Summary
En beskrivning av den kirurgiska induktion av endometrios hos möss och råttor genom auto-transplantation av livmoder vävnad till arteriell kaskad av intestinal tarmkäx.
Abstract
Endometrios är en kronisk, smärtsam sjukdom vars etiologi är okänd. Dessutom kan behandling av endometrios kräver laparoskopisk borttagande av lesioner, och / eller kronisk farmaceutisk hantering av smärta och symtom infertilitet. Kostnaden i samband med endometrios har uppskattats till 22 miljarder dollar per år i USA 1. För att ytterligare vår förståelse av mekanismerna bakom denna gåtfulla sjukdomen, har djurmodeller använts. Primater utvecklas spontant endometrios och därför primater modeller mest liknar sjukdomen hos kvinnor. Gnagarmodeller är dock mer kostnadseffektiva och tillgängliga 2. Den modell som vi beskriver här innebär ett autologt överföring av livmodern vävnad till tarmen tarmkäxet (figur 1) och utvecklades först hos råtta 3 och senare överfördes till musen 4. Målet med autologa gnagare modell av kirurgiskt inducerad endometrios är att efterliknasjukdomen hos kvinnor. Vi och andra har tidigare visat att den förändrade genuttryck mönster som observerats i endometriotic lesioner från möss eller råttor speglar som observerats hos kvinnor med sjukdomen 5,6. En fördel med att utföra operationen i musen är att överflödet av transgena musstammar tillgänglig kan hjälpa forskarna att avgöra betydelsen av specifika komponenter viktigt i etablering och tillväxt av endometrios. Ett alternativ modell där exciderade humana endometriet fragment införs till bukhinnan med nedsatt immunförsvar möss används också ofta, men begränsas av bristen på ett normalt immunförsvar som tros vara viktiga för endometrios 2,7. Viktigt är musmodell av kirurgiskt inducerad endometrios en mångsidig modell som har använts för att studera hur immunsystemet 8, hormoner 9,10 och miljömässiga faktorer 11,12 påverkar endometrios samt effekterna av endometrios på Fertbilitet 13 och smärta 14.
Protocol
1. Planering för levande djur kirurgi
- Se till att lämpliga har fått klartecken att arbeta med försöksdjur.
- För möss och att minst en veckas acklimatisering till sin nya miljö.
- Honmöss inrymt i avsaknad av exponering för manliga feromoner kan sluta cykla, som ett fenomen som Whitten effekt 15,16. För att hålla möss cykling överföra urin-indränkt manliga sängkläder till den kvinnliga buren var femte dag. Alternativt, om öppna upp burar används, placera den kvinnliga buren mellan två burar av män för att hålla honorna cykla regelbundet.
- Se till att möss är cykling genom analys av vaginal cytologi dagligen i minst en vecka före operation (tabell 1) 17.
- Använd ett vax penna för att skapa åtta partitioner på en glasplatta så att vaginala utstryk från flera möss kan samlas in.
- Spola slidan med 0,2-0,25 ml fysiologisk koksaltlösning eller destillerat vatten med en pipett. Var sure att placera pipetten precis vid vaginala öppningen, som livmoderhalscancer stimulering med pipetten kan orsaka pseudopregnancy. Placera vaginal lavage på glaset bilden för analys av celltyper. Slides kan läsas färska (våt) eller alternativt som fastställts genom ett antal metoder och undersöks med en standard ljusmikroskop 17.
- Samla, rengöra och sterilisera all nödvändig kirurgisk utrustning för en lyckad aseptisk operation (se Material §) 18.
- Förbered buprenorfin lösning för smärtlindring i PBS med steril teknik för att leverera 0,2 mg / kg sista dosen. Koncentrationen av buprenorfin lösning bör 0,0333 mg / ml, förutsatt att den genomsnittliga vuxna C57BL / 6 mus väger ca 0,025 kg och en subkutan injektion volym av 0,15 ml per mus. Buprenorfin kan förberedas i förväg och lagras som alikvoter. Observera att buprenorfin är en förteckning III kontrollerat ämne som kräver en DEA licens och detaljerad inventering logga.
- Förbered sterila PBS med penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 mikrogram / ml).
