Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Summary

O objetivo deste artigo é descrever o uso de um modelo de glioblastoma ortotópico para estudos quimioradioterapia. Este artigo irá passar por transformação celular, implantação, e radioterapia do mouse através de um modelo intracraniana.

Abstract

O glioblastoma multiforme (GBM) são os mais comuns e agressivos adultos tumores cerebrais primários ^1. Em anos recentes, tem havido um progresso substancial na compreensão dos mecanismos de invasão do tumor, e inoculação intracerebral directa de tumor proporciona a oportunidade de se observar o processo invasivo em um ambiente apropriado fisiologicamente ^2. No que diz respeito tumores cerebrais humanos estão em causa, os modelos ortotópicos actualmente disponíveis são estabelecidas, quer por injecção estereotáxica de suspensões de células ou implantação de um pedaço sólido de tumor através de um procedimento complicado craniotomia ^3. Na nossa técnica que colher células de cultura de tecidos para criar uma suspensão de células usadas para implante directamente para o cérebro. A duração da cirurgia é aproximadamente 30 minutos, e como o rato precisa de ser constante num plano cirúrgico, um anestésico injectável é usado. O rato é colocado em um jig estereotáxico feita por Stoetling (figura 1). À réer a área cirúrgica é limpo e preparado, é feita uma incisão; eo bregma está localizado para determinar a localização do craniotomia. A localização do craniotomia é de 2 mm para a direita e 1 mm rostral à bregma. A profundidade é de 3 mm da superfície do crânio, e as células são injectadas a uma taxa de 2 ul a cada 2 minutos. A pele é suturada com 5-0 PDS, e do rato é permitido para acordar em uma almofada de aquecimento. De nossa experiência, dependendo da linha celular, o tratamento pode ter lugar a partir de 7-10 dias após a cirurgia. A entrega da droga depende da composição de droga. Para o tratamento de radiação os ratos são anestesiados e colocados em um feito gabarito. Chumbo cobre o corpo do rato e expõe apenas o cérebro do rato. O estudo de tumorigénese ea avaliação de novas terapias para GBM requerem precisos e reprodutíveis cerebrais modelos animais de tumores. Assim, utilizar este modelo ortotópico cérebro para estudar a interacção do microambiente do cérebro e do tumor, para testar a effectiveness de diferentes agentes terapêuticos, com e sem radiação.

Protocol

I. preparação de células

1. As células são crescidas até à confluência em DMEM com FBS 10% sobre um 80% 225 centímetros confluente ³ balão para cada 5 ratinhos a ser implantadas.
2. Aspirar meios fora das células; lava-se com 10 ml de PBS sem cálcio ou magnésio. Aspirado PBS células fora.
3. Trypsinize células com 3 ml de tripsina, esperar 10-15 min, e neutralizar a tripsina com 15 ml de meio.
4. Pipetar todas as células e meios de comunicação em um cónico de 50 ml. Dois frascos grandes caber em um cónico de 50 ml.
5. Girar as células a 1600 rpm durante 7 minutos a 4 ° C. Aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 ml de PBS frio, e enxaguar células por suavemente pipetando para cima e para baixo. Assegure-se o pellet celular é misturada uniformemente com o PBS. A suspensão deve ser nublado.
6. Neste momento uma contagem de células é feita usando um contador Coulter. As células são novamente centrifugado a 1600 rpm durante 7 minutos a 4 ° C.
7. Após a centrifugação ^nd 2 das células, comopirata todos PBS e ressuspender em 1 ml de PBS.
8. As células são centrifugadas a em 1 ml de PBS a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C. O PBS é aspirado, e PBS é adicionado para ajustar a concentração final de 1x10 ⁶ por 5 uL para U87 células, outras linhas celulares podem exigir um número diferente e concentração de células para o crescimento do tumor óptima.
9. Após o volume final e concentração obtém-se as células são mantidas em gelo em um tubo de Eppendorf.

