Summary
Fare ve sıçanlarda barsak mezenter arter kaskad rahim dokusundaki otomatik nakli endometriozis cerrahi indüksiyon açıklaması.
Abstract
Endometriozis, etyolojisi bilinmemektedir, ağrılı, kronik bir hastalık. Ayrıca, tedavi endometriozis lezyonlarının laparoskopik çıkarılması ve / veya kronik ağrı ve kısırlık belirtileri, ilaç yönetimi gerektirebilir. Endometriozis ile ilişkili maliyet Amerika Birleşik Devletleri 1 yılda 22 milyar dolar olarak tahmin edilmiştir. Anlayışımız bu gizemli hastalığın altında yatan mekanizmaları daha için, hayvan modelleri istihdam edilmiştir. Primatlar kendiliğinden endometriozis geliştirmek ve bu nedenle primat modelleri en yakın kadınlarda hastalık benzer. Kemirgen modelleri Ancak, daha uygun maliyetli ve 2 hazır. Burada tarif modeli, rahim dokusunun (Şekil 1) bağırsak mezenter otolog transfer içerir ve ilk 3 sıçan geliştirilen ve daha sonra fare 4 transfer edildi . Amaç, cerrahi ile indüklenen endometriozis otolog kemirgen modeli taklit etmek.kadınlarda hastalık. Biz ve diğerleri daha önce değişmiş gen ekspresyonu desen fare ya da hastalığı 5,6 ile kadınlarda gözlenen sıçanlarda aynalar endometriotik lezyonlar gözlenen olduğunu göstermiştir . Fare ameliyat yerine bir avantajı mevcut transgenik fare suşlarının bolluğu endometriozis kurulması ve büyüme önemli rolü belirli bileşenleri belirleyen araştırmacılar yardımcı olabilir. Eksize insan endometrium parçaları immün sistemi baskılanmış farelerin periton tanıtıldı olduğu alternatif bir model de yaygın olarak kullanılan ancak 2,7 endometriozis önemli olduğu düşünülmektedir normal bir bağışıklık sistemi eksikliği ile sınırlıdır. Daha da önemlisi, cerrahi olarak uyarılan endometriozis fare modelinde, bağışıklık sistemi, 8, 9,10 ve çevresel faktörler 11,12 hormonların yanı sıra endometriozis etkileri Fert üzerinde endometriozis nasıl etkilediğini incelemek için kullanılan bir çok yönlü bir model.ility 13 ve ağrı 14.
Protocol
1. Canlı hayvan cerrahisi için Planlama
- Laboratuvar hayvanları ile çalışmak için uygun onayı alındıktan emin olun.
- Sipariş fareler ve yeni bir çevre aklimasyonundan en az bir hafta izin.
- Erkek feromonlar maruz kalma yokluğunda ev sahipliği Dişi fareler bisiklet durdurmak, bir fenomen Whitten etkisi 15,16 olarak anılacaktır. Fareler bisiklet transferi idrarda batırılmış erkek yataklar, her beş günde bir kadın kafes tutmak için. Alternatif olarak, üstü açık kafesler kullanılması halinde, iki erkek kafesleri arasında kadın düzenli olarak bisiklet tutmak için dişi kafes yerleştirin.
- Bu farelerin (Tablo 1) ameliyat öncesinde en az bir hafta için günlük vajinal sitoloji analiz ederek 17 bisiklet vardır emin olun.
- Böylece birden fazla farelerden alınan vajinal smear toplanan bir cam slayt sekiz bölüm oluşturmak için bir mum kalem kullanın.
- Vajina bir damlalık kullanarak 0,2-0,25 mL serum fizyolojik veya distile su ile yıkayın. Be sdamlalık ile servikal stimülasyon, sadece vajinal orifis damlalık ure yere pseudopregnancy neden olabilir. Hücre tiplerinin analizi için cam slayt vajinal lavaj yerleştirin. Slaytlar taze okuma (ıslak) veya alternatif olarak sabit bir dizi yöntem ve standart bir ışık mikroskobu 17 kullanılarak tespit edilebilir.
- Başarılı bir aseptik cerrahi için gerekli tüm cerrahi ekipman (bkz: Malzeme Bölüm) 18 temiz ve sterilize toplayın .