- Synkronisera estrus cykler genom överföring av urin-indränkt manliga sängkläder till den kvinnliga burarna 72 timmar före induktion 15.
2. Förbered kirurgiska för levande djur operation
- Förbered operationsområdet som tidigare beskrivits 18.
- Förbered förberedelserna området genom att fastställa elklipper, oftalmologiska salva, och kirurgiska buskmarker.
- Förbered operationsområdet genom att placera ett recirkulerande hett pad uppvärmning av vatten på den kirurgiska området för att upprätthålla kroppstemperaturen under hela operationen. Placera en steril vattentät pad under de cirkulerande varmvatten värmedyna. Ordna kirurgiska instrument, suturer, sterila glas petriskål, biopsi punsch, steril gasbinda, klipp sår och sår klipp applikator på den sterila kirurgiska området.
- Förbered uppvakningsavdelning genom att placera recirkulerande grytlappar uppvärmning av vatten halvvägs undER en tom bur så att mössen att flytta bort från värmen om så önskas.
3. Bedöva och förbereda musen för kirurgi
- Notera vikten av musen och bestämma estrus skede genom att utvärdera vaginal cytologi.
- För induktion av anestesi, placera musen i en tom narkos kammare (tom bur med fast lock som innehåller portal för isofluran). Slå på isofluran icke-återandningssystem narkos system och ställa in förångaren till 4% isofluran (med en syre flöde på 0,5 till 1 l / min).
- När musen är under narkos växla isofluran flöde till en kona (30-60 ml spruta slida) och placera musen näsa och mun i konen på förberedelser bord. Adekvat anestesi kan upprätthållas med en lägre koncentration av isofluran under resten av operationen (~ 2,5-3,5% isofluran). Tillräckligt djup anestesi bör avgöras av ett nekande svar på tå nypa stimulans.
- Applicera t oftalmologiska salvao undvika uttorkning av ögon under operation.
- Använda små elektriska hårklippningsmaskiner, raka operationsstället.
- Desinficera och förbereda operationen platsen med tre växlande swipes av klorhexidin skrubba och 70% etanol.
- Drape djur med ett sterilt område.
4. Uterine ligering
- Gör en liten (~ 1 cm) mittlinje snitt med antingen en liten sax eller skalpell blad slutade 0,5 till 1,0 cm rostralt om slidöppningen.
- Sätt stängt sax i öppningen så att bladen är mellan kroppen väggen och bukvägg. Försiktigt trubbigt dissekera området runt snittet genom att långsamt öppna och stänga saxen så att bukväggen är tillräckligt avskild från huden. Är synligt sammanväxningar mellan bukväggen och huden runt snittet webbplatsen kan noggrant klippt. Att inte tillräckligt trubbigt dissekera snittet webbplatsen kommer att stänga bukväggen svårare.
- Med små forceps försiktigt lokalisera den vänstra livmodern horn. Livmodern är dorsala till tarmen, vilket är vad man ser vid den första in i snitt webbplatsen. I vissa fall är det enklast att först lokalisera äggstocken och tillhörande äggstockarna fett pad. Dra försiktigt upp på livmodern horn och skjut en öppen pincett under den för att fungera som ett upprullningsdon. Om så önskas, observera utseendet av äggstockarna och livmodern vid denna tid för ytterligare information om estrus scenen på induktion (tabell 1).
- Försiktigt två 6-8 cm bitar 5-0 svart flätat silke sutur (utan nål) under sträckte livmodern horn.
- Säkert ligate hornet vid utero-tubual korsningen (bara caudal till äggledaren) och på utero-cervical junction (bara rostralt till livmoderhalsen) med en fyrkant knut på varje plats. Låt ändarna av sutur för tillfället.
- Klipp ut den del av livmodern horn mellan de två ligations och placera vävnaden i ett sterilt glas petriskål contaansvara för prövningen ~ 100 mikroliter av PBS som innehåller penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 mikrogram / ml). Skär ändarna av siden sutur sista. Om sutur lossnar eller det blöder, hitta stubben och knyt en knut.
