Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mus Modell av kirurgisk indusert Endometriose av Auto-transplantasjon av livmor Tissue

Published: January 6, 2012 doi: 10.3791/3396
Automatic Translation
1, 2, 1
1Obstetrics, Gynecology and Women’s Health and Division of Biological Sciences, University of Missouri, 2Obstetrics, Gynecology and Women’s Health and Animal Sciences, University of Missouri

Summary

En beskrivelse av kirurgisk induksjon av endometriose hos mus og rotter ved auto-transplantasjon av livmor vev til arteriell kaskade av intestinal mesenteriet.

Abstract

Endometriose er en kronisk, smertefull sykdom hvis etiologi er ukjent. Videre kan behandling av endometriose krever laparoskopisk fjerning av lesjoner, og / eller kronisk farmasøytisk behandling av smerter og infertilitet symptomer. Kostnaden forbundet med endometriose har vært anslått til 22 milliarder dollar per år i USA 1. For ytterligere vår forståelse av mekanismene bak denne gåtefulle sykdommen har dyremodeller vært ansatt. Primater spontant utvikler endometriose og derfor primate modeller mest ligner sykdommen hos kvinner. Rodent modeller, derimot, er mer kostnadseffektiv og lett tilgjengelig 2. Den modellen som vi beskriver her innebærer en autolog overføring av livmor vev til intestinal mesenteriet (figur 1) og ble først utviklet i rotte 3 og senere overført til musen fire. Målet med autolog gnager modell av kirurgisk indusert endometriose er å etterlignesykdommen hos kvinner. Vi og andre har tidligere vist at endret genuttrykk mønsteret observert i endometriotic lesjoner fra mus eller rotter speil som ble observert hos kvinner med sykdommen 5,6. En fordel med å utføre operasjonen i musen er at overflod av transgene mus stammer tilgjengelig kan hjelpe forskerne med å bestemme hvilken rolle spesifikke komponenter viktig i etablering og vekst av endometriose. En alternativ modell der excised menneskelige endometrial fragmenter blir introdusert til peritoneum av immunsupprimerte mus er også mye brukt, men er begrenset av mangelen på et normalt immunforsvar som antas å være viktig i endometriose 2,7. Viktigere er det mus modell av kirurgisk indusert Endometriose en allsidig modell som har blitt brukt til å studere hvordan immunsystemet 8, hormoner 9,10 og miljøfaktorer 11,12 påvirke endometriose samt effekten av endometriose på Fertility 13 og smerte 14.

Protocol

1. Planlegging for live-dyr kirurgi

  1. Sørge for at nødvendige godkjenning er mottatt til å arbeide med forsøksdyr.
  2. Order mus og la minst en ukes akklimatisering til sitt nye miljø.
  3. Hunnmus ligger i mangel av eksponering for mannlige feromoner kan stoppe sykling, referert et fenomen til som Whitten effekten 15,16. For å holde mus sykling overføre urin-gjennomvåt mannlige sengetøy til den kvinnelige buret hver fem dager. Alternativt, hvis åpen topp bur brukes, plasser den kvinnelige buret mellom to bur med hanner for å holde kvinner sykler regelmessig.
  4. Kontroller at mus er sykling ved å analysere vaginal cytologi daglig i minst en uke før operasjonen (Tabell 1) 17.
    1. Bruk en voks blyant for å lage åtte partisjoner på en glass-slide slik at vaginal utstryk fra flere mus kan samles.
    2. Skyll skjeden med 0.2 til 0.25 mL vanlig saltvann eller destillert vann ved hjelp av en pipette. Være eure å plassere pipetteverktøyet like ved vaginal åpningen, som cervical stimulering med pipetteverktøyet kan forårsake pseudopregnancy. Plasser vaginal lavage på glass-slide for analyse av celletyper. Lysbilder kan lese ferske (våt) eller alternativt løst av en rekke metoder og undersøkt ved hjelp av en standard lysmikroskop 17.
  5. Samle, rengjøre og sterilisere alt nødvendig kirurgisk utstyr for en vellykket aseptisk kirurgi (se Material avsnitt) 18.
  6. Forbered buprenorfin løsning for analgesi i PBS bruke steril teknikk til å levere 0,2 mg / kg siste dose. Konsentrasjonen av buprenorfin løsningen skal være 0,0333 mg / ml forutsatt at gjennomsnittlig voksen C57BL / 6 mus veier ca 0.025 kg og en subkutan injeksjon volum på 0,15 ml per mus. Buprenorfin kan tilberedes på forhånd og lagret som alikvoter. Merk at buprenorfin er et Schedule III kontrollert stoff som krever en DEA lisens og detaljert oversikt log.
  7. Forbered sterile PBS med penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 mikrogram / ml).
  8. Synkroniser estrus sykluser ved å overføre urin-gjennomvåt mannlige sengetøy til den kvinnelige burene 72 timer før induksjon 15.