- PBS içinde analjezi 0.2 mg / kg son doz sunmak için steril tekniği kullanarak buprenorfin çözüm hazırlayın. Buprenorfin çözüm konsantrasyonu 0,0333 mg / ml ortalama yetişkin C57BL / 6 fare, yaklaşık 0.025 kg ve fare başına 0.15 ml subkutan enjeksiyon hacmi ağırlığında olduğunu varsayarak olmalıdır. Buprenorfin vaktinden önce hazırlanmış ve alikot olarak saklanabilir. Buprenorfin DEA lisans ve detaylı envanter günlük gerektiren bir zamanlama III kontrollü bir madde olduğunu unutmayın.
- Penisilin (100 U / ml) ve streptomisin (100 mg / ml) ile steril PBS hazırlayın.
- Indüksiyon 15 kadın kafeslerde 72 saat önce idrar batırılmış erkek yataklar aktararak östrus döngülerini senkronize edin.
2. Cerrahi alanda canlı hayvan ameliyatı için hazırlayın
- Cerrahi alanda daha önce 18 açıklandığı gibi hazırlayın.
- Elektrik kesme makineleri, oftalmik merhem ve cerrahi scrubs ortaya koyan hazırlık alanı hazırlayın.
- Cerrahi alanında ameliyat boyunca vücut ısısını korumak için cerrahi alanında bir devir daim sıcak su ısıtma pedi koyarak hazırlayın. Devir daim sıcak su ısıtma pedi üzerinde steril su geçirmez bir yastık yerleştirin. Cerrahi aletler, dikiş, steril cam petri kabı, biyopsi yumruk, steril gazlı bez, yara klipleri ve yara klip aplikatörü steril cerrahi alanında düzenleyin.
- Devir daim sıcak su ısıtma pedleri yarım und koyarak kurtarma alanında hazırlayıner istenirse fareler ısı uzaklaşmaya izin vermek için boş bir kafes.
3. Anestezi ve cerrahi için fare hazırlamak
- Farenin ağırlığını kaydedin ve vajinal sitoloji değerlendirerek östrus evresini belirlemek.
- Anestezi indüksiyonu için, boş bir anestezi odası (izofluran için portal içeren katı kapaklı boş kafes) fare yerleştirin. Izofluran olmayan solunmasına anestezi sistemi açın ve izofluran% 4 (0.5 ila 1 L / dk oksijen debisi) buharlaştırıcı.
- Fare hazırlık masaya koni izofluran bir koni akışı (30-60 ml şırınga kılıf) ve yerde farenin burun ve ağız geçiş anestezi altında olduğunda. Yeterli anestezi, cerrahi (~% 2.5-3.5 izofluran) geri kalanı boyunca izofluran daha düşük bir konsantrasyon ile korunabilir. Yeterli anestezi derinliği ayak tutam uyarana karşı olumsuz bir tepki ile tespit edilmelidir.
- T oftalmik merhem uygulayıno Ameliyat sırasında gözleri kurutulması kaçının.
- Küçük elektrik kesme makineleri kullanarak, cerrahi sitesi tıraş.
- Dezenfekte ve klorheksidin fırçalayın üç alternatif bira ve% 70 etanol ile cerrahi sitesi hazırlamak.
- Örtü steril bir alan ile hayvan.
4. Rahim ligasyonu
- 1.0 cm vajinal açılış için rostral kullanarak küçük bir makas veya 0.5 biten bir neşter bıçak ya da küçük bir (~ 1 cm) orta hat kesi olun.
- Kapalı makas bıçakları vücut duvarı ve karın duvarı arasında olduğu gibi ağzına yerleştirin. Yavaşça kesi etrafındaki alanı yavaş yavaş karın duvarı cilt yeterince kopuk olduğu gibi makas açılış ve kapanış teşrih künt. Kesi site çevresinde karın duvarı ve cilt arasında kalan görünür yapışıklıklar dikkatle snipped olabilir. Kesi yeterince disseke künt takdirde, karın duvarı daha zor kapanış yapacaktır.