5. Förbered endometriotic implantat från exciderad livmodern
- Medan exciderad livmodern är manipuleras, täcka buken med steril gasbinda och upprätthålla vätskebalansen med steril PBS innehållande penicillin och streptomycin som behövs.
- Skala censurerade livmodern horn fett.
- Om så önskas, väg exciderad livmodern horn.
- Öppna livmodern horn genom att sätta en kniv i en liten sax (14 mm bladlängd) i lumen och försiktigt skjuta saxen ner livmodern hornet medan du håller horn med pincett.
- I glaset petriskål, använd ett 2 mm biopsi punch att skära ut tre lika stora implantat.
6. Suturering endometriotic implantat i bukhålan
- Placera sterile gasväv omedelbart ovanför snittet webbplatsen och genomblött med steril PBS innehållande penicillin och streptomycin.
- Med små, smidiga pincett hitta försiktigt blindtarmen och flytta rostrally längs tunntarmen. Dra ut en liten (4-5 cm) del av tarmen som är minst två artärer från blindtarmen och ordna det som en fläkt på förhand fuktade gasväv så att arteriell kaskad av intestinal krös syns tydligt. Se till att hålla tarmen fuktig hela tiden med steril koksaltlösning. OBS: Använd inte råtta-tandad pincetten vid hantering av tarmen.
- Använd 6-0 svart ethilon sutur med en P-1, 11 mm, 3 / 8 cirkel, omvänd skärande nål för att försiktigt sutur ett implantat till en artär ca 0,5 cm från tarmen.
- Obs: intestinal tarmkäx är täckt av ett tunt lager av bukhinnan. Var noga med att göra en ren passerar detta skikt medan suturering runt artären. Dra sutur genom långsamt och försiktigt för att inte riva bukhinnan eller bristaartären.
- Komplett två knutar på ett kast var, försiktigt så att inte dra åt suturen mycket hårt, eftersom detta kan resultera i förlust av blodflödet och senare nekros av tarmen och död. Trimma sutur inom 2 mm av implantatet. Wet tarmen igen för att fortsätta att upprätthålla vätskebalansen innan vi går vidare till nästa implantat.
- Rör sig i en rostralt riktning, dra ut de närmaste 3-4 cm av tarmen och försiktigt byta ut det avsnitt som redan innehåller ett implantat. Gå en eller två artärer från föregående implantationsstället och sutur nästa implantatet. Upprepa för den tredje implantat.
- Byt ut alla i tarmen i bukhålan.
7. Sham operationer
- Sham operationer görs med samma steg som endometrios operationer förutom att ingen vävnad sys till tarmen tarmkäx.
- Excise vänster livmoder hornet som i steg 4.
- Endometriotic implantat (steg 5) inte är beredda på falska kirurgi. Dencensurerade livmodern horn kan kasseras eller användas för andra ändamål om så önskas.
- Suturer, men inga vävnader, är placerade runt tre artärer i de arteriella kaskad av tarmens krös som i steg 6.
8. Utgående operationssåret
- Se till att alla organ är cirka tillbaka till deras anatomiska läge.
- Använd 5-0 belagda vicryl sutur i en icke-samverkande kontinuerlig stygn för att stänga bukväggen.
- Använd 9 clips mm såret för att stänga huden.
9. Recover djur
- Administrera 0,33 mg / ml buprenorfin vid 0,15 ml per 25 g mus via subkutan injektion för en dos på 0,2 mg / kg. Buprenorfin är givet postoperativt för att förhindra ytterligare hjärt / andningsdepression som kan förlänga återhämtningen.
- Försiktigt torka musen med kimwipes eller hushållspapper om det har blivit blött under operationen.
- Placera djur ventrala nedåt i bur partially ovanpå en recirkulerande uppvärmt vatten pad till dess att djuret återhämtat sig och har återfått sternala VILA (inom fem minuter som inhalant bedövningsmedel snabbt nöts bort).
10. Postoperativ vård
- Möss bör observeras var 15 minuter tills de kan behålla sternala VILA, sedan varje timme tills de återfår sin normala beteende efter ingreppet.
- Möss ska visas normalt inom 24 timmar efter operation. Möss bör kontrolleras dagligen under sju till tio dagar efter tecken på återhämtning och god hälsa.