2. Forbered kirurgiske området for levende dyr kirurgi

  1. Forbered kirurgiske området som tidligere beskrevet 18 år.
  2. Klargjør utarbeidelse området ved å sette ut elektriske klippere, ophthalmic salve, og kirurgiske scrubs.
  3. Forbered kirurgiske området ved å plassere et resirkuleringsanlegg varmtvann pad på den kirurgiske området for å opprettholde kroppstemperaturen gjennom hele operasjonen. Plasser et sterilt vanntett pute over resirkulere varmtvann pad. Ordne kirurgiske instrumenter, sutur, sterile glass petriskål, biopsi punch, sterilt gasbind, sår klipp og sår klipp applikator på sterile kirurgiske feltet.
  4. Forbered utvinning område ved å plassere resirkulere varmtvann pads halvveis under et tomt bur å la mus å bevege seg bort fra varmen hvis ønskelig.

3. Anesthetize og forberede musen for kirurgi

  1. Record vekten av musen og bestemme estrus scenen ved å evaluere vaginal cytologi.
  2. For induksjon av anestesi, plassere musen i en tom anestesi kammer (tomt bur med solid lokk som inneholder portal for isofluran). Slå på isofluran non-gjeninnånding bedøvelse system og sett vaporizer til 4% isofluran (med oksygen strømningshastighet på 0,5 til 1 L / min).
  3. Når musen er under narkose bytte isofluran strømme til en kjegle (30-60 ml sprøyte kappe) og plasser mus nese og munn i membranen om tilberedning bordet. Tilstrekkelig anestesi kan opprettholdes med en lavere konsentrasjon av isofluran hele resten av kirurgi (~ 2.5 til 3.5% isofluran). Tilstrekkelig dybde av anestesi bør bestemmes av en negativ respons til tå klype stimulus.
  4. Påfør ophthalmica salve to unngå uttørking av øynene under operasjonen.
  5. Ved hjelp av små elektriske klippere, barbere kirurgi nettstedet.
  6. Desinfisere og forberede operasjonen området med tre vekslende swipes av klorheksidin skrubbe og 70% etanol.
  7. Drapere dyr med en steril felt.

Fire. Livmor ligation

  1. Lag en liten (~ 1 cm) midtlinjen snitt ved hjelp av enten liten saks eller en skalpell blad endte 0,5 til 1,0 cm rostral til skjedeåpningen.
  2. Sett stengt saks inn i åpningen slik at bladene er mellom kroppen veggen og bukveggen. Forsiktig sløv dissekere området rundt snittet ved sakte å åpne og lukke den saks slik at bukveggen er tilstrekkelig løsrevet fra huden. Gjenværende synlig sammenvoksninger mellom bukveggen og huden rundt snittet området kan bli nøye klippet. Unnlatelse av å tilstrekkelig sløv dissekere innsnitt området vil gjøre lukke bukveggen vanskeligere.
  3. Ved hjelp av små forceps, forsiktig finn venstre livmor horn. Livmoren er dorsal til tarmen, som er det du vil se ved første inn i innsnitt området. I noen tilfeller er det lettest å først finne eggstokken og tilhørende eggstokkreft fett pad. Trekk forsiktig opp på livmor horn og skyver en åpen pinsett under den for å tjene som en retractor. Hvis ønskelig, merk deg utseendet på eggstokkene og livmoren på dette tidspunktet for ytterligere informasjon om estrus scenen på induksjon (tabell 1).
  4. Skyv to 6-8 cm stykker av 5-0 sort flettet silke sutur (uten nål) under strukket livmor horn.
  5. Trygt ligate hornet på utero-tubual krysset (bare caudal til egglederen) og ved utero-cervical krysset (bare rostral til livmorhalsen) med en firkantet knute på hvert sted. La endene av sutur for øyeblikket.
  6. Skjær ut den delen av livmor horn mellom de to ligations og plasser vev i et sterilt glass petriskål Containing ~ 100 mL PBS som inneholder penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 mikrogram / ml). Skjær endene av silke sutur siste. Hvis suture løsner eller det er blødning, finne stubben og knyt en knute.