II. Xenoenxerto

1. Preparando o mouse
   1. Os ratos são anestesiados com uma mistura de injecção de Cetamina / Xilazina / solução salina. A mistura é de 120 mg / kg de cetamina, 16 mg / kg de Rompun e solução salina. Os ratinhos são pesados ​​individualmente e deu 0,1 ml por 10 g com base no seu peso. O anestésico é dado com agulha 26G ligado a uma seringa IP ml. Levará cerca de 15 min para os ratos para chegar a uma fase de sono sem resposta à dor. Você pode verificar a resposta à dor dacamundongos por beliscar a sua pata.
   2. Após o mouse está totalmente anestesiado, pomada é administrado aos seus olhos, para evitar que sequem.
   3. O rato é colocado sobre o leito do estereotáxico com os dentes da frente superiores no entalhe na barra de boca. O leito é então colocado no estereotáxica.
   4. A guarda nariz é colocada sobre o nariz do rato para impedir o movimento da cabeça, e as barras de orelha são suavemente colocar nos canais de orelha dos ratinhos. Tenha cuidado para não fazer qualquer colocação de barra de nariz ou barras de ouvido muito apertados, como o crânio podem fraturar e / ou impedir o mouse de respirar.
   5. Certifique-se que a cabeça do rato é o nível usando as marcas de escala na estereotáxica é útil durante este processo.
   6. Para preparar o álcool de iodo rato, e providine é aplicada liberalmente sobre a cabeça do rato alternada para um total de 3 aplicação de álcool e 3 aplicações de iodo. Uma aplicação final de uma almofada de álcool com 70% é aplicado paraa cabeça.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Todos os instrumentos o procedimento deve ser esterilizado quer por autoclavagem ou embebendo instrumentos em etanol a 70% antes de iniciar o procedimento.
   2. É feita uma incisão no topo do crânio por trás do olho direito diagonalmente de volta para o posterior esquerda do crânio. A incisão deve ser de cerca de 10 mm a 15 mm de comprimento.
   3. Usando um Q-Tip, separar lentamente a incisão para expor o crânio e enxugar a membrana que está entre o crânio ea pele. Use um Q-ponta para apagar qualquer vestígio de sangue e assistir a sangramento excessivo.
   4. Expor o topo do crânio para visualizar a bregma. Utilizando o ponto de seringa Hamilton, posicionar sobre o bregma. A posição correcta do orifício a ser perfurado no crânio é de 2 mm direita e 1 mm anterior da bregma (figura 2). Um marcador cirurgião ponta de feltro, que é comprado estéril, é utilizado para marcar a posição do orifício a ser perfurado. Por favor, note que o buraco está localizado próximo à umalinha de sutura terior.
   5. Em seguida, faça um pequeno furo no crânio, na posição marcada com a ponta de uma agulha 22G em um vaso de pino ou alimentado através de uma agulha de 18G.
   6. Carregar o 10 uL de vidro Hamilton seringa com 5 ul de células. A seringa de Hamilton é 10 ul com um contundente 30G para 33G agulha fixa ligada a ela. Certifique-se de misturar as células antes de carregá-las, seja por pipetagem-los ou usando uma seringa de 1 ml com agulha de 25G conectado. Depois de a seringa Hamilton é carregado, colocá-lo de volta no braço para alinhá-lo com o furo no crânio.
   7. Abaixar a fim bunt da agulha para a superfície do crânio, uma vez que a agulha esteja nivelada com o crânio; baixar a agulha até que seja a uma profundidade de 3 mm abaixo da superfície do crânio.
   8. Depois de a agulha é reduzida, deve permanecer ali durante 2 minutos para evitar qualquer traumatismo grave da agulha que afecta o cérebro. Implantação das células é a uma taxa de 1 uL por minuto para um total de 6-8 minutos, ter o cuidado de qualquer backflow. Após a última das células terem sido implantadas, deixar a agulha no lugar por mais 2 minutos, para permitir todas as células para resolver dentro
   9. Retire a agulha do cérebro, e limpe o buraco com um Q-tip. Continuar a limpar a agulha e seringa com 50% acetona, EtOH a 100%, e de PBS, 3x em cada solução e, nessa ordem.
   10. A pele sobre o crânio está pronto para ser suturado neste ponto. Usando 5-0 PBS fechar a incisão com cerca de 3 pontos.
   11. Permitir o mouse para acordar em uma almofada de calor, e reaplicar pomada, se necessário. O rato pode ser devolvido à gaiola após mostra movimento na sua própria (isto é, Levantando a cabeça ou movendo os ombros).