- Indikationer på att ett djur är i dålig hälsa, smärta eller lidande inkluderar minskad aktivitet, självstympning, ungroomed utseende, eller krökt kroppshållning.
- Om ett djur inte verkar vara vid god hälsa inom 24 timmar efter operation, antingen administrera buprenorfin (0,2 mg / kg) eller avliva djuret. Om djuret inte förbättras inom 8 timmar extra buprenorfin administration djuret should avlivas eftersom tarm nekros är trolig.
- Ta bort såret klipp 7-10 dagar efter induktion.
- Fortsätta att övervaka estrus cyclicity genom undersökning av vaginal cytologi under hela experimentet. Synkronisera estrus cykler 72 timmar före samlingen genom att överföra urin-indränkt manliga sängkläder till den kvinnliga burar som beskrivs i steg 1,3.
11. Obduktion och vävnad excision
- Tidpunkten för obduktion är beroende av särskilt forskning frågan och diskuteras närmare i den representativa resultat och diskussion.
- Euthanize musen genom att koldioxid kvävning.
- Samla blod från hjärtat med hjälp av en 23 gauge nål på en 1 ml spruta (om så önskas).
- Samla en vaginal cytologi cellprov som beskrivits ovan för att avgöra estrus stadium vid tidpunkten för insamlingen 17.
- Skär resterande livmodern horn i livmodern, äggledarna korsningen och i livmoderhalsen, ta bort fett, väger, och processen somönskas (se 11,14 och 11,15).
- Leta reda på den svarta stygn runt endometriotic lesioner. Foto intakt endometriotic skador om så önskas.
- Försiktigt dissekera sammanväxningar kring endometriotic lesioner med en liten sax och pincett, försiktigt så att inte lans lesioner. Arbeta snabbt och noggrant för att förhindra RNA nedbrytning.
- Mät och anteckna längden och bredden på endometriotic lesioner med ok.
- Punktskatter på endometriotic skador och plats på en pappershandduk fuktad med PBS. Ta bort alla icke-endometriotic vävnad från lesioner. En dissekera mikroskop eller förstoringsglas stativ kan användas för stöd i dissekering.
- Väg tre vätskefyllda endometriotic skador innan du tar bort sutur.
- Ta försiktigt av sutur från endometriotic lesioner.
- För histologi, formalin fixa en vätskefyllda endometriotic lesion i två timmar, följt av tre trettio minuters PBS tvättar och slutförvaring in 70% etanol. Torka och paraffin bädda in.
- Lance två av endometriotic lesioner. Väg dem igen. Eftersom cykliska hormonella förändringar kan ändra mängden cysta vätska, ger ett mått av vävnaden våt vikt förutom vikten av cysta plus vätska mätt i 11,10.
- För RNA isolering och gen studier uttryck, omedelbart homogenisera ett av de lanced endometriotic lesioner (eller ~ 20 mikrogram livmoder vävnad) i lys bindande lösning och förvara vid -80 ° C för framtida RNA isolering med RNAqueous Kit (Ambion) eller annan metod som önskas.
- För framtida isolering av RNA, DNA eller protein omedelbart snap-fryser den andra lanced endometriotic lesion (eller ~ 20 mikrogram livmoder vävnad) i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
Representativa resultat
Endometriotic lesioner i musmodell av kirurgiskt inducerad endometrios morfologiskt och histologiskt liknar dem som observerats hoskvinnorna. Histologisk analys av endometrios hos både kvinnor och musmodell visar att endometriotic lesioner innehåller endometriets körtlar och stroma (Figur 2A). Endometriotic skador hos möss innehåller också hemosiderin-lastat makrofager, som är ett vanligt kännetecken för endometrios hos kvinnor (Figur 2B) 19.
Endometriotic lesioner bort från möss tre dagar efter induktion verkar inflammerad och hemorragisk (figur 3a). Efter två till fyra veckor av tillväxten endometriotic lesioner i musmodell är cysta-liknande, vätskefyllda och omgiven av bukhinnan (figur 3B och 3C). Jämfört med lesionen vikt vid induktion var vätska fyllde organskador 306% och 862% större vid en och två månader efter induktion och lanced lesioner var 51% och 172% större, respektive (figur 4A och 4B). Vi har fått konsekvent vätskefyllda och lanced endometriotic skada vikter på en månad efter induktion över fem olika experiment (Figur 5). På en månad efter iduktionen vätskefyllda (7,44 ± 3,75 mg) och lanced (2,92 ± 1,23 mg) endometriotic lesion vikt var signifikant korrelerade (Pearsons korrelationskoefficient = 0,669, p <0,001).
