいはさみまたは0.5を終了する外科用メスの刃のいずれかを使用して、小さな（〜1cm）を正中切開を加えます。
- ブレードは体壁と腹壁の間にあることなどの開口部に閉じたハサミを挿入します。静かにゆっくり腹壁を十分に皮膚から切り離されるようにハサミを開閉して切開周辺を解剖鈍らせる。切開部位周辺の腹壁と皮膚の間に残りの目に見える癒着は慎重にsnippedすることができます。十分に切開部位を解剖平滑に失敗すると、腹壁がより困難にクローズになります。
- 小さなfを使用してorceps、静かに左子宮角を見つけます。子宮は、最初の切開のサイトに入ると表示されるものである腸、背側です。一部のインスタンスでは、最初に卵巣と関連する卵巣の脂肪パッドを配置するのが最も簡単です。ゆっくりと子宮角に引き上げ、リトラクターとして機能するように、その下にある開いている鉗子をスライドさせます。必要に応じて、誘導で発情期（表1）関連情報については、この時点で卵巣と子宮の外観に注意してください。
- ゆっくりとストレッチ子宮角の下に5から0黒編みこみの絹縫合糸の二つ6〜8センチメートル片（針なし）をスライドさせます。
- しっかりと子宮tubualジャンクション（卵管にちょうど尾）で、それぞれの場所で本結びを用いて子宮頸部の接合部（子宮頸部にちょうど吻側）でホーンを連結する。一瞬のために縫合糸の両端を残す。
- twoライゲーションの間に子宮角の一部を切り取って滅菌ガラスシャーレコンタの組織を置くining〜ペニシリン（100 U / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ ml）を含むPBS100μLを。最後に絹縫合糸の両端をカット。縫合糸が緩んで来るか、出血がある場合は、切り株を見つけると、別の結び目を作る。
5。摘出した子宮から子宮内膜症インプラントを準備
- 摘出した子宮が操作されている間、滅菌ガーゼで腹部をカバーし、必要に応じて滅菌PBSを含むペニシリンとストレプトマイシンと水分を保持する。
- 脂肪の摘出した子宮角を剥がします。
- 必要に応じて、摘出した子宮角の重量を量る。
- 内腔に小さなハサミの一つブレード（14 mmのブレードの長さ）を挿入し、鉗子でホーンを押しながらゆっくりと子宮角の下ハサミをスライドさせて子宮角を開きます。
- ガラスシャーレに、三等しいサイズのインプラントをカットする2ミリメートル生検パンチを使用してください。
6。腹腔内に子宮内膜症インプラントを縫合
- 場所の滅菌すぐに切開部位と滅菌PBSを含むペニシリンとストレプトマイシンと完全にウェット上記eのガーゼ。
- 小さいと、滑らかな鉗子は、そっと盲腸を見つけて、小腸に沿って吻方移動。腸間膜動脈のカスケードがはっきり見えるように盲腸から少なくとも2つの動脈離れていると、事前接液ガーゼのファンのようにそれをアレンジ腸の小さい（4-5 cm）のセクションを引き出します。滅菌生理食塩水で常に腸の潤いを保つようにしてください。注：腸の処理中にネズミ歯鉗子を使用しないでください。
- 静かに腸から約0.5センチメートル動脈一つインプラントを縫合するカッティング針を逆に、P - 1、11ミリメートル、3 / 8円で6から0黒ethilonの縫合糸を使用してください。
- 注：腸の腸間膜は腹膜の薄層によって覆われている。動脈周囲に縫合するときにこの層を介してきれいなパスを作成するように注意してください。腹膜または破裂を引き裂くしないようにゆっくりと注意深くを通して縫合糸を引いて動脈。
- そうすることが血流と腸と死のその後の壊死が失われる可能性があるとして1つの完全な2ノットは、非常に難しい縫合糸を締めるように注意しながら、それぞれを投げる。インプラントの2 mm以内に縫合糸をトリム。ウェット腸は再び次のインプラントに移動する前に水分補給を維持し続けるために。
- 吻側方向に動いて、腸の次の3〜4センチメートルを引き出して、ゆっくりと、すでにインプラントを含むセクションを置き換えます。以前のインプラントのサイトから1つまたは2つの動脈をスキップし、次のインプラントを縫合。第三インプラントのために繰り返します。
- 腹腔内に腸のすべてを置き換えます。
7。偽手術
- 偽手術はない組織が腸の腸間膜に縫合されていないことを除いて子宮内膜症の手術と同じ手順を使用して実行されます。
- ステップ4のように消費税の左子宮角。
- 子宮内膜症インプラント（ステップ5）が疑似手術に用意されていません。市販必要に応じて摘出した子宮角は破棄または他の目的に使用することができます。