5. Forbered endometriotic implantater fra excised livmor

  1. Mens excised livmor blir manipulert, dekke magen med sterilt gasbind og vedlikeholde hydrering med sterile PBS som inneholder penicillin og streptomycin etter behov.
  2. Strip det excised livmor horn av fett.
  3. Hvis ønskelig, veie excised livmor horn.
  4. Åpne livmor horn ved å stikke en kniv av små sakser (14 mm bladlengde) inn i lumen og forsiktig skyve saksen ned livmor horn mens du holder hornet med tang.
  5. I glasset petriskål, bruk en 2 mm biopsi punch å kutte ut tre like store implantater.

Seks. Suturering endometriotic implantater i bukhulen

  1. Plasser sterile gasbind rett over snittet nettstedet og grundig våt med sterile PBS som inneholder penicillin og streptomycin.
  2. Med små, glatte tang forsiktig finne cecum og flytte rostrally langs tynntarmen. Trekk ut en liten (4-5 cm) delen av tarmen som er minst to arterier unna cecum og ordne det som en vifte på den pre-våte gasbind slik at arteriell kaskade av intestinal mesenteriet er klart synlig. Sørg for å holde tarmen fuktig hele tiden med sterilt saltvann. Merk: Ikke bruk rotte-toothed tang mens håndtering tarmen.
  3. Bruk 6-0 svart ethilon sutur med en P-1, 11 mm, 3 / 8 sirkel, reverse kutte nål forsiktig suture ett implantat i en arterie på ca 0,5 cm fra tarmen.
  4. Merk: intestinal mesenteriet er dekket av et tynt lag av peritoneum. Vær forsiktig med å lage en ren passerer dette laget mens suturing rundt arterien. Trekk sutur gjennom sakte og forsiktig for ikke å rive peritoneum eller rupturarterien.
  5. Fullføre to knop på ett kast hver, være forsiktig for ikke å stramme suture svært hardt, ettersom dette kan føre til tap av blodstrøm og påfølgende nekrose av tarmen og død. Trim suture innen 2 mm av implantatet. Våt tarmen igjen for å fortsette å opprettholde hydrering før du går videre til neste implantatet.
  6. Beveger seg i en rostral retning, trekk ut de neste 3-4 cm av tarmen og forsiktig erstatte den delen som allerede inneholder et implantat. Hopp over en eller to arterier fra forrige implantasjonsstedet og sutur neste implantatet. Gjenta for tredje implantat.
  7. Erstatt alle av tarmen i bukhulen.

7. Sham surgeries

  1. Sham surgeries utføres med samme fremgangsmåte som endometriose surgeries bortsett fra at ingen vev er sutureres til intestinal mesenteriet.
  2. Avgiftsdirektoratet venstre livmor horn som i trinn fire.
  3. Endometriotic implantater (trinn 5) er ikke forberedt på humbug kirurgi. Detexcised livmor horn kan kastes eller brukes til andre formål hvis ønskelig.
  4. Sting, men ingen vev, er plassert rundt tre arterier i den arterielle kaskade av intestinal mesenteriet som i trinn 6..

8. Lukke operasjonssåret

  1. Sørg for at alle organer er omtrent tilbake til anatomisk posisjon.
  2. Bruk 5-0 belagt vicryl sutur i en ikke-interlocking kontinuerlig sting for å lukke bukveggen.
  3. Bruk 9 mm sår klipp for å lukke huden.

9. Recover dyr

  1. Administrer 0,33 mg / ml buprenorfin på 0,15 ml/25 g mus via subkutan injeksjon for en dose på 0,2 mg / kg. Buprenorfin gis postoperativt for å hindre ytterligere kardiovaskulær / respiratorisk depresjon som kan forlenge gjenopprettingsprosessen.
  2. Forsiktig tørr musen med kimwipes eller tørkepapir hvis den er blitt våt under operasjonen.
  3. Plasser dyret ventral side ned i buret partially på toppen av en resirkulere oppvarmet vann pad inntil dyret er gjenfunnet og har fått tilbake sternale recumbency (innen fem minutter som inhalant bedøvelsen raskt wears off).