- Küçük forceps, yavaşça sol uterin horn bulun. Rahim, bağırsak, dorsal, ilk kesi sitesine girdikten sonra ne göreceğiz. Bazı durumlarda ilk yumurtalık ve ilişkili over yağ yastığı bulmak için en kolay yoldur. Uterin horn hafifçe yukarı çekin ve bir retraktörü olarak hizmet vermeye altında açık bir forseps slayt. İsterseniz, yumurtalıklar ve rahim östrus indüksiyon aşamasında (Tablo 1) ile ilgili ek bilgi için şu anda görünümünü dikkat edin.
- 5-0 siyah örgü ipek sütür 6-8 cm'lik iki adet (bir iğne olmadan) gergin uterin horn altında yavaşça kaydırın.
- Güvenli utero-tubual kavşağı (fallop tüpüne sadece kaudal) ve kare bir düğüm, her yerde kullanarak utero-servikal bileşke (serviks sadece rostral) boynuz Arter. Şu an için sütür uçları bırakın.
- Iki ligasyonu arasında uterin horn bölümü kesip ve steril bir cam petri kabı conta doku~ 100 mcL PBS içeren penisilin (100 U / ml) ve streptomisin (100 mg / ml) ining. Ipek sütür son uçlarını kesin. Sütür gevşek ya da kanama olduğunda gelirse, güdük ve başka bir düğüm.
5. Endometriotik implantlar eksize rahim hazırlayın
- Eksize rahim manipüle edilirken, steril gazlı bez ile karın kapağı ve steril PBS içeren penisilin ve streptomisin gerektiği gibi hidrasyon korumak.
- Yağ eksize uterin horn soyun.
- İsterseniz, eksize uterin horn tartın.
- Forseps ile boynuz tutarak lümen içine küçük makas bıçak (14 mm bıçak uzunluğu) ekleme ve uterin boynuz yavaşça aşağı makas sürgülü uterin horn açın.
- Cam Petri kabı, üç eşit büyüklükteki implantlar kesip 2 mm biyopsi yumruk kullanın.
6. Periton boşluğuna endometriotik implantlar sütür
- Yeri sterilhemen yukarıdaki e kesi yeri ve steril PBS içeren penisilin ve streptomisin ile iyice ıslak gazlı bez.
- Ile küçük, yumuşak forseps yavaşça çekum bulmak ve ince bağırsakta boyunca rostrally hareket. Bağırsak mezenter arter kaskad açıkça görülebilecek şekilde çekum en az iki arter ve önceden ıslatılmış gazlı bez üzerine bir fan gibi düzenleyebilirsiniz bağırsağın bir küçük (4-5 cm) bölümünde dışarı çekin. Steril serum fizyolojik ile bağırsak nemli tutmak için her zaman emin olun. Not: bağırsak işleme sırasında sıçan dişli forseps kullanmayın.
- Bağırsak yaklaşık 0.5 cm'lik bir arterin hafifçe bir implant sütür kesici iğne tersine, P-1, 11 mm, 3 / 8 daire, 6-0 siyah ethilon sütür kullanın.
- Not: bağırsak mezenter periton ince bir tabaka ile kaplıdır. Arter etrafında dikilmesi ise bu katman aracılığıyla temiz bir geçiş yapmak için dikkatli olun. Periton veya rüptürü gözyaşı olarak değil yavaş ve dikkatli bir şekilde dikiş çekinarter.
- Böylece kan akışı ve bağırsak ve ölüm sonraki nekroz kaybına neden olabilir gibi bir tam iki knot, dikiş çok sert sıkmak için değil dikkatli olmak, her atmak. Implant 2 mm içinde dikiş kesin. Islak bağırsak sonraki implant geçmeden önce hidrasyon korumak için tekrar devam edin.
- Rostral yönde taşıma, bağırsak önümüzdeki 3-4 cm çekin ve yavaşça zaten bir implant içeren bölümün değiştirin. Önceki implant sitesinden bir veya iki arter geç ve sonraki implant sütür. Üçüncü implant için tekrarlayın.
- Bağırsak karın boşluğuna değiştirin.
7. Şam ameliyatları
- Şam ameliyatlar dışında hiçbir doku bağırsak mezentere sütüre olduğunu endometriozis ameliyatları aynı adımları kullanarak yapılmaktadır.
- Vergi 4. adımda sol uterin boynuz.
- Sham Endometriyotik implantlar (adım 5) hazır değildir.istenirse eksize uterin horn atılır ya da başka amaçlar için kullanılabilir.