- 縫合糸、ない組織は、ステップ6のように腸間膜動脈カスケードの3つの動脈の周囲に配置されています。
8。手術創を閉じる
- 臓器のすべてが彼らの解剖学的位置にほぼ戻っていることを確認してください。
- 腹壁を閉じるには、非連動の連続ステッチを,5 - 0コーティングvicryl縫合糸を使用してください。
- 皮膚を閉じるには、9mmの創傷クリップを使用してください。
9。動物を回復する
- は0.2 mg / kgの用量のための皮下注射により0.15 ml/25 gのマウスで0.33 mg / mlのブプレノルフィンを投与する。ブプレノルフィンは、回復プロセスを延ばすことができる、さらに心血管系/呼吸抑制を防ぐために手術後に投与される。
- それは手術中に濡れ得ている場合に優しくキムワイプまたはペーパータオルでマウスを乾かします。
- ケージpのダウン場所の動物腹側artially動物が回復され、胸骨の横臥位を（麻酔がすぐに切れる吸入剤として5分以内）取り戻すまで、循環温水のパッドの上。
10。術後ケア
- 彼らは手術の後の彼らの正常な動作を取り戻すまで、毎時胸骨の横臥位を維持できるようになるまでマウスは15分ごとに観察する必要があります。
- マウスは、手術の24時間以内に正常に表示されます。マウスは、回復と健康の徴候のための7〜10日のために毎日監視する必要があります。
- 動物は、貧しい人々の健康、痛み、または苦痛になっているとの指摘が活動低下、自傷、ungroomed外観、または猫背の姿勢が含まれています。
- 動物は手術後24時間以内に良好な健康状態にあると表示されない場合は、ブプレノルフィン（0.2 mg / kg）を投与または動物を安楽死させるのどちらか。動物は、動物のshoul補足ブプレノルフィンの投与8時間以内に改善されない場合腸管壊死の可能性があるとしてD安楽死される。
- 7〜10日後の誘導創傷クリップを取り外します。
- 実験の期間中、膣細胞診の検査で性周期を監視し続ける。ステップ1.3で説明したように雌のケージに尿に浸した男性のベッドを移すことによって72時間前にコレクションに発情周期を同期させます。
11。剖検と組織の切除
- 剖検のタイミングは、特定の研究課題に依存し、さらに代表的な結果および考察で説明しています。
- 二酸化炭素の窒息によりマウスを安楽死させる。
- （必要に応じて）1cc注射器に23ゲージの針を用いて心臓穿刺により血液を採取します。
- コレクション17の時に発情期の段階を決定するために前述のように膣細胞診塗抹標本を収集する。
- 子宮卵管接合部で、残りの子宮角を切り取り、子宮頸部では、として、脂肪を取る重さ、およびプロセス（11.14と11.15を参照）が望ましい。
- 子宮内膜症病変の周囲に黒い糸を探します。必要に応じて、無傷の子宮内膜症病変を撮影。
- 慎重に病変ではないランスに注意して、小さなはさみや鉗子で子宮内膜症病変周囲の癒着を細かく分析。 RNA分解を防ぐために迅速かつ慎重に作業。
- ノギスを用いて子宮内膜症病変の長さと幅を測定し記録する。
- 消費税ペーパータオル上で子宮内膜症病変と場所は、PBSで湿らせた。病変から非子宮内膜組織を削除します。解剖顕微鏡またはルーペガラスのスタンドは、解剖を支援するために使用することができます。
- 縫合糸を除去する前に子宮内膜症病変を満たした3つの流体を秤量する。
- ゆっくりと子宮内膜症病変から縫合糸を取り除く。
- 組織学のために、ホルマリン固定つの流体は、3つ30分PBSの洗浄と最終的なストレージIに続いて2時間の子宮内膜症病変を埋めnの70％エタノール。脱水とパラフィンが埋め込む。
- 子宮内膜症病変のランス2つの。再びこれらを秤量する。周期的なホルモンの変化は嚢胞液の量を変えることができるので、これは嚢胞の重量を加えたとして11.10の測定流体に加えて、組織湿重量の尺度を与える。
- RNAの単離と遺伝子発現の研究のために、直ちに-80℃で溶解結合ソリューションとストア内のlanced子宮内膜症病変（または〜20μgの子宮組織）の一つ° C RNAqueousキット（Ambion社）またはその他の方法による将来のRNAの分離用としての均質化望ましい。
- RNA、DNA、またはタンパク質の将来の分離には、直ちに第二lanced子宮内膜症病変をスナップ凍結（または〜20μgの子宮組織）-80℃の液体窒素とストア内の℃の
代表的な結果