Ålder på musen påverkade inte lesion storlek för möss mellan tre och tio månaders ålder. Varken vätskefyllda eller lanced endometriotic skada vikt på en månad efter induktion var signifikant korrelerad med djurets ålder (r = -0,136, p = 0,380 och r = -0,063, p = 0,698 respektive).
Musen livmodern genomgår förändringar i storlek, vätskeansamling, celltillväxt och utseende på grund av påverkan av steroidhormoner under estrus cykeln. Vi jämförde endometriotic lesionen vikt vid vikten av de återstående intakta livmoder horn från djur i olika estrus stadier. Vi hittade inte en signifikant korrelation mellan livmodern vikt och fylld vätska eller lanced endometriotic lesion vikt på en månad efter induktion (r = -0,046, p = 0,765 och r = 0,232, p = 0,155 respektive).
Den genuttryck mönster som observerats i endometriotic lesioner hos möss avspeglar nära som rapporterats hos kvinnor med sjukdomen 5. Genom tre dagar efter induktion gener som reglerar extracellulärmatrix remodeling, cell adhesion, angiogenes och är mycket uppregleras och många av dessa gener kvar uppregleras genom en månads tillväxt.
Figurer och tabeller
Figur 1. Kirurgiska induktion av endometrios genom autologus livmoder vävnad överföring i musen. Den vänstra livmodern hornet är knyts ihop, censurerade, och öppnas longitudinellt avslöja livmoderslemhinnan. Tre 2 mm 2 biopsier är beredda och varje sys till en artär i de arteriella kaskad av tarmens mesentery. Med en månad efter induktion av endometriotic lesioner är vätskefyllda och omges av sammanväxningar.
Figur 2 Hematoxylin och eosin färgade delen av en livmoder lesion från musmodell av endometrios en månad efter induktion visar (A) närvaro av endometriets körtlar och stroma;. Skalningsfält = 50 ìm och (B) hemosiderin-lastat makrofager, varav några är markerade med pilar, skala bar = 20 mikrometer.
Figur 3. Endometriotic lesioner i musmodell följande dödshjälp, antingen tre dagar efter induktion (A) eller en månad efter induktion (B och C).
Figur 4. Endometriotic skador från möss kirurgiskt inducerad att ha endometriosis blev censurerade och vägde vid en eller två månader efter induktion. Uppgifterna är genomsnittliga ± SEM. Data samlades logga omvandlas och olika bokstäver indikerar signifikans inom varje panel med envägs ANOVA följt av ensidiga Fishers Least Significant Jämförelser Skillnad Mulitple. (A) Cysta gillar, vätskefyllda endometriotic lesioner (N = 10, 7 eller 5 för induktion, en månad eller två månader efter induktion, respektive). (B) Lanced endometriotic lesioner (N = 10, 8 eller 7 för induktion, en månad eller två månader efter induktion respektive).
Figur 5. Endometriotic lesion våt vikt med vätska och lanced en månad efter induktion från fem olika experiment. Uppgifterna är genomsnittliga ± SEM. Möss N = 10, 6, 8, 7 och 7 för vätska fyllde organskador och 0, 7, 10, 8 och 8 för lanced lesioner i experiment 1, 2, 3, 4 och 5, respektive.
Tabell 1. Observation av estrus scenen genom vaginal cytologi och utseende äggstockar och livmoder och induktion.
Utseende av äggstockarna och livmodern blir tidsberoende. Följande bygger på offret runt 08:00 på morgonen av varje cykel dag. Vidare observationerna är subjektiva och jämföra äggstockarna och livmodern horn kommer att bli en bättre uppskattning än livmodern hornen bara. Dessa observationer är tänkta att komplettera de uppgifter som erhållits från daglig vaginal cytologi avläsningar.