- Dikişler, ama herhangi bir doku, 6. adımda barsak mezenter arter kaskad üç arterlerin etrafında yerleştirilmiştir.
8. Kapanış cerrahi yara
- Tüm organların anatomik pozisyonda yaklaşık arka emin olun.
- 5-0 kaplı olmayan bir kilitleme sürekli dikiş Vicryl dikiş, karın duvarı kapatmak için kullanın.
- 9 mm yara klipleri cilt kapatmak için kullanın.
9 - Hayvan kurtarma
- 0.2 mg / kg doz subkütan enjeksiyon yoluyla, 0,15 ml/25 g fare, 0,33 mg / ml buprenorfin yönetin. Buprenorfin ameliyat sonrası iyileşme sürecini uzatabilir kardiyovasküler / solunum depresyonu önlemek için uygulanır.
- Fare, ameliyat sırasında ıslak kazanılmış varsa Kimwipes ya da kağıt havlu ile hafifçe kurulayın.
- Kafes p aşağı gelecek şekilde yerleştirin hayvan ventral taraftaKısmen hayvan kurtarıldı ve sternal yatma (anestezi hızla kapalı giyer uçucu olarak beş dakika içinde) kazanmış kadar devir daim sıcak su yastığı tepesinde.
10. Post-operatif bakım
- Sternal yatma, sonra saatlik cerrahi sonrası normal bir davranış geri kazanana kadar korumak için mümkün olana kadar her 15 dakikada bir Fare dikkat edilmelidir.
- Fare ameliyat 24 saat içinde normal görünmelidir. Fare kurtarma ve sağlık işaretleri için yedi ila on gün boyunca günlük olarak takip edilmelidir.
- , Bir hayvan, kötü sağlık, ağrı veya sıkıntı olduğunu endikasyonları, azalmış aktivite, kendini yaralama, ungroomed görünüm, ya da hunched duruş içerir.
- 24 saat içinde cerrahi bir hayvan sağlık durumunun iyi görünmüyorsa, buprenorfin (0.2 mg / kg) yönetmek veya hayvan euthanize. Hayvan, ek buprenorfin yönetiminin hayvanın omuz 8 saat içinde düzelmezsebağırsak nekrozu olasılıkla d ötenazi.
- Indüksiyon sonrası 7-10 gün yara klipleri çıkarın.
- Vajinal sitoloji muayene ile östrus döngüselliğin deney süresi boyunca izlemeye devam edin. 72 saat önce toplama adım 1.3 'de anlatıldığı gibi dişi kafesleri idrar batırılmış erkek yataklar aktararak östrüs döngüleri senkronize edin.
11. Otopsi ve doku eksizyonu
- Nekropsi zamanlaması belirli bir araştırma sorusu bağlıdır ve daha temsili sonuçlar ve tartışma olarak ele alınmıştır.
- Karbondioksit boğulma fare Euthanize.
- (Istenirse) 1 cc şırınga, 23 gauge iğne kullanılarak kalp ponksiyonu ile kan toplayın.
- Toplama 17 kez östrus evresini belirlemek için yukarıda açıklandığı gibi bir vajinal sitoloji yayma toplayın.
- Utero-tubal kavşakta kalan uterin horn kesin ve serviks, yağ çıkarmak tartmak ve süreçİstenen (11.14 ve 11.15 'e bakınız).
- Endometriotik lezyonların etrafında siyah dikişlerle bulun. Fotoğraf bozulmamış endometriotik lezyonlar eğer istenilen.
- Dikkatlice namlusu lezyonlar için dikkatli olmak, küçük bir makas ve forseps ile endometriotik lezyonları çevreleyen yapışıklıklar teşrih. RNA bozulmasını önlemek için hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışın.
- Ölçü ve kaliperler kullanarak endometriotik lezyonların uzunluk ve genişlik kaydetmek.
- Vergi PBS ile ıslatılmış kağıt havlu üzerine endometriotik lezyonlar ve yer. Lezyonlar endometriotik olmayan herhangi bir doku çıkarın. Bir kesme mikroskop ya da büyüteç standı diseksiyonu yardımcı olmak için kullanılabilir.
- Üç sıvı dolu endometriotik lezyonlar dikiş çıkarmadan önce tartılır.
- Endometriotik lezyonlar dikiş yavaşça çıkarın.