外科的に誘発される子宮内膜症のマウスモデルにおける子宮内膜症病変が形態学的および組織学的に観察されたものと似ている女性。女性やマウスモデルの両方で子宮内膜症の組織学的分析は、子宮内膜症病変が子宮内膜腺と間質（図2A）が含まれていることを示しています。マウスの子宮内膜症の病変は、女性の子宮内膜症の一般的な特徴（図2B）19であるヘモジデリンを含んだマクロファージが、含まれています。
マウスから削除子宮内膜症の病変は、3日後の誘導は、（図3A）炎症と出血が表示されます。マウスモデルにおける成長子宮内膜症病変の2〜4週間後に嚢胞様、流体腹膜癒着によって満たさと囲まれたが（図3Bおよび3C）です。誘導で病変の重量と比較すると、流体満たされた病変は、306％と862パーセントいずれかで大きく、二ヶ月後の誘導とlanced病変であった（図4Aおよび4B）はそれぞれ、51％および172％拡大した。我々は、5種類の実験（図5）を介して誘導後一ヶ月でいっぱいにし、子宮内膜症病変の重みをlanced一貫性のある流体を取得している。一ヶ月後の時生産流体封入（7.44 ± 3.75 mg）およびlanced（2.92 ± 1.23 mg）の子宮内膜症病変の重量が有意に（ピアソンの相関係数= 0.669、P <0.001）に相関していた。
マウスの年齢は生後3〜10ヶ月の間にマウスの病変のサイズに影響を与えなかった。どちらも一ヶ月で埋めたり、子宮内膜症病変の重量をlanced流体は、誘導後は、大幅に動物の年齢と相関していない（R = -0.136、P = 0.380 と r = -0.063、P = 0.698、それぞれ）。れました
マウスの子宮は発情周期におけるステロイドホルモンの影響により、サイズの変化、体液貯留、細胞増殖と外観を受ける。我々は、さまざまな発情期の段階で動物からの残りの無傷の子宮角の重量に子宮内膜症病変の重量を比較した。我々は、子宮内膜症のlを埋めたり、lanced子宮重量と流体の間に有意な相関関係を見つけることができませんでした一ヶ月後の誘導（ それぞれ r = -0.046、P = 0.765 と r = 0.232、P = 0.155、）でesionの重量。
マウスの子宮内膜症病変で観察される遺伝子発現のパターンは、密接に病5と女性で報告されたミラーリングします。 3日間、細胞外マトリックスのリモデリング、細胞接着、および血管新生を制御する誘導後の遺伝子は非常にアップレギュレートされ、これらの遺伝子の多くは、成長の一ヶ月を通してアップレギュレートされたまま。
図と表
図1マウスのautologus子宮組織の転送による子宮内膜症の外科的誘導。左子宮角は、結紮切除し、そして子宮内膜を露出させる縦方向に開かれます。 3つの2 MM 2生検が用意され、それぞれが腸mesenteの動脈カスケードの動脈に縫合されRY。一ヶ月後の誘導により、子宮内膜症の病変は、流体の癒着によって充填し、囲まれています。
図2一ヶ月後の誘導における子宮内膜症のマウスモデルから子宮内膜病変のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片がデモ（）子宮内膜腺との存在間質;。スケールバー=50μmであり、（B）ヘモジデリンを含んだマクロファージ、矢印で示されているそのうちのいくつか、スケールバー=20μmである。
図3。安楽死以下のマウスモデルにおける子宮内膜症病変、どちらかの三日後の誘導（A）または一ヶ月後の誘導（BおよびC）。
図4手術ENを持つように誘導したマウスから子宮内膜症の病変dometriosisは、1つまたは2つヶ月後の誘導で摘出し、秤量した。データは平均値± SEM。データが変換されたログインして、別の文字には、片側フィッシャーの最小有意差のプログラムによって複数の比較が続く一方向ANOVAによる各パネル内の重要性を示していた。子宮内膜症病変を（それぞれN = 10、誘導のための7または5、一ヶ月、または2ヵ月後の誘導、）満たされた流体、のような（）嚢胞。 （B）Lanced子宮内膜症病変（それぞれN = 10、誘導のための8または7、一ヶ月か2ヶ月後の誘導が）。
図5。流体による病変湿重量子宮内膜症と5つの別々の実験から一ヶ月後の誘導でlanced。データは平均値± SEM。マウスN = 10、6、8、7、流体充填した病変と0、7、7、10、8、それぞれ実験1、2、3、4、5、のlanced病変は8。
表1。膣細胞診と卵巣、子宮および誘導の外観により、発情期の観察。
卵巣と子宮の外観は、時間依存になります。以下は、各サイクルの日の朝8:00前後の犠牲に基づいています。さらに、観測は主観的であり、卵巣と子宮角を比較するだけ子宮角よりも良い推定値になります。これらの観察は、毎日の膣細胞診の測定値から得られた情報を補足することを目的としています。