10. Postoperativ behandling

  1. Mus bør observeres hvert 15. minutt til de er i stand til å opprettholde sternale recumbency, deretter hver time inntil de gjenvinne sin normale oppførsel etter operasjonen.
  2. Mus skal vises normalt innen 24 timer etter kirurgi. Mus bør overvåkes daglig i sju til ti dager for tegn på bedring og god helse.
    1. Indikasjoner på at et dyr er i dårlig helse, smerte eller ubehag inkluderer redusert aktivitet, selvskading og spiseforstyrrelser, ungroomed utseende, eller krum holdning.
    2. Dersom et dyr ikke synes å være i god helse innen 24 timer etter kirurgi, enten administrere buprenorfin (0,2 mg / kg) eller avlive dyret. Dersom dyret ikke blir bedre innen 8 timer supplerende buprenorfin administrasjonen dyret should skal avlives så tarmen nekrose er sannsynlig.
  3. Fjern sår klipp 7-10 dager etter induksjon.
  4. Fortsett å overvåke estrus syklisitet ved undersøkelse av vaginal cytologi for varigheten av forsøket. Synkroniser estrus sykluser 72 timer før innsamlingen ved å overføre urin-gjennomvåt mannlige sengetøy til den kvinnelige bur som beskrevet i trinn 1.3.

11. Obduksjon og vev excision

  1. Tidspunktet for obduksjon er avhengig av den aktuelle problemstilling, og er nærmere omtalt i representative resultater og diskusjon.
  2. Avlive musen ved karbondioksid kvelning.
  3. Samle blod av hjertestans punktere hjelp av en 23 gauge nål på et 1cc sprøyte (hvis ønskelig).
  4. Samle en vaginal cytologi smear som beskrevet ovenfor for å bestemme estrus scenen på tidspunktet for innsamling 17.
  5. Skjær resten av livmor horn på utero-tubal junction og på livmorhalsen, fjerner fett, veier, og prosessen somønsket (se 11.14 og 11.15).
  6. Finn svarte sting rundt endometriotic lesjoner. Foto intakt endometriotic lesjoner hvis ønskelig.
  7. Forsiktig dissekere sammenvoksninger rundt endometriotic lesjoner med en liten saks og pinsett, være forsiktig med å lanse lesjoner. Arbeid raskt og forsiktig for å hindre RNA degradering.
  8. Mål og registrere lengden og bredden på endometriotic lesjoner med calipers.
  9. Avgiftsdirektoratet den endometriotic lesjoner og legg på et papir håndkle fuktet med PBS. Fjern eventuelle ikke-endometriotic vev fra lesjoner. En dissecting mikroskop eller forstørrelsesglass stand kan brukes til hjelp i disseksjon.
  10. Vei de tre væskefylte endometriotic lesjoner før fjerning av sutur.
  11. Fjern forsiktig sutur fra endometriotic lesjoner.
  12. For histologi, formalin fikse en væskefylte endometriotic lesjon i to timer etterfulgt av tre tretti minutters PBS vasker og endelig lagring in 70% etanol. Dehydrere og parafin embed.
  13. Lance to av endometriotic lesjoner. Vei disse igjen. Siden sykliske hormonelle endringer kan endre mengden av cyste væske, gir dette et mål på vev våt vekt i tillegg til vekten av cyste pluss væsken målt i 11.10.
  14. For RNA isolering og genekspresjon studier, straks homogenisere en av de stukket hull endometriotic lesjoner (eller ~ 20 mikrogram livmor vev) i lysis bindende løsning og oppbevar ved -80 ° C for fremtiden RNA isolering med RNAqueous kit (Ambion) eller en annen metode som ønsket.
  15. For fremtidig isolering av RNA, DNA eller protein, umiddelbart snap-fryse andre stukket hull endometriotic lesjon (eller ~ 20 mikrogram livmor vev) i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C.