- Histoloji için, formalin düzeltme sıvısı, üç otuz dakika PBS yıkar ve nihai depolama takip iki saat için endometriotik bir lezyon dolu In% 70 etanol. Dehydrate ve parafin gömün.
- Endometriotik lezyonların Lance iki. Yine bu tartılır. Siklik hormonal değişiklikler, kist sıvısı miktarını değiştirebilir, bu kistin ağırlığı artı 11.10 olarak ölçülen sıvı yanı sıra, doku ıslak ağırlık bir ölçü verir.
- RNA izolasyonu ve gen ekspresyon çalışmaları için, hemen -80 lizis bağlayıcı çözüm ve mağaza fırlattı endometriotik lezyonlar (ya da ~ 20 mg rahim dokusu) ° C RNAqueous kiti (Ambion) ya da diğer bir yöntem ile gelecekteki RNA izolasyonu için homojenize İstenen.
- , RNA, DNA veya protein gelecek izolasyonu için, hemen ikinci fırlattı endometriotik lezyon snap-dondurma (veya ~ 20 mg rahim dokusu) -80 ° C sıvı nitrojen ve mağaza
Temsilcisi Sonuçlar
Fare modelinde, cerrahi olarak uyarılan endometriozis Endometriyotik lezyonlarının gözlenen morfolojik ve histolojik olarak çok benzemektedirkadınlar. Kadın ve fare modelinde hem de endometriozis histolojik analiz endometriotik lezyonlar endometrial bezler ve stroma (Şekil 2A) içerdiğini gösterir. Farelerde Endometriyotik lezyonlar aynı zamanda kadınlarda endometriozis ortak bir hallmark (Şekil 2B) 19 hemosiderin yüklü makrofajlar, içerir .
Fareler kaldırılır Endometriyotik lezyonlar üç gün sonrası indüksiyon iltihaplı ve hemorajik (Şekil 3A) görünür. Fare modelinde büyüme endometriotik lezyonların 2-4 hafta sonra kist gibi peritoneal yapışıklıklar, sıvı dolu ve çevrilidir (Şekil 3B ve 3C). Indüksiyon lezyon ağırlığı ile karşılaştırıldığında, sıvı dolu lezyonlar 306% 862% daha büyük ve iki ay sonrası indüksiyon ve fırlattı lezyonlar sırasıyla% 51 ve% 172 daha büyük, (Şekil 4A ve 4B) ve. Biz beş farklı deneylerde (Şekil 5) üzerinden bir ay sonrası indüksiyon dolu ve tutarlı bir sıvı fırlattı endometriotik lezyon ağırlıkları elde edilmiştir. Bir ay sonrası,duction sıvı dolu (7.44 ± 3.75 mg) ve fırlattı (2.92 ± 1.23 mg) endometriotik lezyon ağırlığı önemli ölçüde korele idi (Pearson korelasyon katsayısı = 0,669, p <0,001) .
Fare Yaş, üç yaş ve on ay arasında fareler için lezyon büyüklüğü etkilemedi. Ne bir ay dolu ya da endometriotik lezyonun ağırlık fırlattı sıvı-indüksiyon sonrası önemli ölçüde hayvanın yaşı ile korelasyon (r = -0,136, p = 0.380 ve r = -0,063, p = 0.698, sırasıyla ).
Fare rahim östrus döngüsü sırasında steroid hormonlarının etkisi nedeniyle boyutu değişir, sıvı retansiyonu, hücre çoğalması ve görünüm uğrar. Biz farklı östrus evrelerinde hayvanlardan elde kalan sağlam uterin horn ağırlığı endometriotik lezyon ağırlığı karşılaştırıldı. Biz uterus ağırlığı ve sıvı dolu veya fırlattı endometriotik l arasında anlamlı bir korelasyon bulamadıkbir aylık Mesaj indüksiyon (sırasıyla r = -0,046, p = 0.765 ve r = 0.232, p = 0.155) esion ağırlık.
, Farelerin endometriotik lezyonlar gözlenen gen ekspresyonu desen yakından 5 hastalık kadınlarda bildirilen aynalar . Üç gün-indüksiyon sonrası ekstrasellüler matriks remodeling, hücre adezyon ve anjiyogenez düzenleyen genler yüksek upregüle ve büyüme bir ay boyunca bu genlerin çoğu upregüle kalır.