表2。マウスとラットの手術の比較。
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Discussion
マウスの子宮内膜症の外科的誘導を実行中に注意すべきいくつかの重要なパラメータがあります。最初に、子宮内膜症はエストロゲン依存性疾患であり、そのようなこの手術としてインタクトな動物で、あるいはエストロゲン20で補足した卵巣摘出動物で実行する必要があります。第二に、動脈カスケードに子宮内膜生検を縫合は、細心の注意を払って行う必要があります。我々は1つで2つだけの比較的緩い結び目を使用すると、腸とそれに続く組織の壊死や動物の死への血液供給のライゲーションを防止しながら、それぞれの場所で生検を保持投げることを発見した。我々は強く縫合が確実に十分な組織が失われていないことに置かれるように実際の実験に先立っていくつかのマウスの練習をお勧めしますが、腸の壊死を引き起こすとして、あまりにもタイトではない。第三に、それはの中に滅菌PBSを含むペニシリンとストレプトマイシンと腸の組織が水分を保つことが非常に重要です。urgery。第四に、努力が子宮内膜症インプラントのサイズに一貫性があることを確認することも必要となります。この効果に我々は、生検パンチが摘出した子宮組織から一貫してサイズの子宮内膜症インプラントを作成するには、2 mmを使用してください。
個々のニーズと研究者の科学的な質問を合わせて、このプロトコルに作ることができるいくつかの変更があります。動物のホルモンプロファイルに1つの潜在的な変更が関連する。子宮内膜症病変における遺伝子やタンパク質発現、残りの無傷の子宮角と免疫システムは、直接発情周期のステージに関連して収集のタイミングによって影響されることがあります。コレクションの時に発情期の段階の制御にはいくつかのアプローチ、独自の長所と短所があり、各。例えば、無傷の、サイクリングの動物は、前の動物が手術induなるような誘導やコレクションに女性のケージに尿に浸した男性寝具三日間を転送することにより同期させることができますCEDと同じ発情期のステージ15で収集。そのままサイクリングの動物が使用されている場合は、性周期は膣細胞診17の検査で毎日監視する必要があります。これは、より生理学的に妥当であるという利点がありますが、サイクルの同期性を達成することは100％成功ではありません。また、インタクトな動物は外因性のゴナドトロピン投与21,22によって同期させることができる。多少より正確な一方で、この方法は通常よりも高いエストロゲンレベルを作成します。もう一つのアプローチは、動物をovariectomizeとシラカプセル、ミニ浸透圧ポンプ、または毎日注射4,8のいずれかを介して外因性のホルモンの一定レベルをお返ししてきました。このメソッドは、多くの動物で均一なホルモンプロファイルを得るという利点がありますが、動物はサイクリングではないので不利である。
偽手術は効果が効果attributab対手術を受けての結果であるか評価するために行うことができます。子宮内膜症へル。偽手術で左の子宮角が除去され、縫合糸は、腸の腸間膜の動脈カスケードで動脈の周囲に配置されますがない子宮内膜症インプラントは5,8,23を縫合されていません。また、摘出した子宮角から削除脂肪は、腸の腸間膜3,14に縫合することができます。我々は最近、偽の子宮と外科的子宮内膜症5を持つように誘導される動物から無傷の残りの子宮角の間にcDNAマイクロアレイによって測定される遺伝子発現の比較的少数の違いがあることを報告した。さらに、七子宮内膜症関連遺伝子のために定量的リアルタイムPCRを用いて、我々はその唯一のハプトグロビンの式は偽と子宮内膜症のマウスの子宮で大きく異なることがわかった。 Leeら。しかし、偽のコントロール23に比べて子宮内膜症を持って誘導したマウスから子宮内の5つの遺伝子の差次的発現を報告した。これは子宮内膜症lesioの存在を示唆しているnsはeutopic子宮内遺伝子発現を引き起こす可能性があります。
外科的に子宮内膜症を持って誘導されるマウスの収集のタイミングは、特定の研究課題によって決定されるべきである。マウス三日後の誘導のコレクションは1つが、以前に8報告されているように、最初の好中球とmachrophageの浸潤とサイトカイン産生を含む子宮内膜症の設立に重要な、初期の事象を評価することができます。我々は、子宮内膜症病変が三日後の誘導がhemorraghic、小さい、と大幅に残っている子宮角4〜相対的遺伝子発現を変更している。収集したことが示されている二週間前まで誘導後子宮内膜症病変は十分に確立されており、しばしば嚢胞様構造を形成している。マウスでは、子宮内膜症の病変は、塗りつぶされた流体の重量によって評価し、長さ、幅及びheigによって決定される病変の容積によって病変（図4）と同様のlanced、サイズが増加し続けるHTの測定は二ヶ月後の誘導〜9。