Representant Resultater

Endometriotic lesjoner i mus modell av kirurgisk indusert endometriose morfologisk og histologisk ligner de som ble observert ikvinner. Histologisk analyse av endometriose i både kvinner og mus modell indikerer at endometriotic lesjoner inneholder endometrial kjertler og stroma (Figur 2A). Endometriotic lesjoner hos mus også inneholde hemosiderin-laden makrofager, som er et vanlig kjennetegn på endometriose hos kvinner (figur 2B) 19.

Endometriotic lesjoner fjernet fra mus tre dager etter induksjon vises betent og hemoragisk (figur 3A). Etter to til fire uker med vekst endometriotic lesjonene i mus modell er cyste-aktig, væskefylte og omgitt av peritoneal sammenvoksninger (figur 3B og 3C). Sammenlignet med lesjon vekt på induksjon, ble væskefylte lesjoner 306% og 862% større på ett og to måneder etter induksjon og stakk hull lesjoner var 51% og 172% større, henholdsvis (figur 4A og 4B). Vi har fått konsekvent væskefylte og stakk hull endometriotic lesjonen vekter på én måned etter induksjon over fem ulike eksperimenter (figur 5). På en måned etter iduksjon væskefylte (7.44 ± 3.75 mg) og stakk hull (2.92 ± 1.23 mg) endometriotic lesjon vekten var signifikant korrelert (Pearsons korrelasjonskoeffisient = 0,669, p <0,001).

Age of musen ikke påvirke lesjon størrelse for mus mellom tre og ti måneders alder. Verken væskefylte eller stukket hull endometriotic lesjon vekt på en måned etter induksjon var signifikant korrelert med alder på dyret (r = -0,136, p = 0,380 og r = -0,063, p = 0,698, henholdsvis).

Musen Livmoren gjennomgår endringer i størrelse, væskeretensjon, celleproliferasjon og utseende på grunn av innflytelsen av steroidhormoner under estrus syklus. Vi sammenlignet endometriotic lesjonen vekten til vekten av de resterende intakt livmor horn fra dyr i ulike estrus stadier. Vi fant ikke en signifikant sammenheng mellom livmor vekt og væskefylte eller stukket hull endometriotic lesion vekt på én måned etter induksjon (r = -0,046, p = 0,765 og r = 0,232, p = 0,155, henholdsvis).

Den genuttrykk mønsteret observert i endometriotic lesjoner av mus speil nært det som er rapportert hos kvinner med sykdommen 5. Ved tre dager etter induksjon gener som regulerer ekstracellulær matrix remodeling, celle adhesjon, og angiogenese er svært oppregulert og mange av disse genene forbli oppregulert gjennom en måned med vekst.

Figurer og tabeller

Figur 1
Figur 1. Kirurgisk induksjon av endometriose ved autologus livmor vev overføring i musen. Den venstre livmor horn er ligated, excised, og åpnet lengderetningen for å avsløre endometrium. Tre 2 mm 2 biopsi er forberedt og hver er sys til en arterie i den arterielle kaskade av intestinal mesentery. Ved en måned etter induksjon av endometriotic lesjoner er væskefylte og omgitt av adhesjon.

Figur 2
Figur 2 Hematoxylin og eosin fargede delen av en endometrial lesjon fra mus modell av endometriose i en måned etter induksjon demonstrerer (A) tilstedeværelse av endometrial kjertler og stroma;. Skala bar = 50 mikrometer og (B) hemosiderin-laden makrofager, noen som er markert med piler; skala bar = 20 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Endometriotic lesjoner i mus modell følgende dødshjelp, enten tre dager etter induksjon (A) eller en måned etter induksjon (B og C).

Figur 4
Figur 4. Endometriotic lesjoner fra mus kirurgisk indusert å ha endometriosis var excised og veide på ett eller to måneder etter induksjon. Data er gjennomsnitt ± SEM. Dataene ble log transformert og ulike bokstaver indikerer betydning innen hvert panel ved enveis ANOVA etterfulgt av ensidig Fishers Least signifikant forskjell Mulitple Sammenligninger. (A) Cyste liker, væskefylte endometriotic lesjoner (N = 10, 7 eller 5 for induksjon, en måned eller to måned etter induksjon, henholdsvis). (B) stukket hull endometriotic lesjoner (N = 10, 8 eller 7 for induksjon, en måned eller to måned etter induksjon henholdsvis).