Şekiller ve Tablolar
Şekil 1. fare otolog rahim dokusu transferi ile endometriozis cerrahi indüksiyon. Sol uterin boynuz, bağlandı eksize ve endometrium maruz boyuna açtı. Üç 2 mm 2 biyopsileri bağırsak mesente arteriyel kaskad hazırlanır ve her bir arter sütürery. By-indüksiyon sonrası bir ay endometriotik lezyonlar sıvı dolu ve yapışıklıklar ile çevrilidir.
Şekil 2, bir ay sonrası indüksiyon endometriozis fare modelinde bir endometrial lezyon Hematoksilen ve eosin ile boyanan bölümünde gösteren (A) endometriyal bezler ve varlığı stromada; ölçek çubuğu = 50 mm ve (B) hemosiderin yüklü makrofajlar , bazıları oklarla gösterilen; ölçekli bar = 20 mikron.
Şekil 3 ötenazi aşağıdaki fare modeli Endometriyotik lezyonlar, ya üç gün-indüksiyon sonrası (A) veya bir ay sonrası indüksiyon (B ve C).
Şekil 4 Endometriyotik lezyonlar cerrahi tr ikna farelerdedometriosis bir ya da iki ay sonrası indüksiyon eksize ve tartıldı. Veriler ortalama ± SEM. Veri dönüştürülmüş giriş ve farklı harf, tek taraflı Fisher En Önemli Fark mulitple Karşılaştırmalar takip tek yönlü ANOVA her panelin içinde önemi gösterir. (A), sıvı dolu endometriotik lezyonlar, Kist (N = indüksiyon, bir ay, iki ay sonrası indüksiyon, sırasıyla 10, 7 veya 5). (B) fırlattı endometriotik lezyonlar (n = indüksiyon, bir ay veya iki ay-indüksiyon sonrası sırasıyla 10, 8 ya da 7).
Şekil 5 Endometriyotik lezyon ıslak ağırlık ve sıvı ile bir ay beş ayrı deney sonrası indüksiyon fırlattı. Veriler ortalama ± SEM. Fareler N = 10, 6, 8, 7 ve sıvı dolu lezyonlar ve 0, 7 için 7, 10, 8 ve fırlattı lezyonlar için sırasıyla deney 1, 2, 3, 4, 5, 8.
Tablo 1. Yumurtalıklar ve Rahim ve İndüksiyon Vajinal Sitoloji ve Görsel Görünüm östrus Sahne Gözlem.
Yumurtalık ve rahim Görünüm zamana bağlı olacak. Aşağıdaki her bir döngüsü gün sabah saat 08:00 civarında kurban dayanmaktadır. Dahası, gözlemler subjektif ve yumurtalık ve rahim boynuzları karşılaştırırken sadece rahim boynuzları daha iyi bir tahmin olacaktır. Bu gözlemler, günlük vajinal sitoloji okumalarından elde edilen bilgilere ek içindir.
Tablo 2. Fare ve sıçan cerrahinin karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farelerde endometriozis cerrahi indüksiyon yaparken dikkat edilmelidir birçok kritik parametre vardır. İlk olarak, endometriozis östrojen bağımlı bir hastalıktır ve sağlam hayvanların veya alternatif östrojenler 20 ile desteklenmiş ovarektomize hayvanlar gibi bu cerrahi olarak yapılmalıdır. İkinci olarak, arteryel kaskad endometriyal biyopsiler dikilmesi çok dikkatli yapılmalıdır. Biz biriyle sadece iki nispeten gevşek knot kullanarak, bağırsak ve sonraki doku nekrozu ve hayvan ölümü kan dolaşımı ligasyonu önlerken her yerde biyopsi tutar atmak bulduk. Önemle dikişlerle yeterince güvenli olmadığını doku kaybına yerleştirilir sağlamak için gerçek deneme öncesinde birkaç fareler üzerinde pratik öneririz, ancak bağırsak nekroz neden olarak çok sıkı değil. Üçüncü olarak, s sırasında steril PBS içeren penisilin ve streptomisin ile bağırsak dokusu nemli tutmak için çok önemlidir.urgery. Dördüncüsü, çabaları endometriotik implant boyutunun tutarlı olmasını sağlamak için alınmalıdır. Bu amaçla biyopsi yumruk sürekli ölçekli endometriotik implantlar eksize rahim dokusu oluşturmak için 2 mm.