前述のように、子宮内膜症の外科的モデルは、最初にラットで開発され、現在も広く3を使用されています。ラットではこの手術を行うときに我々は、表2にまとめた、プロトコルに次の変更を行います。ラットでは、使用される縫合糸のすべては、4から0までのサイズですと、より密接にする必要があることができる。さらに、我々は腹腔内の腸の腸間膜に6 5ミリメートル2子宮内膜症インプラントを縫合。
このプロトコルでは、イソフルラン吸入麻酔薬の使用を説明します。また、組み合わせて注射麻酔は、ケタミンとDomitor構成（メデトミジン塩酸塩）または回復時間が若干長くなるものの、別のα- 2作動薬は、使用することができます。 intraperiotneal注射で75 mg / kgで投与したケタミンは、プロパティの軽減最小限の急性の痛みを持つ解離性麻酔薬です。NDは、DEAのライセンスや詳細な薬剤の在庫を必要とするスケジュールIIIの薬物である。に1 mg / kgで投与Domitorは、、α- 2アドレナリン受容体アゴニストであり、容易にAntisedan（atipamezole塩酸塩）投与で逆になります。 Domitorは、筋肉の弛緩と痛みの緩和を提供する鎮静剤です。 Domitorとケタミンは無菌操作を用いてPBSで組み合わせて事前に準備しておくことができる。 Antisedan、Domitorのための反転エージェントは、ブプレノルフィンとの組み合わせでPBS中で調製することができると手術後に1 mg / kgで投与する必要があります。ブプレノルフィンはまた、スケジュールIIIの薬物であり、選択肢は、非ステロイド系抗炎症剤banamine（フルニキシンメグルミン）およびケトプロフェンが含まれています。
すべてのモデルと同様にげっ歯類の子宮内膜症の外科的誘導に関連する一定の制限があります。何よりもげっ歯類は、月経周期を持っていないため、自発的に子宮内膜症を発症しないということです。げっ歯類のMODを作るための努力に一部の研究者が直接24,25を縫合せずに腹腔内に同系の動物から自己または相同子宮組織のフラグメントを挿入することを選択した人間の条件に、より生理学的に類似したエル。マウスでは、注入された組織は、嚢胞のような子宮内膜症病変を形成しているしかし、誘導の注入法は、組織が 腹腔3に添付し、侵入に失敗したとして、ラットで動作するようには思えない。
齧歯類のモデルは広範囲に病因、病理学、および子宮内膜症2,8,26-29のリスク要因だけでなく、新規な治療14,30-34を探索するを研究するために使用されています。外科的に誘発される子宮内膜症の齧歯類のモデルは、低受精率と繁殖能力と変異遺伝子およびタンパク質発現5,6,35,36など、ヒトの疾患に多くの類似点を、示しています。外科的induの齧歯類モデル、それらの比較的低いコストと入手が容易で、一緒になってCED子宮内膜症は女性の子宮内膜症のための優れたモデルです。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
最適化で、その支援のためのこの原稿の批判的検討のためのクリスKassotisとオードリーベイリーへと博士スコットKorte、ジョセフBeeman、アリソンCurfman、ポールキンボール、ブリジットNeibreggue、ヤコブレーデル、エイミーシュローダー、マイヤスタインバーグ、とステイシーWinkelerに感謝我々の研究室では、このモデルの。資金は、臨床Biodetectivesトレーニンググラント（NIH T90）（KEP）、ミズーリ州のライフサイエンスの大学や研究機会プログラム、MU研究評議会、MU研究会助成金およびNIH R21HD056441（SCN）によって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R.
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C.
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N.
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