Figur 5
Figur 5. Endometriotic lesjon våt vekt med væske og stakk hull på en måned etter induksjon fra fem forskjellige eksperimenter. Data er gjennomsnitt ± SEM. Mus N = 10, 6, 8, 7 og 7 for væskefylte lesjoner og 0, 7, 10, 8 og 8 for stukket hull på lesjoner i eksperiment 1, 2, 3, 4 og 5, henholdsvis.

Tabell 1 Tabell 1. Observasjon av Estrus Stage ved vaginal cytologi og utseende av eggstokkene og livmoren og induksjon.
Utseende av eggstokk og livmor vil være tidsavhengig. Følgende er basert på ofre rundt 08:00 på morgenen hver syklus dag. Videre observasjonene er subjektive og sammenligne eggstokk og livmor horn vil bli en bedre estimat enn livmor horn bare. Disse observasjonene er ment å supplere informasjon innhentet fra daglig vaginal cytologi avlesninger.

Tabell 2
Tabell 2. Sammenligning av kirurgi i mus og rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere kritiske parametre som bør bemerkes mens du utfører kirurgisk induksjon av endometriose hos mus. Først er endometriose en østrogenavhengige sykdom og som sådan denne operasjonen skal utføres i intakt dyr eller alternativt i ovariectomized dyr supplert med østrogener 20. For det andre må suturering endometrial biopsier til arterielle cascade utføres med ekstrem varsomhet. Vi har funnet ut at å bruke bare to relativt løse knuter med ett kast hver holder biopsi på plass mens hindre ligation av blodforsyning til tarmen og påfølgende vevsnekrose og dyr død. Vi anbefaler sterkt å øve på flere mus før selve forsøket til at suturene er plassert sikkert nok til at vevet ikke er tapt, men ikke for stramt som å forårsake tarmen nekrose. Det tredje er det svært viktig å holde tarmen vev hydrert med sterile PBS som inneholder penicillin og streptomycin under eurgery. Fjerde, innsats bør tas for å sikre at endometriotic implantat størrelsen er konsistent. Til denne effekten bruker vi en 2 mm biopsi dor å skape konsekvent størrelse endometriotic implantater fra excised livmor vev.

Det er flere modifikasjoner som kan gjøres for denne protokollen for å dekke individuelle behov og vitenskapelige spørsmål forskeren. En mulig endring gjelder hormonelle profilen av dyret. Gen og protein uttrykk i endometriotic lesjoner, resterende intakt livmor horn og immunforsvaret kan bli direkte påvirket av tidspunktet for samlingen i forhold til estrus syklusen scenen. Det finnes flere tilnærminger til kontroll for estrus scenen på tidspunktet for innsamling, hver med sine egne fordeler og ulemper. For eksempel kan intakt, sykling dyr skal synkroniseres ved å overføre urin-dynket mannlige sengetøy inn i kvinnens buret tre dager før induksjon eller samling slik at dyr er kirurgisk indutet og samles under samme estrus scene 15. Hvis intakt sykling dyr brukes, bør estrus syklisitet overvåkes daglig ved undersøkelse av vaginal cytologi 17. Dette har fordelen av å være mer fysiologisk relevante, men nå syklusen synkronitet er ikke 100% vellykket. Alternativt kan intakt dyr skal synkroniseres med eksogene gonadotropin administrasjon 21,22. Mens noe mer nøyaktig, skaper denne metoden høyere østrogennivå enn normalt. En annen tilnærming har vært å ovariectomize dyr og gi tilbake et konstant nivå av eksogene hormoner, enten gjennom en silastic kapsel, mini-osmotisk pumpe, eller daglige injeksjoner 4,8. Denne metoden har fordelen av å få en enhetlig hormon profil på tvers av mange dyr, men er uheldig fordi dyrene ikke er sykling.