Araştırmacı ve bilimsel sorular bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için bu protokolü yapılabilir bazı değişiklikler vardır. Hayvanın hormonal profili için potansiyel bir değişiklik ilgilidir. Endometriotik lezyonlar Gen ve protein ekspresyonu, kalan sağlam uterin horn ve bağışıklık sistemi doğrudan östrus evresinde ilgili toplama zamanlaması etkilenebilir. Toplama zamanda östrus aşamada kontrol etmek için çeşitli yaklaşımlar, her biri kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, bozulmamış, bisiklet hayvanlar indüksiyon veya tahsilat gibi hayvanların üç gün önce, dişi kafes içine idrar batırılmış erkek yataklar aktararak senkronize edilebilir cerrahi induCED ve aynı östrüs aşamada 15 sırasında toplanan. Sağlam bisiklet hayvanların kullanılması halinde, östrüs döngüselliğin vajinal sitoloji 17 muayene ile günlük olarak takip edilmelidir. Bu daha önemli fizyolojik olma avantajına sahiptir, ama ulaşmak döngüsü eşzamanlılık% 100 başarılı değildir. Alternatif olarak, sağlam hayvanlar eksojen gonadotropin yönetiminin 21,22 ile senkronize olabilir. Bu yöntem biraz daha doğru olsa da, normalden daha yüksek östrojen düzeyleri oluşturur. Diğer bir yaklaşım, hayvanların ovariectomize ve silastik kapsül, mini ozmotik pompa, ya da günlük enjeksiyonlar 4,8 ekzojen hormonlar yoluyla sabit bir seviyede geri vermek olmuştur . Bu yöntem birçok hayvan genelinde tek tip bir hormon profili elde etme avantajı vardır, ancak hayvanlar bisiklet değildir çünkü dezavantajlı.
Etkileri, etkileri attributab karşı cerrahisi geçiren sonucu olan Şam ameliyatları değerlendirmek için yapılabilirendometriosis le. Sahte ameliyatlarda sol uterin horn kaldırılır ve sütür bağırsak mezenter arter kaskad arterler çevresinde yerleştirilen ancak hiçbir endometriotik implantlar 5,8,23 dikilir. Alternatif olarak, uterin boynuz eksize kaldırılır yağ barsak mezenter 3,14 sütüre edilebilir. Biz son zamanlarda sahte rahim ve cerrahi olarak endometriozis 5 ikna hayvanlardan elde sağlam kalan uterin horn arasında cDNA mikroarray ile ölçülen gen ekspresyonu olarak görece az sayıda farklılıklar olduğunu bildirdi. Ayrıca, yedi endometriozis ile ilgili genler için kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak, biz sadece haptoglobin ifade uteri sahte ve endometriozis fareler arasında belirgin bir farklılık bulundu. Lee ve ark. Ancak, endometriozis sahte kontrolleri 23 indüklenen farelerden alınan rahim içinde beş genlerin diferansiyel ifade bildirdi. Bu önerir endometriotik lesio varlığıns eutopic rahim içinde değişmiş gen ekspresyonu neden olabilir.
Cerrahi olarak endometriozis indüklenen farelerin toplama zamanlaması belirli bir araştırma sorusu ile tespit edilmelidir. Farelerin toplanması-indüksiyon sonrası üç gün, başlangıç nötrofil ve machrophage infiltrasyonu ve sitokin üretimi gibi daha önce 8 bildirilmiştir de dahil olmak üzere, endometriozis kurulmasında kritik, erken olaylar değerlendirmenizi sağlar. Endometriotik lezyonlar-indüksiyon sonrası üç gün hemorraghic, küçük toplanan olduğunu göstermiştir ve kalan uterin boynuz 4 göre gen ekspresyonu önemli ölçüde değiştirmiştir . Iki hafta sonrası indüksiyon endometriotik lezyonlar iyi kurulmuş ve çoğu zaman kist benzeri yapılar oluşturmuşlardır. Fare, endometriotik lezyonlar sıvı dolu ağırlığı ile uzunluk, genişlik ve Kat yüksekliği tarafından belirlenen lezyon hacmi tarafından değerlendirilecek ve lezyonlar (Şekil 4) yanı sıra fırlattı, boyut artış devam ediyorht iki ay sonrası indüksiyon 9 ile ölçümleri.