III. O tratamento do implante IC por radiação e de drogas

1. O tratamento de radiação
   1. Dependendo da linha de células, o tratamento dos ratos pode ter lugar de 5 a 7 dias após o implante. Nosso departamento utiliza uma unidade de radioterapia para tratamento de ortovoltagem radiaçãomento.
   2. Imagiologia, tais como BLI (Imaging bioluminescência), MRI ou CT pode ser usado para visualizar o tumor antes da randomização (figura 3A).
   3. Os ratos são anestesiados com o cocktail de Cetamina / Xilazina / solução salina como antes, e pomada oftálmica é aplicado aos seus olhos.
   4. Os ratinhos são posicionados em um jig radiação feitos que está configurado como uma roda de pizza, em que as cabeças dos ratinhos apontar em direcção ao centro. Os corpos dos ratos são protegidos da radiação com chumbo.
   5. O tratamento medicamentoso pode ser dado antes ou radiação através de rotas de entrega diferentes, SQ ou seja, IP e IV.

IV. Resultados

O rato deve acordar o procedimento dentro de 45-60 minutos após a injeção de anestesia. Se o mouse tem dificuldade de acordar após o procedimento e tempo ultrapassou 1 ½ horas após o procedimento, o mouse pode não recuperar e eutanásia pode ser uma alternativa eficaz. Se there é sangramento excessivo ou o crânio rachado torna-se a qualquer momento durante o procedimento de eutanásia é aconselhada. Se tudo correr bem e, dependendo da linha celular, um tumor deve começar a formar dentro de 2-4 semanas após o procedimento tem lugar. Ao usar modelos xenograft intracranianos, a eficácia terapêutica é geralmente medido como a sobrevivência ^{pós-implantação-5.} No entanto, como este é um modelo IC sinais e sintomas ocorrerá antes da morte. Alguns dos sinais físicos do mouse podem apresentar são uma postura arqueada, a perda de peso e inatividade. Alguns dos sinais neurológicos podem ser convulsões, incline a cabeça e perda de equilíbrio. A Figura 3B mostra uma mancha de HE um tumor em mortalidade. Um diagrama de Kaplan-Meier é usado para avaliar os dados (Figura 4). O número de dias de sobrevivência de 50% são calculados e comparados com o controle. Se o grupo de combinação viveram mais do que a adição da radiação indivíduo e os braços de drogas a combinação é foi bem sucedida.

Figura 1. O equipamento Stoelting estereotáxica.

Figura 2. Um diagrama da localização do furo de perfurador no crânio do rato.

Figura 3A. BLI imagem após a implantação do GBM.

Figura 3B. H e E do tumor GBM a mortalidade.

Figura 4. Resultados de U87 implantes IC injetados com inibidor de PARP 7 pós-cirurgia dias.

Discussion

Gliomas malignos, como o glioblastoma multiforme, representam os mais comuns tumores cerebrais primários e têm um prognóstico sombrio ^4. Sobrevida de pacientes afetados por GBM permaneceu praticamente inalterada durante a última década (isto é, 9-12 meses após o diagnóstico), apesar dos avanços em cirurgia, radioterapia e quimioterapia ^5. As características de um modelo adequado para o estudo do tratamento glioma deve incluir uma localização do tumor reprodutível e crescimento das células como um tumor relativamente discreto; as células deve ser semelhante, tanto quanto possível as características histológicas de gliomas humanos, deve haver um crescimento previsível taxa do tumor, a capacidade de crescer do tumor em cultura de tecidos e do modelo deve estar em um pequeno animal para reduzir a despesa ^6. Os tratamentos eficazes dependem de modelos experimentais que se assemelham características GBM humanos para testar a nova terapia e fornecendo uma compreensão exata da base molecular de widespread invasão glioma ^7. As investigações sobre a biologia dos tumores cerebrais foram também utilizados rotineiramente linhas de células cultivadas ou mantidas in vitro para ganhar informação ^8. A inibição da invasão tumoral e angiogénese é um dos principais objectivos no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra gliomas malignos ^9. As opções limitadas tratamentos para glioblastoma ter levado uma busca intensiva para as lesões genéticas subjacentes a este cancro mortal, com o objectivo o desenvolvimento de terapias mais racionais e mais eficazes ^10.