Tabell 2. Jämförelse av kirurgi i mus och råtta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga parametrar som bör uppmärksammas när de utför den kirurgiska induktion av endometrios hos möss. För det första är endometrios en östrogenberoende sjukdom och som sådan denna operation skall utföras i intakta djur eller alternativt i ovariektomerade djur kompletteras med östrogener 20. För det andra måste suturering på endometriet biopsier till arteriell kaskad utföras med stor försiktighet. Vi har funnit att med bara två relativt lösa knutar med ett kast vardera håller biopsi på plats samtidigt förhindra ligation av blodtillförseln till tarmen och efterföljande vävnadsnekros och djurens död. Vi rekommenderar starkt att öva på flera möss innan det faktiska experimentet att se till att suturer placeras säkert nog att vävnaden inte går förlorad, men inte för hårt så att orsaka tarm nekros. Tredje är det mycket viktigt att hålla tarmen vävnaden hydratiserade med steril PBS innehållande penicillin och streptomycin under surgery. Det fjärde insatser bör vidtas för att säkerställa att endometriotic implantat storlek är konsekvent. För detta ändamål använder vi en 2 mm biopsi punch för att skapa genomgående stora endometriotic implantat censurerade livmoder vävnad.
Det finns flera modifieringar som kan göras för att detta protokoll för att passa individuella behov och vetenskapliga frågor av forskaren. En möjlig förändring avser den hormonella profilen av djuret. Gen-och proteinuttryck i endometriotic lesioner, återstående intakt livmoder horn och immunförsvaret kan direkt påverkas av tidpunkten för samlingen i förhållande till estrus cykeln scenen. Det finns flera metoder för kontroll för estrus scenen vid tiden för insamlingen, alla med sina egna fördelar och nackdelar. Till exempel kan intakta, cykling djur ska synkroniseras genom överföring av urin-indränkt manliga sängkläder i den kvinnliga buren tre dagar före induktion eller insamling så att djur opereras INDUCED och samlas under samma estrus scenen 15. Om intakta cykling djur används bör estrus cyclicity följas dagligen genom undersökning av vaginal cytologi 17. Detta har fördelen av att vara mer fysiologiskt relevant, men att uppnå cykel synkronicitet är inte 100% lyckad. Alternativt kunde intakta djur ska synkroniseras av exogena gonadotropin administration 21,22. Medan något mer exakt, ger denna metod högre östrogennivåer än normalt. En annan strategi har varit att ovariectomize djur och ge tillbaka en konstant nivå av exogena hormoner antingen genom en silastic kapsel, mini-osmotisk pump, eller dagliga injektioner 4,8. Denna metod har fördelen att få en enhetlig hormon profil i många djur, men är ofördelaktigt eftersom djur inte cykling.
Sham operationer kan utföras för att bedöma vilka effekter är resultatet av genomgår kirurgi kontra effekterna attributable till endometrios. I bluff operationer vänster livmoder hornet tas bort och suturer placeras runt artärerna i de arteriella kaskad av tarmens krös men ingen endometriotic implantat är sys 5,8,23. Alternativt kan fettet bort från exciderad livmoder horn sys till tarmen tarmkäx 3,14. Vi rapporterade nyligen att det finns relativt få skillnader i genuttryck mätt cDNA microarray mellan bluff livmodern och den intakta kvarvarande livmoder horn från djur kirurgiskt inducerad ha endometrios 5. Vidare, med hjälp av kvantitativa realtids-PCR för sju endometrios-relaterade gener, fann vi att endast haptoglobin uttryck var signifikant olika i uterus i Sham och möss endometrios. Lee et al. rapporterade dock differentierade uttryck av fem gener i livmodern från möss förmås att ha endometrios jämfört med bluff kontroller 23. Detta tyder på att förekomsten av endometriotic lesions kan orsaka förändrade genuttrycket i eutopic livmodern.