Sham operasjoner kan utføres for å vurdere hvilke effekter er resultatet av gjennomgår kirurgi versus effektene attributable til endometriose. I sham surgeries venstre livmor horn er fjernet og suturene er plassert rundt arteriene i den arterielle kaskade av intestinal mesenteriet men ingen endometriotic implantater er sutureres 5,8,23. Alternativt kan fett fjernes fra excised livmor horn være sutureres til intestinal mesenteriet 3,14. Vi har nylig rapportert at det er relativt få forskjeller i genuttrykk målt ved cDNA microarray mellom forloren livmor og det intakte gjenværende livmor horn fra dyr kirurgisk indusert å ha endometriose 5. Videre bruk av kvantitativ real-time PCR for sju endometriose-relaterte gener, fant vi at bare haptoglobin uttrykket var signifikant forskjellig i Livmorframfall av forloren og endometriose mus. Lee et al. rapporterte imidlertid differensial uttrykk av fem gener i livmoren fra mus overtalt til å ha endometriose sammenlignet med humbug kontroller 23. Dette tyder på at tilstedeværelsen av endometriotic lesions kan føre til endret genuttrykk i eutopic livmor.

Tidspunktet for samlingen av mus kirurgisk indusert å ha endometriose bør bestemmes av den aktuelle problemstillingen. Innsamling av mus tre dager etter induksjon gjør det mulig å vurdere de kritiske, tidlige hendelser i etableringen av endometriose inkludert innledende nøytrofile granulocytter og machrophage infiltrasjon og cytokin produksjon som har vært rapportert tidligere åtte. Vi har vist at endometriotic lesjoner samlet tre dager etter induksjon er små, hemorraghic, og har betydelig endret genuttrykk i forhold til de resterende livmor horn fire. Ved to uker etter induksjon endometriotic lesjoner er godt etablert og har ofte dannet cyste-lignende strukturer. I mus, endometriotic lesjoner fortsette å øke i størrelse, som vurdert av vekten av væskefylte og stakk hull lesjoner (figur 4) samt av lesjon volum bestemmes av lengde, bredde og height målinger gjennom to måneder etter induksjon 9.

Som nevnt ovenfor, ble kirurgisk modell av endometriose først utviklet i rotte og er fortsatt mye brukt 3. Når du utfører denne operasjonen i rotte vi gjøre følgende endringer til protokollen, som oppsummert i Tabell 2.. I rotter, alle sting brukes er 4-0 størrelse og kan og bør knyttes tettere. I tillegg sutur vi seks 5 mm 2 endometriotic implantater i intestinal mesenteriet av bukhulen.

I denne protokollen beskriver vi bruk av en inhalert bedøvelse, isofluran. Alternativt, kombinert injiserbare bedøvelse sammensatt av ketamin og Domitor (medetomidin hydroklorid) eller en annen alfa-2 agonist kan brukes, selv om utvinning tid er noe lengre. Ketamin, administrert ved 75 mg / kg ved intraperiotneal injeksjon, er en dissosiativ anestesimiddel med minimal akutte smertestillende egenskaper ennd er et Schedule III stoff som krever en DEA lisens og detaljert narkotika inventar. Domitor, administreres på 1 mg / kg, er en alfa-2-adrenerg agonist og er lett reverseres med Antisedan (atipamezol hydroklorid) administrasjon. Domitor er et beroligende middel som gir muskel avslapning og smertelindring. Domitor og ketamin kan tilberedes på forhånd i kombinasjon i PBS med steril teknikk. Antisedan, den reversering agent for Domitor, kan tilberedes på PBS i kombinasjon med buprenorfin og bør administreres på 1 mg / kg postoperativt. Buprenorfin er også et Schedule III stoff og alternativer inkluderer ikke-steroide anti-inflammatoriske banamine (flunixin meglumine) og ketoprofen.

Som med alle modellene er det visse begrensninger knyttet til kirurgisk induksjon av endometriose i gnagere. Fremst er at gnagere ikke har en menstruasjonssyklus og derfor ikke spontant utvikler endometriose. I et forsøk på å gjøre gnager model mer fysiologisk lik tilstanden hos mennesker noen forskere har valgt å injisere autologe eller homologe livmor vev fragmenter fra syngenic dyr inn i bukhulen direkte uten suturing 24,25. Hos mus, danner injisert vev cyste-aktig endometriotic lesjoner, derimot, gjør injeksjon metode for induksjon ikke synes å fungere i rotter som vevet ikke klarer å feste og invadere i bukhulen 3.