Yukarıda belirtildiği gibi, cerrahi olarak endometriozis modeli ilk sıçan geliştirilen ve hala yaygın olarak 3 kullanılır. Bu ameliyatı yaparken sıçan olarak Tablo 2'de, protokol için aşağıdaki değişiklikler yapmak. Sıçan, kullanılan tüm sütür 4-0 boyutu ve daha sıkı bir şekilde bağlı olmalıdır. Ayrıca, periton boşluğuna bağırsak mezenter altı 5 mm 2 endometriotik implantlar dikin.
Bu protokolde, izofluran, inhale anestetik kullanımını tanımlamak. Alternatif olarak, iyileşme süresi biraz daha uzun olmasına rağmen, kombine enjektabl anestezi, ketamin ve Domitor (medetomidine hidroklorür) ya da başka bir alfa-2 agonist kullanılabilir. 75 mg / kg intraperiotneal enjeksiyon uygulanan ketamin, özellikleri, bir rahatlatma minimal akut ağrı ile dissosiyatif anestetik bir ajandırnd DEA lisans ve ayrıntılı ilaç stok gerektiren bir zamanlama III ilaçtır. 1 mg / kg uygulanan Domitor, bir alfa-2 adrenerjik agonist ve kolayca Antisedan (atipamezole hidroklorür) yönetimi ile ters. Domitor kas gevşemesi ve ağrının sağlayan bir yatıştırıcı. Domitor ve ketamin steril tekniği kullanarak PBS kombinasyon önceden hazırlanmış olabilir. Antisedan Domitor için geri ajan, buprenorfin ile birlikte PBS içinde hazırlanan ve post-op 1 mg / kg uygulanmalıdır. Buprenorfin Programı III uyuşturucu ve alternatifler non-steroid anti-enflamatuar banamine (flunixin meglumin) ve Ketoprofen.
Tüm modellerde kemirgenler endometriozis cerrahi indüksiyon ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. En önemlisi kemirgenler bir adet döngüsü ve bu nedenle endometriozis kendiliğinden ortaya çıkmaz. Kemirgen mod yapmak için bir çabaEl bazı araştırmacılar 24,25 dikilmesi gerek kalmadan doğrudan periton boşluğuna syngenic hayvanlardan elde edilen otolog veya homolog, rahim dokusu parçaları enjekte seçen insanlarda durum daha fizyolojik benzer. Farelerde, enjekte edilen doku, kist benzeri endometriotik lezyonlar oluşturur ancak, indüksiyon enjeksiyon yöntemi sıçanlarda doku periton boşluğuna 3 takın ve işgal başarısız olarak çalışmak için görünmüyor .
Kemirgen modeli etyoloji, patoloji, endometriozis 2,8,26-29 risk faktörlerinin yanı sıra yenilikçi tedavilerin 14,30-34 keşfetmek için yoğun bir çalışma olmuştur . Cerrahi olarak indüklenmiş endometriozis kemirgen modeli, düşük doğurganlık ve doğurganlığını ve değişmiş bir gen ve protein ifade 5,6,35,36 dahil olmak üzere, insanlarda hastalığa pek çok benzerlikler gösteriyor. Nispeten düşük maliyetler ve hazır durumu, cerrahi indu kemirgen modeli ile birlikte ele alındığındaCED endometriozis kadınlarda endometriozis için mükemmel bir model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Chris Kassotis ve bu yazının eleştiri Audrey Bailey ve Dr. Scott Korte, Joseph Beeman, Alison Curfman, Paul Kimball, Bridget Neibreggue, Jacob Redel, Amy Schroder Maija Steinberg, ve Stacey Winkeler optimizasyonu onların yardım için özel bir teşekkür Laboratuvarımızda bu modelin. Finansman Klinik Biodetectives Eğitim Grant (NIH T90) (KEP), Missouri Yaşam Bilimleri Üniversitesi Lisans Araştırma Olanakları Programı, MU Araştırma Konseyi, MU Araştırma Kurulu hibe ve NIH R21HD056441 (SCN) tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R.
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C.
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N.
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