Tidpunkten för insamlingen av möss kirurgiskt inducerad ha endometrios bör avgöras av den specifika frågeställningen. Insamling av möss tre dagar efter induktion tillåter en att bedöma kritiska, tidiga händelser i upprättandet av endometrios inklusive den initiala neutrofila och machrophage infiltration och cytokin produktion som har rapporterats tidigare 8. Vi har visat att endometriotic skador samlas tre dagar efter induktion är små, hemorraghic, och har i grunden förändrat genuttryck i förhållande till de kvarvarande livmoder hornet 4. Genom två veckor efter induktion endometriotic lesioner är väl etablerade och har ofta bildat cysta-liknande strukturer. Hos mus, endometriotic skador fortsätter att öka i storlek, enligt bedömning av vikten av de fyllda vätska och lanced lesioner (Figur 4) samt av lesion volym bestäms av längd, bredd och heigHT mätningar genom två månader efter induktion 9.
Som nämnts ovan var den kirurgiska modell av endometrios utvecklades först hos råtta och fortfarande används flitigt 3. När du utför denna operation hos råtta vi göra följande ändringar av protokollet, som sammanfattas i tabell 2. Hos råtta allt använt suturer är 4-0 storlek och kan och bör knytas hårdare. Dessutom sutur vi sex 5 mm 2 endometriotic implantat i tarmen tarmkäxet från bukhålan.
I detta protokoll beskriver vi användning av en inhalerad bedövningsmedel, isofluran. Alternativt, kombinerat injicerbara bedövningsmedel som består av ketamin och Domitor (medetomidinhydroklorid) eller annan alfa-2-agonist kan användas, även om återhämtningen är något längre. Ketamin, som administreras vid 75 mg / kg av intraperiotneal injektion, är en dissociativ anestesimedel med minimal akut smärtlindrande egenskaper enND är en förteckning III drog som kräver en DEA licens och detaljerad drogen lager. Domitor, administrerat vid 1 mg / kg, är en alfa-2 agonist och är lätt omvända med Antisedan (atipamezolhydroklorid) administration. Domitor är ett lugnande medel som ger muskelavslappning och smärtlindring. Domitor och ketamin kan förberedas i förväg i kombination i PBS med steril teknik. Antisedan, den vända agent för Domitor, kan förberedas i PBS i kombination med buprenorfin och bör administreras vid 1 mg / kg postoperativt. Buprenorfin är också en förteckning III drog och alternativen hör icke-steroida antiinflammatoriska medel banamine (Flunixin meglumin) och ketoprofen.
Som med alla modeller finns det vissa begränsningar i samband med kirurgiska induktion av endometrios hos gnagare. Främst är att gnagare inte har en menstruationscykel och därför inte spontant utvecklar endometrios. I ett försök att göra gnagare model mer fysiologiskt liknar tillståndet hos människor vissa forskare har valt att injicera autologa eller homologa livmoder vävnad fragment från syngenic djur in i bukhålan direkt utan suturering 24,25. Hos möss bildar den injicerade vävnaden cysta-liknande endometriotic skador, dock inte den injektion metod för induktion inte verkar fungera på råttor eftersom vävnaden inte bifoga och invadera i bukhålan 3.
Den gnagarmodell har i stor utsträckning använts för att studera etiologi, patologi, och riskfaktorer av endometrios 2,8,26-29 samt att utforska nya behandlingar 14,30-34. Den gnagare modell av kirurgiskt inducerad endometrios visar många likheter med sjukdom hos människor, inklusive nedsatt fertilitet och fruktsamhet och förändrad gen-och proteinuttryck 5,6,35,36. Tillsammans med sin relativt låga kostnader och redo tillgänglighet, gnagare modell av kirurgiskt INDUCED endometrios är en utmärkt modell för endometrios hos kvinnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Speciellt tack till Chris Kassotis och Audrey Bailey för kritisk granskning av detta manuskript och Dr Scott Korte, Joseph Beeman, Alison Curfman, Paul Kimball, Bridget Neibreggue, Jacob Redel, Amy Schroder, Maija Steinberg och Stacey Winkeler för deras hjälp med optimering av denna modell i vårt laboratorium. Finansiering gavs av den kliniska Biodetectives Training Grant (NIH T90) (KEP), University of Missouri livsvetenskaper Grundutbildning möjligheter Research Program, MU Vetenskapsrådet, MU Research Board bidrag och NIH R21HD056441 (SCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R.
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C.
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N.
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