Den gnager modellen har vært mye brukt til å studere etiologi, patologi, og risikofaktorer for endometriose 2,8,26-29 samt å utforske romanen legemiddelselskap 14,30-34. Den gnager modell av kirurgisk indusert endometriose viser mange likheter med sykdom hos mennesker, blant annet redusert fruktbarhet og fruktbarhet og endret gen og protein uttrykk 5,6,35,36. Tatt sammen med sin relativt lave kostnader og klar tilgjengelighet, det gnager modell av kirurgisk induced endometriose er en utmerket modell for endometriose hos kvinner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Spesiell takk til Chris Kassotis og Audrey Bailey for kritisk gjennomgang av dette manuskriptet og til Dr. Scott Korte, Joseph Beeman, Alison Curfman, Paul Kimball, Bridget Neibreggue, Jacob Redel, Amy Schroder, Maija Steinberg, og Stacey Winkeler for deres assistanse i optimering av denne modellen i vårt laboratorium. Finansieringen ble gitt av Clinical Biodetectives Training Grant (NIH T90) (KEP), University of Missouri biovitenskap Undergraduate Forskning Opportunities Program, MU Forskningsrådet, MU Forskning Board tilskudd og NIH R21HD056441 (SCN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax pencil Fisher Scientific NC9954135
Glass slide Fisher Scientific 12-550-433
Eyedropper Fisher Scientific S79383
Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears
Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml Butler Animal Health Supply 022891
Sterile phosphate buffered saline (PBS) GIBCO, by Life Technologies 14040-117
10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl Hyclone SV30010
Isoflurane Abbott Laboratories 05260-05
Isoflurane non-rebreathing anesthetic system
Recirculating hot water heating pad
30 ml syringe sheath Fisher Scientific 14-823-16G
Powder free sterile gloves Fisher Scientific 19020558
Ophthalmic ointment Major Pharmaceuticals 10033691
Small electrical clippers Wahl Clipper Corp. 9861-600
Chlorhexidine scrub Fisher Scientific NC9863042
70% Ethanol
Polylined sterile field Busse Hospital Disposables 696
Size 3 scalpel Fisher Scientific 22-079-657
Number 10 scalpel blades Fisher Scientific 22-079-681
Small surgical scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5850
Small serrated semi-curved forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
5-0 black braided silk suture Ethicon Inc. K870H
Sterilized pyrex glass Petri dishes Corning 70160-101
2 mm biopsy punch Miltex Inc. 33-31
Sterile gauze Kendall 1806
6-0 black monofilament ethilon nylon suture Ethicon Inc. 697G
Needle drivers (optional) World Precision Instruments, Inc. 500023
5-0 undyed braided coated vicryl suture Ethicon Inc. J490G
9mm Autoclip wound clips BD Biosciences 427631
Autoclip applier & remover BD Biosciences 427630
23G needle BD Biosciences 305193
1cc syringe BD Biosciences 301025
5X magnifying glass stand (optional) Fisher Scientific 14-648-23
10% Buffered formalin Fisher Scientific SF100-4
Calipers Roboz Surgical Instruments Co. RS-6466
Processing/embedding cassettes Fisher Scientific 15-197-700A
Biopsy foam pads Fisher Scientific 22-038-222
RNAqueous RNA isolation kit Ambion AM1912
Liquid nitrogen
Snap cap microcentrifuge flat top tube Fisher Scientific 02-681-240
Ketamine (optional) Sigma-Aldrich K4138
Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) Tocris Bioscience 2023
Antisedan (atipamezole) (optional) Sigma-Aldrich A9611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
  2. Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Hum. Reprod. Update. 12, 641-649 (2006).
  3. Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
  4. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
  5. Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
  6. Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
  7. Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364, 1789-1799 (2004).
  8. Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
  9. Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
  10. Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
  11. Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
  12. Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
  13. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
  14. Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
  15. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
  16. Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
  17. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
  18. Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
  19. Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
  20. Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
  21. Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
  22. Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
  23. Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
  24. Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
  25. Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
  26. Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
  27. Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
  28. Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
  29. Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
  30. Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
  31. Dmitrieva, N. Endocannabinoid involvement in endometriosis. Pain. 151, 703-710 (2010).
  32. Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
  33. Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
  34. Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
  35. Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
  36. Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).

Tags

Medisin mus rotte endometriose kirurgi livmor ektopisk endometriotic lesjon
Mus Modell av kirurgisk indusert Endometriose av Auto-transplantasjon av livmor Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L.,… More

Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue. J. Vis. Exp. (59), e3396, doi:10.3791/3396 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter